本發(fā)明屬于生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種家蠶漿細(xì)胞特異性分子標(biāo)記鑒定方法。

背景技術(shù)：

家蠶是一種重要經(jīng)濟(jì)昆蟲，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，對(duì)提高人類生存質(zhì)量做出了積極的貢獻(xiàn)。在上下五千年的悠久文明歷史中，絲綢之路和絲綢文化是一塊絢麗的文化瑰寶，也是中國(guó)古老文明的象征。時(shí)至今日，在當(dāng)前農(nóng)村經(jīng)濟(jì)中，蠶絲產(chǎn)業(yè)仍然是部分農(nóng)村地區(qū)的支柱產(chǎn)業(yè)之一。蠶病一直是嚴(yán)重影響蠶絲產(chǎn)業(yè)的重要因素，每年因蠶病帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失約占整個(gè)產(chǎn)業(yè)的20％，而且沒(méi)有有效的預(yù)防措施。因此，研究家蠶免疫防御機(jī)制，解析宿主對(duì)病原菌的免疫應(yīng)答反應(yīng)，最終能夠有效防御蠶病的發(fā)生是蠶桑研究人員重要的工作內(nèi)容之一。昆蟲屬開放式循環(huán)系統(tǒng)，整個(gè)體腔都浸浴在血淋巴中，血淋巴起著運(yùn)輸養(yǎng)料、激素和代謝廢物，維持正常生理所需的血壓、滲透壓和離子平衡，參與中間代謝，清除解離的組織碎片，修補(bǔ)傷口，對(duì)侵染物產(chǎn)生免疫反應(yīng)和調(diào)節(jié)體溫等諸多功能。在血淋巴中，血細(xì)胞是細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)的主要執(zhí)行者，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。根據(jù)形態(tài)，昆蟲主要包含五種血細(xì)胞類型：原血細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、漿細(xì)胞、擬絳色細(xì)胞和小球細(xì)胞，它們?cè)诿庖叻磻?yīng)中有著不同的角色分工，共同協(xié)助昆蟲應(yīng)對(duì)來(lái)自體內(nèi)外的各種挑戰(zhàn)。作為一種重要的鱗翅目模式，隨著基因組三部曲的順利完成，轉(zhuǎn)基因和基因編輯技術(shù)的建立與完善，家蠶成為變態(tài)與發(fā)育研究的重要材料之一。家蠶飼養(yǎng)方便，血細(xì)胞含量豐富，與果蠅相比具有更好的操作性，是造血及血細(xì)胞功能研究的重要介質(zhì)之一。更為重要的是，鱗翅目昆蟲約占據(jù)農(nóng)林害蟲的70％，研究家蠶造血與其調(diào)控機(jī)制，探究血細(xì)胞的功能，也可以為鱗翅目病蟲害的防治提供新的策略?，F(xiàn)階段家蠶血細(xì)胞分類主要依據(jù)形態(tài)學(xué)和化學(xué)染色，雖然傳統(tǒng)的方法簡(jiǎn)單方便和快捷，但是血細(xì)胞形態(tài)多樣，僅僅依靠肉眼觀察有時(shí)很難準(zhǔn)確判斷細(xì)胞類型，此外傳統(tǒng)方法也要研究人員有較為豐富的的鑒定經(jīng)驗(yàn)，都極大地影響了家蠶血細(xì)胞的研究。

綜上所述，現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題是：傳統(tǒng)的方法判斷細(xì)胞類型比較困難，判斷不準(zhǔn)確。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種家蠶漿細(xì)胞特異性分子標(biāo)記鑒定方法。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種家蠶漿細(xì)胞特異性分子標(biāo)記鑒定方法家蠶漿細(xì)胞特異性分子標(biāo)記鑒定方法，所述家蠶漿細(xì)胞特異性分子標(biāo)記鑒定方法包括：

步驟一，通過(guò)對(duì)家蠶細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析，共篩選獲得漿細(xì)胞特異性性表達(dá)的候選基因；

步驟二，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量pcr對(duì)基因在mrna水平上驗(yàn)證，家蠶基因integrinβ2和integrinβ3在漿細(xì)胞里特異性地高表達(dá)；

步驟三，采用家蠶基因integrinβ2和integrinβ3特有的引物序列，經(jīng)過(guò)pcr技術(shù)對(duì)這兩個(gè)基因的序列進(jìn)行克隆擴(kuò)增，并將所得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證；

步驟四，采用家蠶基因integrinβ2和integrinβ3特有的race引物序列，利用race擴(kuò)增技術(shù)獲得其cdna全長(zhǎng)序列；

步驟五，根據(jù)cdna全長(zhǎng)序列，進(jìn)行家蠶基因integrinβ2和integrinβ3的原核表達(dá)及蛋白純化，并制備獲得抗體；

步驟六，利用所獲得integrinβ2和integrinβ3的抗體在家蠶細(xì)胞水平，以及轉(zhuǎn)基因家蠶個(gè)體水平等驗(yàn)證，確定integrinβ2和integrinβ3能特異性地標(biāo)記家蠶循環(huán)血細(xì)胞中的漿細(xì)胞。

進(jìn)一步，所述步驟一中共篩選獲得141個(gè)漿細(xì)胞特異性性表達(dá)的候選基因。

進(jìn)一步，所述步驟三中integrinβ2和integrinβ3特有的引物序列為：seqidno：1和seqidno：2。

進(jìn)一步，所述步驟四中integrinβ2和integrinβ3特有的race引物序列為：seqidno：3和seqidno：4。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及積極效果為：可以準(zhǔn)確判斷細(xì)胞類型；利用轉(zhuǎn)錄組分析，共篩選獲得139個(gè)顆粒細(xì)胞和141個(gè)漿細(xì)胞特異性表達(dá)候選基因。利用熒光定量pcr，對(duì)轉(zhuǎn)錄組結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。其中integrinβ2和integrinβ3高表達(dá)于漿細(xì)胞。隨后，成功鑒定克隆了這些候選基因，經(jīng)原核表達(dá)和蛋白純化獲得相應(yīng)抗原后免疫動(dòng)物制備抗體。免疫熒光結(jié)果表明integrinβ2和integrinβ3能特異標(biāo)記家蠶血液中的漿細(xì)胞。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明實(shí)施提供的家蠶漿細(xì)胞特異性分子標(biāo)記鑒定方法流程圖。

圖2是本發(fā)明實(shí)施提供的引物序列表。

圖3是本發(fā)明實(shí)施提供的主要儀器及設(shè)備表。

圖4是本發(fā)明實(shí)施提供的實(shí)驗(yàn)試劑表。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作詳細(xì)的描述。

如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例提供的家蠶漿細(xì)胞特異性分子標(biāo)記鑒定方法包括以下步驟：

s101：通過(guò)對(duì)家蠶細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析，共篩選獲得141個(gè)漿細(xì)胞特異性性表達(dá)的候選基因；

s102：通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量pcr對(duì)這141個(gè)基因在mrna水平上再一步驗(yàn)證，由此發(fā)現(xiàn)家蠶基因integrinβ2和integrinβ3在漿細(xì)胞里特異性地高表達(dá)；

s103：首次推測(cè)和設(shè)計(jì)了家蠶基因integrinβ2和integrinβ3特有的引物序列(見(jiàn)圖2)，再經(jīng)過(guò)pcr技術(shù)對(duì)這兩個(gè)基因的序列進(jìn)行克隆擴(kuò)增，并將所得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證；

s104：設(shè)計(jì)家蠶基因integrinβ2和integrinβ3特有的race引物序列(見(jiàn)圖2)，利用race擴(kuò)增技術(shù)獲得其cdna全長(zhǎng)序列；

s105：根據(jù)所得的cdna全長(zhǎng)序列，進(jìn)行家蠶基因integrinβ2和integrinβ3的原核表達(dá)及蛋白純化，并制備獲得抗體；

s106：利用所獲得integrinβ2和integrinβ3的抗體在家蠶細(xì)胞水平，以及轉(zhuǎn)基因家蠶個(gè)體水平等驗(yàn)證，最后確定integrinβ2和integrinβ3能特異性地標(biāo)記家蠶循環(huán)血細(xì)胞中的漿細(xì)胞。

integrinβ2和integrinβ3特有的引物序列為：seqidno：1和seqidno：2。

integrinβ2和integrinβ3特有的race引物序列為：seqidno：3和seqidno：4。

下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步的描述.

步驟1：實(shí)驗(yàn)材料(如圖2)

步驟2：主要儀器設(shè)備(如圖3)

步驟3：實(shí)驗(yàn)試劑(如圖4)

步驟4：主要培養(yǎng)基及溶液配制

(1)氨芐(或卡拉)抗生素(100mg/ml)：稱取5g氨芐(或卡拉)抗生素粉末，加入40ml滅菌水溶解后，定容至50ml。用0.22μm濾器過(guò)濾除菌，小分分裝，保存于-20℃。

(2)iptg(24mg/ml)：稱取1.2giptg粉末，加入40ml滅菌水溶解后，定容至50ml。用0.22μm濾器過(guò)濾除菌，小分分裝，保存于-20℃。

(3)lb液體培養(yǎng)基：稱取10gnacl，10g胰蛋白胨和20g酵母提取物，用ddh2o定容至1l，121℃高壓滅菌20分鐘；

(4)lb固體培養(yǎng)基：稱取2gnacl，2g胰蛋白胨，4g酵母提取物和3g瓊脂粉，用ddh2o定容至200ml，121℃高壓滅菌20分鐘。待培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時(shí)，加入抗生素，混合均勻后即刻倒置平板，待完全凝固后保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

(5)1mnaoh：稱取40gnaoh固體，加ddh2o定容至1l，0.22μm濾器過(guò)濾后室溫保存。

(6)200mmedta：稱取74.448gedta.2h2o，加入800mlddh2o，攪拌溶解后定容至1l，0.22μm濾器過(guò)濾后室溫保存。

(7)4mnacl：稱取233.76gnacl粉末，加入800mlddh2o，攪拌溶解后定容至1l，0.22μm濾器過(guò)濾后室溫保存。

(8)30％異丙醇：量取150ml異丙醇，加ddh2o至500ml。

(9)2m尿素，25mmtris-hcl，5mmedta：稱取120.12g尿素，3.0285gtrisbase，和1.8612gedta.2h2o，加入800mlddh2o，攪拌溶解后定容至1l。

(10)8m尿素，25mmtris-hcl，0.3mnacl(ph8.0)：稱取480.48g尿素，3.0285gtrisbase和17.532gnacl，加入800mlddh2o，攪拌溶解后調(diào)節(jié)ph至8.0后，定容至1l。

(11)50mmtrisbase：稱取3.0285gtrisbase，加水至500ml。

(12)20mmtris，0.5mnacl，50％etoh(ph7.0)：稱取1.2114gtrisbase和5.61gnacl，量取250ml無(wú)水乙醇，加入150mlddh2o，攪拌溶解，調(diào)節(jié)ph至7.0后定容至500ml。

(13)5％乙酸1％tritonx-100：量取25ml乙酸和5mltritonx-100，加ddh2o定容至500ml，搖晃混合均勻。

(14)4m咪唑：稱取137.6g咪唑，加ddh2o定容至500ml，溶解后用0.22μm濾器過(guò)濾。

(15)考馬斯亮藍(lán)r-250染色液：稱取1g考馬斯亮藍(lán)r-250，置于1l燒杯，然后加入250ml異丙醇，攪拌溶解后加入100ml冰醋酸并混合均勻，加入650mlddh2o，混合均勻后過(guò)濾除去顆粒狀物質(zhì)，室溫保存。

(16)考馬斯亮藍(lán)染色脫色液：分別量取100ml冰醋酸，50ml乙醇和850mlddh2o，混勻后使用。

步驟5：實(shí)驗(yàn)方法

1、原核表達(dá)載體構(gòu)建

(1)以血細(xì)胞cdna為模板，利用設(shè)計(jì)的intgrinβ2和integrinβ3原核表達(dá)引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增。intgrinβ2的擴(kuò)增引物為

f2：“ggaattcacttccatttgtggacagttca”，

r2：“ccgctcgagtatacggcgcgtcagtga”；

intgrinβ3的擴(kuò)增引物為

f3：“ggaattcgacctatgcgaaaaatctgaa”，

r3：“ccgctcgagtattctcatcgcaattcttgtt”。

將擴(kuò)增產(chǎn)物用切膠回收的方法進(jìn)行回收；

(2)用ecori和xhoi限制性內(nèi)切酶同時(shí)對(duì)回收pcr產(chǎn)物和pet28a載體進(jìn)行切割，并分別進(jìn)行切膠回收，用1％瓊脂糖凝膠對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)；

(3)取pet28a酶切回收產(chǎn)物，1μl；pcr回收片段，4μl；10×t4buffer，1μl；t4dna連接酶，1μl；ddh2o，3μl，混勻瞬時(shí)離心后，室溫連接4小時(shí)；

(4)從-80℃冰箱取出感受態(tài)細(xì)胞，用手握住使其快速融化，加入10μl連接產(chǎn)物，冰上靜置30分鐘，然后42℃熱激45-60秒，冰上靜置2分鐘，加入400μl無(wú)抗生素lb液體培養(yǎng)基，于220rpm，37℃的條件下震蕩搖晃1小時(shí)；

(5)取適量菌液，均勻涂布于含卡拉抗生素的lb培養(yǎng)板上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)后，用白色槍頭挑取單克隆于含卡拉抗生素的lb液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)4-6小時(shí)后，進(jìn)行菌液電泳檢測(cè)，篩選出陽(yáng)性單克隆，并送至華大基因測(cè)序；

(6)將測(cè)序驗(yàn)證正確的陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，參照qiagen質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書提取質(zhì)粒，利用1％瓊脂糖膠和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)質(zhì)粒濃度和純度。

2、原核誘導(dǎo)表達(dá)

(1)從-80℃冰箱取出rosseta感受態(tài)細(xì)胞，用手握住使其快速融化，加入1μlpet28a重組質(zhì)粒，輕柔混合均勻后冰上靜置30分鐘，然后于42℃熱激60-90秒，冰上靜置2分鐘后，加入400μl無(wú)抗生素lb液體培養(yǎng)基，于220rpm，37℃的條件下震蕩搖晃1小時(shí)；

(2)取適量菌液，均有涂布于含卡拉抗生素的lb培養(yǎng)板上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，次日用白色槍頭挑取單克隆于含卡拉抗生素的lb液體培養(yǎng)中，37℃震蕩培養(yǎng)4-6小時(shí)候后，進(jìn)行菌液pcr檢測(cè)，篩選出陽(yáng)性單克?。?/p>

(3)將陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，取1ml菌液加至10ml新鮮的含有卡那抗生素的lb培養(yǎng)基中，37℃，300rpm震蕩培養(yǎng)，當(dāng)od值達(dá)到0.6-1.0之間時(shí)，往各試管中加入適量氯霉素和iptg，其中以只加氯霉素組為對(duì)照。然后分別在37℃，25℃和16℃培養(yǎng)6，12和16小時(shí)；

(4)分別收集所有組別的菌液菌體，10000rpm，4℃離心10分鐘，棄上清液，下層菌體用pbs重懸；

(5)將所有組別的菌液用液氮反復(fù)凍融三次，利用超聲破碎儀對(duì)菌液進(jìn)行破碎，直至菌液至澄清狀；

(6)12000rpm，4℃離心10分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，再往沉淀中加入pbs，用移液搶輕輕懸浮沉淀；

(7)分別取20μl上清和沉淀混懸液，然后各加入5μl5×loadingbuffer，100℃水浴30分鐘，取其中10μl樣品進(jìn)行sds-page電泳，檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)及表達(dá)形式。

3、重組蛋白的大規(guī)模誘導(dǎo)和蛋白純化

(1)包涵體的處理

a、將含有重組質(zhì)粒的rosseta菌株接種于2l含有卡拉青霉素的lb培養(yǎng)基中，37℃，300rpm震蕩培養(yǎng)，當(dāng)od值達(dá)到0.6-1.0之間時(shí)，加入iptg和氯霉素，然后在37℃震蕩培養(yǎng)6小時(shí)；

b、12000rpm，4℃離心10分鐘，棄上清，盡量去除培養(yǎng)基，菌體用pbs洗滌兩次；

c、用預(yù)冷50mmtris洗滌沉淀兩次，最后菌體用適當(dāng)體積的(與菌體比例為1:10-20)的預(yù)冷50mmtris溶液重懸菌體；

d、利用avestin高壓均質(zhì)機(jī)對(duì)菌體進(jìn)行高壓破碎，重復(fù)高壓破碎三次后，收集破碎液，于20000rpm，4℃離心30分鐘；

e、用5％乙酸1％tritonx-100對(duì)包涵體沉淀室溫洗滌50分鐘后，高速冷凍離心；

f、重復(fù)步驟e一次，高速冷凍離心后收集沉淀；

g、用2m尿素、25mmtris、5mmedta洗滌沉淀，高速冷凍離心，收集沉淀；h、用20mmtris、0.5mnacl、50％乙醇，ph7.0洗滌，高速冷凍離心，收集沉淀；

i、用雙蒸水洗滌沉淀而去鹽；

j、用8m尿素，25mmtris-hcl，0.3mnacl(ph8.0)溶解包涵體，調(diào)ph值至11.5-12.0，攪拌過(guò)夜。次日將ph調(diào)至8.0后，20000rpm，4℃離心30分鐘，上清用0.22μm濾器過(guò)濾后保存于冰上。

(2)his柱的處理

在對(duì)包涵體進(jìn)行處理的同時(shí)，對(duì)鎳柱進(jìn)行前期的處理。

a、將填料裝柱后，用ddh2o對(duì)鎳柱進(jìn)行清洗；

b、用2mnacl洗滌大約10個(gè)柱體積，鎳柱再生；

c、用ddh2o徹底清洗后，加入約10個(gè)柱體積的1mnaoh，以去除結(jié)合的雜蛋白；

d、用ddh2o徹底清洗后，用30％的異丙醇對(duì)鎳柱進(jìn)行處理；

e、用ddh2o徹底清洗后，加入100mm的edta以去掉鎳柱材料位點(diǎn)上已結(jié)合的鎳離子；

f、待鎳柱完全變?yōu)榘咨珪r(shí)，加入ddh2o，對(duì)鎳柱進(jìn)行清洗，以徹底除去edta；g、加入0.1mni2so4，使得鎳離子重新掛柱，所有填料均變藍(lán)后，用ddh2o徹底清洗以除去殘余的ni2so4；

h、加入大約5個(gè)柱體積的8m尿素，25mmtris-hcl，0.3mnacl(ph8.0)，平衡鎳柱。

(3)重組蛋白的純化

a、將預(yù)處理的蛋白樣品穿過(guò)鎳柱，使得重組蛋白掛柱，收集穿透液；

b、用濃度梯度的咪唑?qū)⒅亟M蛋白洗脫，收集個(gè)洗脫液組分；

c、利用15％的sds-page膠對(duì)純化過(guò)程中產(chǎn)生的各組分進(jìn)行電泳檢測(cè)；d、電泳完成后取下膠，考馬斯亮藍(lán)染液染色30分鐘；

e、用水對(duì)膠進(jìn)行清洗，除去考馬斯亮藍(lán)染液后，加入洗脫液，完全脫色后拍照。

4、抗體制備

(1)integrinβ2抗體用大鼠制備，整個(gè)制備過(guò)程均于廣州茲尼生物科技有限公司完成。而integrinβ3抗體制備以昆明鼠為材料制備抗體，共免疫五次：第一次取50μg純化蛋白與等體積的弗氏完全佐劑混合并均質(zhì)化后進(jìn)行皮下注射，第二、三和四次分別取75、100和125μg純化蛋白與等體積的弗氏不完全佐劑混合并均質(zhì)化后進(jìn)行皮下注射，每次注射間隔時(shí)間為10天。第五次取150μg純化蛋白直接進(jìn)行皮下注射，3天后收集小鼠血液；

(2)將小鼠血液室溫靜置2小時(shí)，于3000rpm室溫離心15分鐘，小心吸取上層液體至新的離心管中，然后在室溫分別用6000、9000和12000rpm對(duì)上一回合吸取的上層液體進(jìn)行離心，最終獲得抗血清；

(3)向抗血清中加入等體積的滅菌甘油，混合均勻后小包裝分裝，保存于-80℃。

5、蠶體造血器官摘除

(1)用75％的酒精棉輕輕擦拭五齡幼蟲體表，放置于干凈的玻璃皿中，待酒精完全揮發(fā)。用一次性注射器針頭依次輕輕挑破兩對(duì)翅原基所在位置的皮膚，迅速用鑷子取出翅原基-造血器官?gòu)?fù)合體。對(duì)照組用針頭挑破稍微偏離翅原基所在位置，不取出翅原基；

(2)待蠶恢復(fù)一定的活力后，用干凈桑葉飼養(yǎng)。準(zhǔn)備取材的前9個(gè)小時(shí)，稱取幼蟲體重，按照5μg/g的量注射edu。取材時(shí)，用針頭刺破幼蟲足部，將血淋巴收集于提前加入400μlpbs和10μl苯基硫脲的1.5ml離心管中，迅速混合均勻，取200μl混合液滴入提前置入細(xì)胞爬片的24孔板，剩余血淋巴經(jīng)3000rpm低溫離心5分鐘，棄上清，取1mlrnaiso重懸血細(xì)胞后保存于-80℃，用于rna的提??；

(3)血細(xì)胞室溫貼壁15分鐘，1×pbs快速洗滌3次后迅速加入1ml4％的多聚甲醛溶液固定15分鐘，1×pbs洗滌3×5分鐘以棄除殘留的多聚甲醛；

(4)按照invitrogen公司提供的eduimagingkits試劑盒說(shuō)明書，進(jìn)行edu的標(biāo)記染色，完成后用10％的山羊血清于37℃封閉處理2-3小時(shí)；

(5)用4％的山羊血清配制一抗，4℃孵育16-25小時(shí)，室溫放置30分鐘待溫度恢復(fù)至室溫時(shí)回收抗體，1×pbs洗滌3×10分鐘；

(6)用4％的山羊血清配制熒光二抗，室溫孵育1-2小時(shí)，1×pbs洗滌3×10分鐘；

(7)dapi染色40分鐘，1×pbs洗滌3×10分鐘，用鑷子取出玻片，倒扣至滴有抗熒光淬滅劑的載玻片上，用無(wú)色指甲油封住，避光水平放置于4℃冰箱，次日取出觀察。

6、造血器官體外培養(yǎng)

(1)在超菌工作臺(tái)中按照上述方法收集翅原基-造血器官?gòu)?fù)合體，用含少許苯基硫脲的無(wú)菌pbs快速洗滌3次，然后用含少許苯基硫脲grace培養(yǎng)基洗滌洗滌2次；

(2)用鑷子輕輕將造血器官夾入24孔板中，每孔6-8個(gè)，靜置幾分鐘待造血器官貼壁后加入含10％胎牛血清和適量基硫脲的grace培養(yǎng)基1ml，輕輕將培養(yǎng)板轉(zhuǎn)移至恒溫培養(yǎng)箱，27℃培養(yǎng)；

(3)培養(yǎng)1.5天后，輕輕夾出造血器官，用pbs快速洗滌2次后，用4％多聚甲醛固定15分鐘，后續(xù)免疫熒光步驟同上。

步驟6：結(jié)果與分析

1、基因結(jié)構(gòu)分析

在前期研究中，對(duì)家蠶integrin家族進(jìn)行了系統(tǒng)的鑒定與克隆，發(fā)現(xiàn)6個(gè)α亞基成員和5個(gè)β成員。芯片和定量表達(dá)分析結(jié)果顯示，integrinβ2和integrinβ3特異高表達(dá)于家蠶的漿細(xì)胞。，其中包括integrinβ2和integrinβ3。integrinβ2定位于4號(hào)染色體nscaf2847，基因全長(zhǎng)為6311bp，由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成。其基因cdna全長(zhǎng)2434bp，5’和3’utr分別為118bp和72bp，其cds為2244bp，編碼747aa的蛋白，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量為84.42kda，等電點(diǎn)為5.349。integrinβ3定位于4號(hào)染色體nscaf2847，基因全長(zhǎng)為10086bp，由7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成。integrinβ2基因cdna全長(zhǎng)2653bp，5’和3’utr分別為122bp和410bp，其cds為2172bp，編碼723aa的蛋白，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量為81.79kda，等電點(diǎn)為5.22。

2：蛋白同源序列比對(duì)

對(duì)不同物種的integrinβ蛋白進(jìn)行多重序列比對(duì)，結(jié)果表明不同物種的蛋白具有高度保守的結(jié)構(gòu)特征，均由一段較長(zhǎng)的胞外域、一個(gè)單次跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)較短的胞內(nèi)域構(gòu)成。家蠶integrinβ2和β3與煙草天蛾(manducasexta)和草地夜蛾(spodopterafrugiperda)的integrinβ1蛋白相比都具有相似的功能結(jié)構(gòu)域，如n端信號(hào)肽序列、i-like結(jié)構(gòu)、midas金屬離子結(jié)合聚序、egf結(jié)構(gòu)域、npxy模式和四個(gè)半胱氨酸重復(fù)序列。

3：表達(dá)分析

利用定量pcr對(duì)前期結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，檢測(cè)了integrinβ2和integrinβ3在家蠶五齡三天表皮、頭部、精巢、卵巢、中腸、馬氏管、絲腺、脂肪體、血細(xì)胞以及翅原基和造血器官?gòu)?fù)合體中的的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，這兩個(gè)基因均高表達(dá)于血細(xì)胞，在翅原基和造血器官?gòu)?fù)合體有一定的表達(dá)，而在其他組織中的表達(dá)水平都很低。利用手術(shù)方法將造血器官剝離翅原基，分別檢測(cè)這兩個(gè)基因在這兩個(gè)組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)均高表達(dá)于造血器官，而非翅原基。同時(shí)也檢測(cè)了其在各時(shí)期血液中的表達(dá)，結(jié)果顯示，integrinβ2和integrinβ3表現(xiàn)出高度相似的表達(dá)趨勢(shì)，在四齡眠期表達(dá)水平最低，從五齡開始表達(dá)水平逐漸上調(diào)，至五齡六天達(dá)到峰值，變態(tài)發(fā)育時(shí)期有所下調(diào)。

4：原核表達(dá)與蛋白純化

為了進(jìn)一步檢測(cè)integrinβ2和integrinβ3基因的表達(dá)情況，探索能否作為血細(xì)胞特異性分子標(biāo)記，對(duì)integrinβ2和integrinβ3基因分別進(jìn)行了原核表達(dá)、蛋白純化以及抗體制備工作。integrinβ2和integrinβ3基因片段經(jīng)pcr擴(kuò)增后，分別連接至pet32和pet28a質(zhì)粒，獲得pet32-integrinβ2和pet28a-integrinβ3重組質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化至rosseta感受體后，用終濃度為1mm的iptg分別在37℃，25℃和16℃溫度條件下誘導(dǎo)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)均能誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)，但37℃誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白最多，所以在大規(guī)模誘導(dǎo)是采用37℃進(jìn)行處理。

經(jīng)過(guò)ni+親和層析方法對(duì)包涵體進(jìn)行純化，得到純度較高的重組蛋白。將integrinβ2和integrinβ3重組蛋白分別免疫大鼠和小鼠，制備了相應(yīng)的多克隆抗體。利用westernblot方法檢測(cè)這兩個(gè)抗體，發(fā)現(xiàn)都能識(shí)別外源重組蛋白和家蠶血細(xì)胞內(nèi)源性蛋白。提取頭部、脂肪體、中腸、絲腺、馬氏管、表皮、以及血細(xì)胞蛋白，檢測(cè)integrinβ2和integrinβ3的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)這兩種蛋白均特異表達(dá)于血細(xì)胞，與前期定量結(jié)果一致。

5：integrinβ2和integrinβ3特異性地標(biāo)記家蠶循環(huán)血細(xì)胞中的漿細(xì)胞

為了進(jìn)一步檢測(cè)integrinβ2和integrinβ3是否能特異性標(biāo)記循環(huán)血細(xì)胞中的漿細(xì)胞情況，用獲得的抗體進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)。首先，對(duì)anti-integrinβ2大鼠抗體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在免疫前血清組中，未觀測(cè)到熒光信號(hào)；而在抗體組中，在部分細(xì)胞可以觀察到明顯的熒光信號(hào)，并且位于細(xì)胞膜上通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定，發(fā)現(xiàn)被標(biāo)記的這一類血細(xì)胞均為漿細(xì)胞。漿細(xì)胞一個(gè)最大的特征就是延展反應(yīng)，因此為了進(jìn)一步對(duì)觀察結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，將血細(xì)胞在體外培養(yǎng)1小時(shí)，讓漿細(xì)胞發(fā)生延展后再進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)，結(jié)果顯示，所有的延展型漿細(xì)胞均能夠被anti-integrinβ2大鼠抗體標(biāo)記上，此外還有部分未成熟的漿細(xì)胞也可以被標(biāo)記，證明integrinβ2可以特異性地標(biāo)記家蠶的成熟漿細(xì)胞。在egfp綠色熒光蛋白特性性表達(dá)于漿細(xì)胞和擬絳色細(xì)胞的a3-egfp品系轉(zhuǎn)基因蠶中，經(jīng)過(guò)免疫熒光分析，發(fā)現(xiàn)絕大部分紅色熒光信號(hào)(integrinβ2)和綠色熒光信號(hào)發(fā)生重疊，這在轉(zhuǎn)基因家蠶個(gè)體水平上進(jìn)一步證明了integrinβ2能特異性地標(biāo)記家蠶循環(huán)血細(xì)胞中的漿細(xì)胞，。

利用相同的免疫熒光檢測(cè)方法，發(fā)現(xiàn)anti-integrinβ3小鼠抗體也可以特異性標(biāo)記漿細(xì)胞。將細(xì)胞胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，在培養(yǎng)15分鐘、30分鐘、1小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)和24小時(shí)后，分別收集血細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)，結(jié)果顯示，大部分被anti-integrinβ3小鼠抗體標(biāo)記上的血細(xì)胞在未經(jīng)培養(yǎng)時(shí)，呈現(xiàn)圓球型，而隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，大部分被標(biāo)記血細(xì)胞延展程度越來(lái)越大，最后發(fā)育成漿細(xì)胞，這說(shuō)明integrinβ3可以同時(shí)特異性地標(biāo)記家蠶循環(huán)血細(xì)胞中的未成熟和成熟的漿細(xì)胞。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

<110>西南大學(xué)

<120>一種家蠶漿細(xì)胞特異性分子標(biāo)記鑒定方法

<160>4

<210>1

<211>48

<212>dna

<213>人工序列

<400>核苷酸序列

gtattgattggcttgctgactctc

gcttcttccactttcctgtattcc

<210>2

<211>41

<212>dna

<213>人工序列

<400>核苷酸序列

tcacgtcctgcgtttaaca

gcataaattccaactcggttcc

<210>3

<211>62

<212>dna

<213>人工序列

<400>核苷酸序列

ccggaattccctatagagcatttcccgc

ccgctcgagctgtttctgatcctagtattgcatt

<210>4

<211>59

<212>dna

<213>人工序列

<400>核苷酸序列

ggaattcgacctatgcgaaaaatctgaa

ccgctcgagtattctcatcgcaattcttgtt