本發(fā)明涉及一種基于溫敏陽離子聚合物的sirna載體及其制備方法。

背景技術(shù)：

作為一種有效的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默手段，rna干擾開辟了研究基因功能以及治療遺傳性疾病的新方法。作為rna干擾的重要效應(yīng)因子，sirna已經(jīng)逐漸成為重要的基因治療藥物。但是，sirna由于其在體內(nèi)易被核酸酶分解、細(xì)胞吸收效率低等因素導(dǎo)致其難以獨立完成基因治療的任務(wù)，因此優(yōu)異的sirna載體材料近年來受到科學(xué)家的廣泛關(guān)注。

目前sirna載體主要分為病毒載體和非病毒載體兩大類，其中更加安全易得的非病毒載體成為目前的主要研究目標(biāo)。sirna的非病毒載體的發(fā)展過程中，聚合物載體展現(xiàn)了廣闊的應(yīng)用前景。

sirna的聚合物載體是近年來被廣泛研究的sirna載體材料。因其安全性高，對sirna易操作，價格低廉，尤其是結(jié)構(gòu)易于改造等優(yōu)點，聚合物載體被廣泛應(yīng)用于基因治療的研究。而通過對聚合物結(jié)構(gòu)的智能化改造使載體具備特定的功能是目前聚合物載體研究的熱門。jingguoli等合成了具有ph和氧化還原雙重響應(yīng)的三嵌段聚合物peg-pasp(mea)-pei，該聚合物在高濃度還原性谷胱甘肽的環(huán)境下發(fā)生二硫鍵的斷裂從而釋放sirna，而偏酸性的ph環(huán)境可以使復(fù)合物表面變?yōu)檎姾蓮亩走M入細(xì)胞(j.li,etal.adv.mater.2014,26,8217-8224)。mingmingwang等在5代pamam表面修飾上pba和pnipam，使載體具有溫敏性能，可通過pnipam的溫敏相變調(diào)節(jié)sirna與pamam表面氨基的吸附能力，達(dá)到相變后吸附sirna及降低溫度恢復(fù)到相變前狀態(tài)可使sirna脫落的目的，從而起到溫度控制sirna釋放的作用(m.wang,etal.bioconjugatechem.2016,27,495-499)。

sirna的聚合物載體往往是通過陽離子基元與本身帶負(fù)電的sirna通過靜電吸附相結(jié)合，通過聚合物本身的屏蔽作用來保護sirna免受各種環(huán)境因素的影響，其次，也可以聚入某些功能性基元來實現(xiàn)聚合物載體的智能化。氨基作為在中性條件下可以較高質(zhì)子化程度的基團，在聚合物與sirna的靜電作用中起到了重要作用。而樹枝化烷氧醚作為溫敏基元由于其靈敏的溫敏特性和相變前后的位阻差異可以為sirna的吸附與釋放提供良好的可控性。

目前有報道設(shè)計的sirna聚合物載體越來越多的實現(xiàn)了載體的智能化，可以對ph、溫度、氧化還原等因素具有一定的刺激響應(yīng)性能。其中溫敏載體的設(shè)計較少，缺少在人體體溫附近釋放sirna的溫敏載體，主要是因為人體體溫的區(qū)間較窄以及所涉及的溫敏基元缺乏足夠的靈敏度，因此，良好的溫敏控釋載體仍然缺少足夠的研究。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)問題，本發(fā)明的目的之一在于克服已有技術(shù)存在的缺陷，提供一種基于溫敏陽離子聚合物的sirna載體。

本發(fā)明的目的之二在于提供該載體的制備方法。

本發(fā)明采用以二代烷氧醚樹枝化基元為溫敏基元，參見w.li,etal.chemcommun.2008,45,5948-5950，通過與合成的樹枝化氨基基元進行無規(guī)共聚，得到含有溫敏基元與氨基基元的聚合物。利用氨基基元與sirna之間的靜電引力實現(xiàn)對sirna的吸附，而由烷氧醚樹枝化結(jié)構(gòu)的升溫塌陷特性來對sirna進行釋放。通過烷氧醚樹枝化聚合物對溫度的敏感性實現(xiàn)聚合物對sirna吸附狀態(tài)的調(diào)控，使本發(fā)明具有在基因治療、可控釋藥等領(lǐng)域的應(yīng)用前景。

樹枝化氨基基元單體的合成步驟為：

為了實現(xiàn)以上發(fā)明目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：

一種基于溫敏陽離子聚合物的sirna載體，其特征在于該聚合物的結(jié)構(gòu)式為：

其中m：n＝3～5，m＝10～15，n＝3～5，x＝meo-或x＝eto-中的任意一種。

一種制備上述的基于溫敏陽離子聚合物的sirna載體的方法，其特征在于該方法的具體步驟：

a.在惰性氣氛下，將氨基封端樹枝化基元單體、二代烷氧醚樹枝化單體和偶氮類引發(fā)劑以1：10～1：20的摩爾比溶于n，n-二甲基甲酰胺中，70℃～75℃反應(yīng)10～12h，冷卻至室溫，加入二氯甲烷溶解，分離提純，得到含有叔丁氧羰基的聚合物1，其結(jié)構(gòu)式為：

b.將步驟a所得含有叔丁氧羰基的聚合物1和三氟乙酸1:50～1：100質(zhì)量比溶于二氯甲烷，常溫反應(yīng)3～4h，脫去氨基基元封端的叔丁氧羰基，結(jié)束后向反應(yīng)溶液中加入甲醇溶解，并蒸干甲醇，抽真空得到聚合物2即基于溫敏陽離子聚合物的sirna載體。

上述的氨基封端樹枝化基元單體的具體制備方法為：

a.將2-[2-(2-t-boc-氨基乙氧基)乙氧基]乙醇溶于四氫呋喃中，加入氫氧化鈉水溶液混溶均勻，2-[2-(2-t-boc-氨基乙氧基)乙氧基]乙醇與氫氧化鈉質(zhì)量比為3：1～5：1，冰浴冷卻，緩慢滴加對甲苯磺酰氯的四氫呋喃溶液，2-[2-(2-t-boc-氨基乙氧基)乙氧基]乙醇與對甲苯磺酰氯的質(zhì)量比為1：1～1：1.3，反應(yīng)3～4h，蒸干四氫呋喃并加入二氯甲烷與水萃取，經(jīng)分離提純得到化合物1，化合物1結(jié)構(gòu)式為：

b.在惰性氣氛下，將步驟a所得化合物1、沒食子酸甲酯、干燥碳酸鉀和干燥碘化鉀以質(zhì)量比10：1.3：10：0.8～10：1.5：15：1的比例混合并溶于n，n-二甲基甲酰胺中，80℃～85℃反應(yīng)22～24h，蒸干溶劑，加入二氯甲烷與水萃取，經(jīng)分離提純得到化合物2，化合物2結(jié)構(gòu)式為：

c.在惰性氣氛下，冰浴中，將步驟b所得將化合物2溶于干燥的四氫呋喃之中，緩慢滴入氫化鋰鋁粉末的四氫呋喃懸濁液，所述的化合物2與氫化鋁鋰的質(zhì)量比為11：1～9：1，攪拌反應(yīng)進行3～4h，加甲醇終止反應(yīng)，過濾并蒸干四氫呋喃，用二氯甲烷與水萃取，分離提純得到化合物3，化合物3結(jié)構(gòu)式為：

d.在惰性氣氛下，冰浴中，將步驟c所得化合物3、三乙胺和4-二甲氨基吡啶按8：1：1～8：2：1.5的質(zhì)量比溶于干燥的二氯甲烷中，緩慢加入甲基丙烯酰氯，其中化合物3與甲基丙烯酰氯的質(zhì)量比為4：1～5：1，反應(yīng)時間為3～4小時，用甲醇終止反應(yīng)，加入水進行萃取，然后分離提純得到氨基基元單體，其結(jié)構(gòu)式為：

上述的基于溫敏陽離子聚合物的sirna載體的應(yīng)用，其特征在于在相變前對sirna進行吸附且通過升溫相變釋放sirna。

本發(fā)明采用氨基封端樹枝化基元為氨基基元單體，與二代烷氧醚樹枝化單體發(fā)生聚合反應(yīng)，合成具有溫度響應(yīng)性的陽離子聚合物。該聚合物在相變溫度以下可以實現(xiàn)對sirna的吸附，溫度上升到相變溫度以上可以實現(xiàn)對sirna的釋放。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比較，具有如下顯而易見的實質(zhì)性特點和顯著優(yōu)點：

1.本發(fā)明采用溫度敏感的樹枝化烷氧醚為超分子主體，利用其靈敏的溫敏特性，來構(gòu)筑一類新型的溫度響應(yīng)載體，結(jié)構(gòu)新穎；

2.本發(fā)明通過選擇不同比例的單體比進行聚合反應(yīng)，即可制備不同相變區(qū)間的溫敏載體，且相變溫度可根據(jù)實際需求情況進行設(shè)計；

3.與其它類型的sirna聚合物載體相比，具有吸附效率高，釋放條件簡單和溫度響應(yīng)靈敏等優(yōu)勢，有望應(yīng)用于基因治療及藥物控釋等領(lǐng)域；

附圖說明

圖1氨基基元單體的核磁譜圖；¹hnmr(cdcl3):δ＝1.45(s,27h,ch3),1.98(s,3h,ch3)，3.33–4.19(m,2h,ch2),5.09(s,2h,ch2),5.61(s,h,ch)，6.16(s,h,ch)，6.63(s,2h,ar–h)。

圖2聚合物1的核磁圖譜；¹hnmr(dmso-d6):δ＝1.07(br,ch3),1.33(s,27h,ch3),3.44-4.05(br,ch2),4.34(br,ch2),6.56(s,2h,ar-h)。

圖3聚合物2的核磁圖譜；¹hnmr(dmso-d6):δ＝1.10(br,ch3),3.44-4.12(br,ch2),4.42(br,ch2),6.64(br,ar-h)。

圖4聚合物相變過程的紫外吸收譜圖；

圖525℃下的凝膠電泳成像；

圖655℃下的凝膠電泳成像。

具體實施方式

本發(fā)明的優(yōu)選實施例詳述如下：

實施例一：基于烷氧醚樹枝化結(jié)構(gòu)的氨基基元單體的制備：

a.將2-[2-(2-t-boc-氨基乙氧基)乙氧基]乙醇溶于四氫呋喃中，加入氫氧化鈉水溶液混溶均勻，2-[2-(2-t-boc-氨基乙氧基)乙氧基]乙醇與氫氧化鈉質(zhì)量比為3：1～5：1，冰浴冷卻，緩慢滴加對甲苯磺酰氯的四氫呋喃溶液，2-[2-(2-t-boc-氨基乙氧基)乙氧基]乙醇與對甲苯磺酰氯的質(zhì)量比為1：1～1：1.3，反應(yīng)3～4h，蒸干四氫呋喃并加入二氯甲烷與水萃取，經(jīng)分離提純得到化合物1，化合物1結(jié)構(gòu)式為：

b.在惰性氣氛下，將步驟a所得化合物1、沒食子酸甲酯、干燥碳酸鉀和干燥碘化鉀以質(zhì)量比10：1.3：10：0.8～10：1.5：15：1(的比例混合并溶于n，n-二甲基甲酰胺中，80℃～85℃反應(yīng)22～24h，蒸干溶劑，加入二氯甲烷與水萃取，經(jīng)分離提純得到化合物2，化合物2結(jié)構(gòu)式為：

c.在惰性氣氛下，冰浴中，將步驟b所得將化合物2溶于干燥的四氫呋喃之中，緩慢滴入氫化鋰鋁粉末的四氫呋喃懸濁液，所述的化合物2與氫化鋁鋰的質(zhì)量比為11：1～9：1，攪拌反應(yīng)進行3～4h，加甲醇終止反應(yīng)，過濾并蒸干四氫呋喃，用二氯甲烷與水萃取，分離提純得到化合物3，化合物3結(jié)構(gòu)式為：

d.在惰性氣氛下，冰浴中，將步驟c所得化合物3、三乙胺和4-二甲氨基吡啶按8：1：1～8：2：1.5的質(zhì)量比溶于干燥的二氯甲烷中，緩慢加入甲基丙烯酰氯，其中化合物3與甲基丙烯酰氯的質(zhì)量比為4：1～5：1，反應(yīng)時間為3～4h，用甲醇終止反應(yīng)，加入水進行萃取，然后分離提純得到氨基基元單體，其結(jié)構(gòu)式為：

其中氨基基元單體的的核磁圖如圖1所示。

2.氨基基元單體與乙氧基末端的溫敏基元單體的無規(guī)共聚物的制備：

a.在惰性氣氛下，將氨基封端樹枝化基元單體、二代烷氧醚樹枝化單體和偶氮類引發(fā)劑以1：10～1：20的摩爾比溶于n，n-二甲基甲酰胺中，70℃～75℃反應(yīng)10～12h，冷卻至室溫，加入二氯甲烷溶解，分離提純，得到含有叔丁氧羰基的聚合物1，其結(jié)構(gòu)式為：

所得的無規(guī)共聚物中兩種基元摩爾比例m：n＝3～5，其中聚合物1的核磁圖如圖2所示。

b.將步驟a所得含有叔丁氧羰基的聚合物1和三氟乙酸1:50～1：100質(zhì)量比(溶于二氯甲烷，常溫反應(yīng)3～4h，脫去氨基基元封端的叔丁氧羰基，結(jié)束后向反應(yīng)溶液中加入甲醇溶解，并蒸干甲醇，抽真空得到聚合物2即基于溫敏陽離子聚合物的sirna載體。其結(jié)構(gòu)式為：

其中聚合物2的核磁圖如圖3所示。

聚合物相變溫度的測試：將溫敏聚合物溶于水中，由于烷氧醚具有溫敏行為，所以加熱到某一溫度時，其水溶液會變渾濁，降溫后溶液又回復(fù)澄清狀態(tài)。采用變溫uv/vis跟蹤其在中性水溶液中的相變過程。測得不同濃度溫敏聚合物濁度相變曲線如圖4所示。濃度為2.5mg/ml時，聚合物的相變溫度為43℃。

在相變前后聚合物與sirna結(jié)合狀態(tài)的測試：取聚合物配制濃度為10mg/ml的水溶液，與10μm的sirna溶液以不同氮磷比混合，室溫靜置10～15分鐘制得復(fù)合物溶液，在25℃下做瓊脂糖凝膠電泳測試，結(jié)果如圖5所示。其后將復(fù)合物溶液置于55℃水浴中加熱10～15分鐘，在55℃下做瓊脂糖凝膠電泳測試，結(jié)果如圖6所示。

在室溫下，溫敏聚合物處于相變前狀態(tài)，sirna與氨基接觸，以靜電作用相結(jié)合，在凝膠電泳圖像上顯示在足夠高氮磷比條件下基本聚集在原點空槽處，無法泳出sirna條帶；在55℃條件下，聚合物完全相變聚集，使得氨基被屏蔽，sirna與氨基之間的接觸被阻隔，從而導(dǎo)致聚合物對sirna的結(jié)合能力被削弱，使得sirna在電泳過程中有條帶泳出。該結(jié)果顯示了所制備的溫敏陽離子聚合物對sirna具有良好的吸附性能，并且可以通過升溫相變過程使sirna被釋放。

上面結(jié)合附圖對本發(fā)明實施例進行了說明，但本發(fā)明不限于上述實施例，還可以根據(jù)本發(fā)明的發(fā)明創(chuàng)造的目的做出多種變化，凡依據(jù)本發(fā)明技術(shù)方案的精神實質(zhì)和原理下做的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，只要符合本發(fā)明的發(fā)明目的，只要不背離本發(fā)明基于樹枝化烷氧醚溫敏聚合物的sirna控釋載體、其制備方法和應(yīng)用的技術(shù)原理和發(fā)明構(gòu)思，都屬于本發(fā)明的保護范圍。