本發(fā)明涉及一種齊考諾肽的合成方法。
背景技術(shù)：
：2004年12月28日,fda批準(zhǔn)elan公司的齊考諾肽注射液(ziconotide，prialt)上市，用于鞘內(nèi)注射治療，主要適用于其他治療方法不能耐受或不能控制的嚴(yán)重慢性疼痛患者。歐盟于2005年2月22亦進(jìn)行了相同的批準(zhǔn)。2007年，聯(lián)合鎮(zhèn)痛會(huì)議專(zhuān)門(mén)小組推薦齊考諾肽作為一線(xiàn)鞘內(nèi)鎮(zhèn)痛藥。齊考諾肽是一種強(qiáng)效的、選擇性的n型電壓敏感性鈣通道阻滯劑，它包含的3個(gè)二硫鍵形成了一個(gè)完整的、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的不均勻的環(huán)，使得齊考諾肽可以特異性地、選擇性地、可逆地抑制脊髓背角上i、ⅱ層的、與疼痛傳遞有關(guān)的aδ、c神經(jīng)纖維末梢的n一型電壓敏感性鈣通道，可阻止脊髓初級(jí)疼痛傳入神經(jīng)元上鈣離子的涌入，抑制神經(jīng)遞質(zhì)如p物質(zhì)、降鈣素基因相關(guān)肽以及谷氨酸等的釋放，從而阻止或降低疼痛信號(hào)的傳導(dǎo)。齊考諾肽還作用于大腦皮層、神經(jīng)垂體和脊髓中的鈣通道上，但不作用于神經(jīng)肌肉接點(diǎn)處的鈣通道。此外，齊考諾肽不與阿片受體、膽堿能受體、單胺類(lèi)受體或肽能受體結(jié)合。生物體外研究表明，齊考諾肽能夠部分地但卻有效地阻斷去甲腎上腺素的釋放，而不影響γ-氨基丁酸或谷氨酸的釋放，也不阻斷煙堿樣乙酰膽堿受體離子通道。在小鼠模型試驗(yàn)中，齊考諾肽具有可逆的，劑量相關(guān)的鎮(zhèn)痛效果。當(dāng)將齊考諾肽直接應(yīng)用于鼠神經(jīng)受損的部位時(shí)，可引起熱痛覺(jué)過(guò)敏和機(jī)械性異常性疼痛，而對(duì)正常神經(jīng)無(wú)此反應(yīng)。在藥理學(xué)方面，齊考諾肽和阿片類(lèi)鎮(zhèn)痛劑的進(jìn)一步區(qū)別在于阿片類(lèi)作用的多種模式，而齊考諾肽具有高選擇性作用。因此，齊考諾肽新的藥理學(xué)特征的潛能來(lái)自其3個(gè)特性：在阿片類(lèi)無(wú)效的病例中有效；即使在有阿片類(lèi)耐受性的病人中，與阿片類(lèi)鎮(zhèn)痛劑聯(lián)合使用時(shí)也有輔助的鎮(zhèn)痛效果；齊考諾肽不會(huì)引起耐受性。因此，齊考諾肽在疼痛治療中具有獨(dú)特的地位。調(diào)查結(jié)果顯示，至少40％～50％的慢性疼痛(持續(xù)3個(gè)多月或以上)病人缺乏治療。2004年，美國(guó)人在止痛藥物上的支出為180億美元。齊考諾肽是25個(gè)氨基酸組成的聚合陽(yáng)離子肽(polycationicpeptide)，含有的堿性氨基酸包括4個(gè)賴(lài)氨酸和2個(gè)精氨酸；等電點(diǎn)pi是11.215，相對(duì)分子質(zhì)量是2639.1，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下式所示：目前對(duì)齊考諾肽合成工藝報(bào)道的有以下路線(xiàn)：在us2007269528、us2006234939、lu91181專(zhuān)利中，主要是其藥理和治療方面的報(bào)道，其中所述的齊考諾為純液相合成所得。國(guó)內(nèi)報(bào)道的工藝均為固相合成主鏈再采用不同方式進(jìn)行成環(huán)。在專(zhuān)利cn102268082中，雖然采用cys(trt)、cys(acm)、cys(tbu)三種不同保護(hù)基，但在形成二硫鍵時(shí)采用一次性形成二對(duì)二硫鍵的方式，成鍵準(zhǔn)確率低，而且采用了兩次高濃度的三氟乙酸進(jìn)行裂解，三氟乙酸消耗大，不僅成本高，而且對(duì)環(huán)境污染也大。在專(zhuān)利cn101709082中，成環(huán)的六個(gè)cys全部采用acm為保護(hù)基，線(xiàn)性肽在含鉈的試劑中脫除acm保護(hù)基，最后在液相中自由成環(huán)。該法不僅用到重金屬鉈，而且同時(shí)形成三對(duì)二硫鍵，成環(huán)準(zhǔn)確率低，后期純化困難。在專(zhuān)利cn101412752a中，采用cys(trt)、cys(acm)、cys(mob)三組保護(hù)基合成肽鏈，雖然是依次進(jìn)行三對(duì)二硫鍵的環(huán)化，但其路線(xiàn)采用在固相上完成前兩對(duì)二硫鍵的氧化，由于肽鏈一端固定在載體上，由于肽鏈自由旋轉(zhuǎn)空間受限，第二對(duì)二硫鍵成環(huán)難度大，收率低。而且還要使用強(qiáng)腐蝕的超強(qiáng)酸三氟甲磺酸，操作危險(xiǎn)大。在cn104974237a中，采用片斷法先合成四個(gè)片斷，然后再將片斷依次偶聯(lián)，最后得齊考諾肽線(xiàn)性肽，最后自主成環(huán)得齊考諾肽。該法采用片斷縮合方式，因片段間反應(yīng)為液相條件，過(guò)程中的副產(chǎn)物除去困難，操作步驟繁瑣且其成環(huán)方式為三對(duì)二硫鍵同時(shí)成環(huán)，二硫鍵之間成環(huán)準(zhǔn)確度低。在cn103304655a中，采用lys-gly、thr-gly、ser-gly三個(gè)二肽代替單個(gè)氨基酸偶聯(lián)，與專(zhuān)利cn101709082b一樣存在成環(huán)無(wú)選擇性的問(wèn)題。在文獻(xiàn)《固相法氧化選擇性合成齊考諾肽》中，采用四個(gè)trt保護(hù)基與2個(gè)acm保護(hù)基合成線(xiàn)性肽，一步自主選擇形成兩對(duì)二硫鍵。此法采用自主配對(duì)成環(huán)氧化，二硫鍵定位差。齊考諾肽報(bào)道的合成方法有固相和液相合成方法，但是各方法都有方法本身的不足，因此需要一種與上述方法相比具有較大的改進(jìn)的合成方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種偶聯(lián)條件溫和、成環(huán)選擇性高、操作過(guò)程簡(jiǎn)單、產(chǎn)品純度高的齊考諾肽的合成方法。本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的采用的技術(shù)方案是：一種齊考諾肽的合成方法，該方法包括如下步驟：(1)以fmoc氨基型樹(shù)脂為固相載體，按照肽序從c端到n端依次偶聯(lián)所需的25個(gè)保護(hù)氨基酸，得到線(xiàn)性肽樹(shù)脂；(2)將步驟(1)得到的線(xiàn)性肽樹(shù)脂選擇性脫除mmt隨后在樹(shù)脂上氧化形成第一對(duì)二硫鍵得一環(huán)肽樹(shù)脂；(3)將步驟(2)所得一環(huán)肽樹(shù)脂進(jìn)行裂解，脫除有acm保護(hù)基的一環(huán)肽，然后在液相中氧化形成第二對(duì)二硫鍵得二環(huán)肽；(4)將步驟(3)得的二環(huán)肽在脫除acm保護(hù)基的同時(shí)形成第三對(duì)二硫鍵，經(jīng)純化、凍干得齊考諾肽；進(jìn)一步地，三組cys形成二硫鍵，形成二硫鍵的三組cys(1-16、8-20、15-25)中，同組的cys同時(shí)連接mmt、trt、acm三種保護(hù)基中的一種，且不同組的cys所連接保護(hù)基互不相同；進(jìn)一步地，步驟(1)中所述的fmoc氨基型樹(shù)脂包括但不僅限于rinkamide樹(shù)脂、rinkamidembha樹(shù)脂、rinkamideam樹(shù)脂、rinkamidebha樹(shù)脂、或sieber樹(shù)脂，取代度可選范圍為0.3-1.0mmol/g；進(jìn)一步地，步驟(1)中所述的保護(hù)氨基酸分別為：fmoc-ala-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-cys(acm)-oh、fmoc-cys(mmt)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh；進(jìn)一步地，步驟(1)中使用肽鏈偶聯(lián)縮合劑，所述的肽鏈偶聯(lián)縮合劑體系采用dic/a、hbtu/a/b或hatu/c/b體系；進(jìn)一步地，所述a為hobt或6-cl-hobt，b為dipea或tmp，c為hoat；進(jìn)一步地，步驟(2)中所述的脫除cys(mmt)上的mmt保護(hù)基的條件為含0.1-3％tfa的二氯甲烷溶液；氧化第一對(duì)二硫鍵的條件為在固相載體上用dmf、dcm、nmp中任一種試劑做溶劑，加入et3n調(diào)節(jié)ph值為7.5-9.0，攪拌下通入空氣進(jìn)行氧化成環(huán)；進(jìn)一步地，步驟(3)中所述的裂解條件為三氟乙酸與清除劑的混合試劑，其中三氟乙酸的比例不低于85％；裂解粗肽經(jīng)醚沉淀、離心后溶解在甲醇溶液中，加入et3n調(diào)節(jié)ph值為7.5-9，攪拌下通入空氣進(jìn)行氧化形成第二對(duì)二硫鍵得二環(huán)肽；進(jìn)一步地，所述清除劑為水、苯甲醚或硫代苯甲醚；進(jìn)一步地，步驟(4)中所述形成第三對(duì)二硫鍵條件為向步驟(3)所得液體中加入碘單質(zhì)，在15-30℃條件下攪拌環(huán)化形成第三對(duì)二硫鍵，再用抗壞血酸除去多余的碘，溶液經(jīng)純化、凍干得齊考諾肽。本發(fā)明的制備齊考諾肽的合成方法包括以下步驟：(1)以fmoc-氨基樹(shù)脂為固相載體，按照肽序從c端到n端依次偶聯(lián)所需的25個(gè)保護(hù)氨基酸，得到線(xiàn)性全保護(hù)肽樹(shù)脂。其中，形成二硫鍵的三組cys(1-16、8-20、15-25)中，同組的cys同時(shí)連接mmt、trt、acm三種保護(hù)基中的一種，且不同組的cys所連接保護(hù)基互不相同。fmoc-氨基樹(shù)脂包括rinkamide樹(shù)脂、rinkamidembha樹(shù)脂、rinkamideam樹(shù)脂、rinkamidebha樹(shù)脂、或sieber樹(shù)脂，取代度可選范圍為0.3-1.0mmol/g。保護(hù)氨基酸間縮合采用的偶聯(lián)劑可選用hbtu/6-cl-hobt/dipea、hbtu/6-cl-hobt/tmp、dic/hobt、dic/6-cl-hobt、hbtu/hobt/dipea、hbtu/hobt/tmp、hatu/hoat/dipea、hatu/hoat/tmp等組合。(2)將步驟(1)得到的線(xiàn)性肽樹(shù)脂用含0.1-3％tfa的dcm溶液選擇性脫除mmt。隨后直接在樹(shù)脂上空氣氧化形成第一對(duì)二硫鍵得一環(huán)肽樹(shù)脂，氧化時(shí)所選用的溶劑為dmf、dcm或nmp中的任一種或任兩種的混合試劑或上述三種的混合試劑均可。(3)將步驟(2)所得一環(huán)肽樹(shù)脂用含有清除劑的tfa溶液進(jìn)行裂解，清除劑可選用水、硫代苯甲醚、苯甲醚、三異丙基硅烷、苯酚中的一種或幾種照一定比例配成的混合液。裂解脫除acm后所得的溶液用醚沉淀得固體，將該固體溶解在水溶液中，用氨水調(diào)節(jié)ph后，經(jīng)空氣氧化形成第二對(duì)二硫鍵得二環(huán)肽。(4)將步驟(3)所得的二環(huán)肽用5-20倍當(dāng)量的碘在15-30℃下脫除acm保護(hù)基并同時(shí)形成第三對(duì)二硫鍵，得到齊考諾肽粗肽溶液。粗肽溶液經(jīng)hplc純化、凍干得齊考諾肽。在步驟(1)中所述氨基樹(shù)脂優(yōu)選為rinkamidembha樹(shù)脂或rinkamideam樹(shù)脂，優(yōu)選取代度為0.4-0.7mmol/g。脫除fmoc保護(hù)基的條件采用室溫條件下以20％的pip/dmf溶液分兩次反應(yīng)脫除，時(shí)間分別為5min、25min；脫除fmoc保護(hù)基后用dmf洗滌除去其中的pip溶液。偶聯(lián)縮合劑優(yōu)選為dic/6-cl-hobt或hbtu/6-cl-hobt/dipea體系。線(xiàn)性肽偶聯(lián)所用的保護(hù)氨基酸為：fmoc-ala-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-cys(acm)-oh、fmoc-cys(mmt)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh。最終所得的線(xiàn)性肽樹(shù)脂結(jié)構(gòu)如下：h-cys(a)-lys(boc)-gly-lys(boc)-gly-ala-lys(boc)-cys(b)-ser(tbu)-arg(pbf)-leu-met-tyr(tbu)-asp(otbu)-cys(c)-cys(a)-thr-gly-ser(tbu)-cys(b)-arg(pbf)-ser(tbu)-gly-lys(boc)-cys(c)-氨基樹(shù)脂(其中a、b、c三組分別為mmt、trt、acm保護(hù)基中的一種，且不同組的保護(hù)基互不相同)。步驟(2)中脫除cys(mmt)中mmt保護(hù)基所用條件采用含tfa為0.1-3％的dcm溶液，優(yōu)選條件為0.3-1％的tfa/dcm溶液。脫除mmt保護(hù)基后，在樹(shù)脂上直接氧化形成第一對(duì)二硫鍵采用溶劑為dmf、dcm、nmp中的任一種或任兩種的混合試劑或上述三種的混合試劑，優(yōu)選溶劑為nmp。氧化需使用et3n調(diào)節(jié)溶液ph值為7.5-9.0，在攪拌下通入空氣氧化形成第一對(duì)二硫鍵得一環(huán)肽樹(shù)脂，氧化時(shí)間為10-20h。步驟(3)中裂解肽樹(shù)脂所用的裂解液為tfa/硫代苯甲醚/苯甲醚/水按照一定比例配置的混合溶液，要求其中tfa的比例不小于85％，優(yōu)選條件為tfa：硫代苯甲醚：苯甲醚：水＝90：5：2.5：2.5。裂解1g肽樹(shù)脂所用的裂解液為8-20ml，優(yōu)選條件為每克肽樹(shù)脂所用裂解液為10ml。裂解在室溫進(jìn)行，裂解時(shí)間為1.5-3h，優(yōu)選時(shí)間為2h。裂解所得的一環(huán)肽用醚進(jìn)行沉淀，優(yōu)選甲基叔丁基醚。固體經(jīng)離心、洗滌后溶解在水相中，加入氨水調(diào)節(jié)ph值為7.5-9.0，攪拌下通入空氣氧化形成第二對(duì)二硫鍵得二環(huán)肽，氧化時(shí)間為10-20h。步驟(4)中脫除acm保護(hù)基并形成第三對(duì)二硫鍵是在15-30℃下向步驟(3)中的溶液加入5-20倍當(dāng)量碘單質(zhì)，優(yōu)選碘用量為5倍當(dāng)量。攪拌下選擇性脫除cys上的acm保護(hù)基并同時(shí)形成第三對(duì)二硫鍵。反應(yīng)完全后，加入抗壞血酸消耗掉多余的碘直到溶液變?yōu)闊o(wú)色。再經(jīng)hplc純化、凍干得齊考諾肽純品。本發(fā)明的有益效果是：有益效果與已有技術(shù)相比，本發(fā)明先采用固相合成線(xiàn)性肽樹(shù)脂并在樹(shù)脂上選擇性脫除mmt保護(hù)基后在樹(shù)脂上經(jīng)空氣氧化得一環(huán)肽；再將從樹(shù)脂上裂解所得一環(huán)肽在液相中氧化得二環(huán)肽；最后用碘在脫acm保護(hù)基的同時(shí)形成第三對(duì)二硫鍵得目標(biāo)物。本發(fā)明優(yōu)勢(shì)就在于固相方法合成線(xiàn)性肽方法簡(jiǎn)便可控，逐步選擇性脫側(cè)鏈保護(hù)并分步成環(huán)，能避免二硫鍵的錯(cuò)位。采用在液相中分步形成第二對(duì)二硫鍵與第三對(duì)二硫鍵，不僅可以避免在樹(shù)脂上形成二對(duì)二硫鍵會(huì)因肽鏈旋轉(zhuǎn)受限導(dǎo)致成環(huán)收率低也可以避免液相中同時(shí)形成二對(duì)二硫鍵環(huán)的錯(cuò)位環(huán)化。本發(fā)明根據(jù)齊考諾肽的本身特性，巧妙運(yùn)用三種保護(hù)基的特性，分步形成目標(biāo)物的三對(duì)二硫鍵，得到了高純度，高收率，二硫鍵準(zhǔn)確定位的產(chǎn)物，避免了其它方法采用多次高深度tfa裂解、重金屬催化、二硫鍵錯(cuò)位成環(huán)等問(wèn)題。本發(fā)明工藝具有反應(yīng)操作簡(jiǎn)單、產(chǎn)品質(zhì)量高、環(huán)境污染少、成本低等優(yōu)點(diǎn)，具有可觀的經(jīng)濟(jì)實(shí)用價(jià)值，適合工業(yè)化放大生產(chǎn)。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明的齊考諾肽的合成方法的合成路線(xiàn)流程示意圖。具體實(shí)施方式為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明了，下面結(jié)合具體實(shí)施方式并參照附圖，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)該理解，這些描述只是示例性的，而并非要限制本發(fā)明的范圍。下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明中所使用的縮寫(xiě)的含義列于下表中：fmoc9-芴甲氧羰基dcm二氯甲烷dmfn，n-二甲基甲酰胺dicn,n-二異丙基碳二亞胺hobt1-羥基苯并三唑6-cl-hobt6-氯-1-羥基苯并三唑hoat1-羥基-7-偶氮苯并三氮唑(hoat)hbtu苯并三氮唑-n，n，n′，n′-四甲基脲六氟磷酸酯hatu2-(7-氧化苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯dipean，n-二異丙基乙胺tmp2，4，6-三甲基吡啶mtbe甲基叔丁基醚tfa三氟乙酸pip六氫吡啶trt三苯甲基acm乙酰氨甲基mmt4-甲氧基三苯甲基實(shí)施例1：用dic/6-cl-hobt在rinkamidembha樹(shù)脂上合成線(xiàn)性肽樹(shù)脂：(1)稱(chēng)取250g取代值為0.40mmol/g的rinkamidembha樹(shù)脂(即100mmol)于多肽合成儀中，加入1500ml的dmf洗滌樹(shù)脂一次，再加入1500ml的dcm溶脹樹(shù)脂30min，過(guò)濾；再用1500ml的dmf洗滌樹(shù)脂一次；(2)加入脫fmoc試劑(pip/dmf＝20/80)1250ml在室溫下脫保護(hù)兩次，時(shí)間為5min+15min；脫保護(hù)后用dmf洗滌8次；(3)稱(chēng)取300mmol的fmoc-cys(acm)-oh加入到1000ml的dmf中，再加入300mmol的6-cl-hobt，攪拌溶解完全后再加入300mmol的dic；將活化后的溶液加入到反應(yīng)器中與樹(shù)脂室溫反應(yīng)2h；反應(yīng)畢，排出廢液，用1250ml/次的dmf洗滌樹(shù)脂4次；重復(fù)上述步驟(2)與步驟(3)依次偶聯(lián)所需氨基酸最后得得線(xiàn)性肽樹(shù)脂h-cys(trt)-lys(boc)-gly-lys(boc)-gly-ala-lys(boc)-cys(mmt)-ser(tbu)-arg(pbf)-leu-met-tyr(tbu)-asp(otbu)-cys(acm)-cys(trt)-thr-gly-ser(tbu)-cys(mmt)-arg(pbf)-ser(tbu)-gly-lys(boc)-cys(acm)-rinkamidembha樹(shù)脂，最后用dcm與meoh交替洗滌樹(shù)脂三次，室溫空氣晾5h后在30-35℃真空減壓干燥20-25h得線(xiàn)性肽樹(shù)脂。線(xiàn)性肽樹(shù)脂收率不低于90％。實(shí)施例2：用hbtu/6-cl-hobt/dipea在rinkamidembha樹(shù)脂上合成線(xiàn)性肽樹(shù)脂：(1)稱(chēng)取250g取代值為0.40mmol/g的rinkamidembha樹(shù)脂(即100mmol)于多肽合成儀中，加入1500ml的dmf洗滌樹(shù)脂一次，再加入1500ml的dcm溶脹樹(shù)脂30min，過(guò)濾；再用1500ml的dmf洗滌樹(shù)脂一次；(2)加入脫fmoc試劑(pip/dmf＝20/80)1250ml在室溫下脫保護(hù)兩次，時(shí)間為5min+15min；脫保護(hù)后用dmf洗滌8次；(3)稱(chēng)取300mmol的fmoc-cys(acm)-oh加入到1000ml的dmf中，再加入300mmol的6-cl-hobt以及300mmol的dipea，最后加入300mmol的hbtu，攪拌5-10min使其完全溶解；將溶液加入到反應(yīng)器中與樹(shù)脂室溫反應(yīng)2h；反應(yīng)畢，排出廢液，用1250ml/次的dmf洗滌樹(shù)脂4次；重復(fù)上述步驟(2)與步驟(3)依次偶聯(lián)所需氨基酸最后得得線(xiàn)性肽樹(shù)脂h-cys(trt)-lys(boc)-gly-lys(boc)-gly-ala-lys(boc)-cys(mmt)-ser(tbu)-arg(pbf)-leu-met-tyr(tbu)-asp(otbu)-cys(acm)-cys(trt)-thr-gly-ser(tbu)-cys(mmt)-arg(pbf)-ser(tbu)-gly-lys(boc)-cys(acm)-rinkamidembha樹(shù)脂，最后用dcm與meoh交替洗滌樹(shù)脂三次，室溫空氣晾5h后在30-35℃真空減壓干燥20-25h得線(xiàn)性肽樹(shù)脂。線(xiàn)性肽樹(shù)脂收率不低于90％。實(shí)施例3：用dic/6-cl-hobt在rinkamideam樹(shù)脂上合成線(xiàn)性肽樹(shù)脂：(1)稱(chēng)取200g取代值為0.50mmol/g的rinkamideam樹(shù)脂(即100mmol)于多肽合成儀中，加入1200ml的dmf洗滌樹(shù)脂一次，再加入1200ml的dcm溶脹樹(shù)脂30min，過(guò)濾；再用1200ml的dmf洗滌樹(shù)脂一次；(2)加入脫fmoc試劑(pip/dmf＝20/80)1200ml在室溫下脫保護(hù)兩次，時(shí)間為5min+15min；脫保護(hù)后用dmf洗滌8次；(3)稱(chēng)取300mmol的fmoc-cys(trt)-oh加入到1000ml的dmf中，再加入300mmol的6-cl-hobt，攪拌溶解完全后再加入300mmol的dic；將活化后的溶液加入到反應(yīng)器中與樹(shù)脂室溫反應(yīng)2h；反應(yīng)畢，排出廢液，用1200ml/次的dmf洗滌樹(shù)脂4次；重復(fù)上述步驟(2)與步驟(3)依次偶聯(lián)所需氨基酸最后得得線(xiàn)性肽樹(shù)脂h-cys(acm)-lys(boc)-gly-lys(boc)-gly-ala-lys(boc)-cys(mmt)-ser(tbu)-arg(pbf)-leu-met-tyr(tbu)-asp(otbu)-cys(trt)-cys(acm)-thr-gly-ser(tbu)-cys(mmt)-arg(pbf)-ser(tbu)-gly-lys(boc)-cys(trt)-rinkamidembha樹(shù)脂，最后用dcm與meoh交替洗滌樹(shù)脂三次，室溫空氣晾5h后在30-35℃真空減壓干燥20-25h得線(xiàn)性肽樹(shù)脂。線(xiàn)性肽樹(shù)脂收率不低于90％。實(shí)施例4：用hbtu/6-cl-hobt/dipea在rinkamideam樹(shù)脂上合成線(xiàn)性肽樹(shù)脂：(1)稱(chēng)取200g取代值為0.50mmol/g的rinkamideam樹(shù)脂(即100mmol)于多肽合成儀中，加入1200ml的dmf洗滌樹(shù)脂一次，再加入1200ml的dcm溶脹樹(shù)脂30min，過(guò)濾；再用1200ml的dmf洗滌樹(shù)脂一次；(2)加入脫fmoc試劑(pip/dmf＝20/80)1200ml在室溫下脫保護(hù)兩次，時(shí)間為5min+15min；脫保護(hù)后用dmf洗滌8次；(3)稱(chēng)取300mmol的fmoc-cys(trt)-oh加入到1000ml的dmf中，再加入300mmol的6-cl-hobt以及300mmol的dipea，最后加入300mmol的hbtu，攪拌5-10min使其完全溶解；將活化后的溶液加入到反應(yīng)器中與樹(shù)脂室溫反應(yīng)2h；反應(yīng)畢，排出廢液，用1200ml/次的dmf洗滌樹(shù)脂4次；重復(fù)上述步驟(2)與步驟(3)依次偶聯(lián)所需氨基酸最后得得線(xiàn)性肽樹(shù)脂h-cys(acm)-lys(boc)-gly-lys(boc)-gly-ala-lys(boc)-cys(mmt)-ser(tbu)-arg(pbf)-leu-met-tyr(tbu)-asp(otbu)-cys(trt)-cys(acm)-thr-gly-ser(tbu)-cys(mmt)-arg(pbf)-ser(tbu)-gly-lys(boc)-cys(trt)-rinkamidembha樹(shù)脂，最后用dcm與meoh交替洗滌樹(shù)脂三次，室溫空氣晾5h后在30-35℃真空減壓干燥20-25h得線(xiàn)性肽樹(shù)脂。線(xiàn)性肽樹(shù)脂收率不低于90％。實(shí)施例5：合成一環(huán)肽樹(shù)脂：將上述實(shí)施例1所得已干燥的線(xiàn)性肽樹(shù)脂750g加入多肽合成儀中，加入3000ml含0.5％tfa的dcm溶液，室溫反應(yīng)5min排出廢液。重復(fù)處理3次以確保mmt保護(hù)基能完全脫除。用2000ml的dcm洗滌樹(shù)脂三次后，加入2000mlnmp溶液溶脹樹(shù)脂并加入et3n調(diào)節(jié)溶液ph值保持在7.5-9.0之間，室溫下通空氣攪拌氧化反應(yīng)8h，取小量樹(shù)脂裂解監(jiān)測(cè)環(huán)化情況。待反應(yīng)結(jié)束后過(guò)濾除去廢液。用meoh洗滌樹(shù)脂三次，室溫空氣晾5h后在30-35℃真空減壓干燥20-25h得一環(huán)肽樹(shù)脂，該步反應(yīng)基本定量完成。實(shí)施例6：合成二環(huán)肽：取上述實(shí)施例3所得樹(shù)脂250g慢慢加入到2500ml預(yù)先冷至5-15℃的裂解液(tfa：硫代苯甲醚：苯甲醚：水＝90：5：2.5：2.5)中，保持裂解液溫度在20-30℃攪拌反應(yīng)2h。過(guò)濾，樹(shù)脂用100ml/次的tfa洗滌3次。合并裂解液入洗滌樹(shù)脂的tfa液，真空減壓濃縮(20-30℃)至1l體積，將濃縮液加入預(yù)先冷至0℃的5.0l的mtbe中攪拌沉淀，靜置半小時(shí)后過(guò)濾，濾餅用4.0l/次的mtbe洗滌6次。固體在通風(fēng)柜中干燥3h后真空減壓干燥24h得固體80g。本步收率92.4％。將上述固體溶解于40l的甲醇：水＝4：1的溶液中，用氨水調(diào)節(jié)ph值為7.5-9.0之間，在室溫下通入空氣攪拌環(huán)化反應(yīng)10-20h。用hplc監(jiān)測(cè)反應(yīng)情況，反應(yīng)畢停止通空氣并關(guān)閉攪拌得二環(huán)肽溶液。實(shí)施例7：向?qū)嵤├?的溶液中慢慢加入hoac調(diào)節(jié)ph值為6.0-7.0，保持溫度在15-30℃條件下加入5倍當(dāng)量的碘單質(zhì)攪拌反應(yīng)2h。反應(yīng)畢，向反應(yīng)溶液中加入抗壞血酸直至溶液變?yōu)闊o(wú)色。將溶液過(guò)濾后用制備色譜進(jìn)行分離，色譜條件如下：流動(dòng)相a：20mm的乙酸銨(ph＝3.5)溶液；流動(dòng)相b：乙腈洗脫梯度：4％b(60min)14％b制備柱填料：c18硅膠柱收集主峰所得目標(biāo)物餾分，濃縮后凍干得齊考諾肽不低于28g，凍干粉hplc純度大于99.0％。上述實(shí)施例只是為了說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的是在于讓本領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡是根據(jù)本
發(fā)明內(nèi)容的實(shí)質(zhì)所作出的等效的變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)12