本發(fā)明屬于分子診斷領(lǐng)域，涉及一種用于多發(fā)性骨髓瘤診斷的分子標(biāo)志物，具體涉及骨髓瘤細(xì)胞中的分子標(biāo)志物bub1b基因在制備診斷多發(fā)性骨髓瘤的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

多發(fā)性骨髓瘤(multiplemyeloma,mm)是一種漿細(xì)胞異常增生的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，約占所有血液系統(tǒng)惡性腫瘤的10％，隨著我國(guó)人口的老齡化，mm的發(fā)病率都在上升。多發(fā)性骨髓瘤常伴有多發(fā)性溶骨性損害、高鈣血癥、貧血、腎臟損害等。由于正常免疫球蛋白的生成受抑制，因此容易出現(xiàn)各種細(xì)菌性感染。

目前多發(fā)性骨髓瘤的診斷主要依靠骨髓克隆性漿細(xì)胞比例和(或)活組織病理學(xué)檢查作為mm診斷基礎(chǔ)。2014年，國(guó)際骨髓瘤工作組(imwg)對(duì)mm診斷標(biāo)注進(jìn)行了修訂，定義骨髓克隆性漿細(xì)胞比例≥10％和/或活組織病理學(xué)檢查證實(shí)為漿細(xì)胞瘤；同時(shí)伴有以下一種或多種情況：高鈣血癥、腎功能不全、貧血和溶骨性骨損害；將骨髓克隆性漿細(xì)胞比例≥60％、受累血清游離輕鏈與未受累血清游離輕鏈比值≥100、mri檢查發(fā)現(xiàn)局灶性病變部位>1處(每處檢查的病灶直徑≥5mm)作為極高危無(wú)癥狀mm生物學(xué)標(biāo)志物納入mm診斷標(biāo)準(zhǔn)。此外，mri、低劑量全身ct、fdg/pet及pet/ct等現(xiàn)代影像學(xué)技術(shù)被納入檢查輔助方法。

到目前為止，很多生物標(biāo)志物都不能很好的用來(lái)作為臨床診斷標(biāo)志。目前臨床常用的診斷標(biāo)志物是單克隆免疫球蛋白(m蛋白)，在mm患者血清中m蛋白所屬免疫球蛋白顯著增高而非m蛋白所屬免疫球蛋白含量顯著下降。但修訂后的mm診斷標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)調(diào)單克隆蛋白水平并不是診斷活動(dòng)性mm所必需。

綜上，目前多發(fā)性骨髓瘤診斷的方法復(fù)雜、檢查項(xiàng)目多，缺少一種可靠、方便的臨床診斷方法。新的研究表明，在多發(fā)性骨髓瘤患者中，檢出bub1b基因的表達(dá)顯著增高，bub1b基因的表達(dá)水平與骨髓瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)或抑制有直接關(guān)系。表明bub1b是一種高危的骨髓瘤基因，可為多發(fā)性骨髓瘤的臨床診斷提供可靠的判斷。

bub1b是有絲分裂檢驗(yàn)點(diǎn)蛋白之一，本課題組證實(shí)在多發(fā)性骨髓瘤患者中的表達(dá)異常增高。其在mm中的異常表達(dá)通過(guò)影響染色體的不穩(wěn)定性以及有絲分裂的過(guò)程等促進(jìn)腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后。因此，bub1b的表達(dá)水平為腫瘤診斷、評(píng)估、預(yù)后等提供一個(gè)重要指標(biāo)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

解決的技術(shù)問(wèn)題：本發(fā)明提供了一種分子標(biāo)志物bub1b基因的應(yīng)用,可用于多發(fā)性骨髓瘤的診斷。相比于目前的診斷方法，大大減少了檢查項(xiàng)目，降低成本；配合輔助診斷方法，準(zhǔn)確率高；具有及時(shí)性，特異性，靈敏性。

技術(shù)方案：骨髓瘤細(xì)胞中的分子標(biāo)志物bub1b基因，序列如seqidno.1所示。

骨髓瘤細(xì)胞中的分子標(biāo)志物bub1b蛋白，序列如seqidno.2所示。

骨髓瘤細(xì)胞中的分子標(biāo)志物bub1b基因在制備診斷多發(fā)性骨髓瘤的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

上述產(chǎn)品包括：通過(guò)rt-pcr、實(shí)時(shí)定量pcr、免疫檢測(cè)、原位雜交、芯片或高通量測(cè)序平臺(tái)檢測(cè)bub1b基因表達(dá)水平以診斷多發(fā)性骨髓瘤的產(chǎn)品。

上述用rt-pcr診斷多發(fā)性骨髓瘤的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增bub1b基因的引物；所述用實(shí)時(shí)定量pcr診斷多發(fā)性骨髓瘤的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增bub1b基因的引物；所述用免疫檢測(cè)診斷多發(fā)性骨髓瘤的產(chǎn)品包括：與bub1b蛋白特異性結(jié)合的抗體；所述用原位雜交診斷多發(fā)性骨髓瘤的產(chǎn)品包括：與bub1b基因的核酸序列雜交的探針；所述用芯片診斷多發(fā)性骨髓瘤的產(chǎn)品包括：蛋白芯片和基因芯片，其中蛋白芯片包括與bub1b蛋白特異性結(jié)合的抗體，基因芯片包括與bub1b基因的核酸序列雜交的探針。

上述用實(shí)時(shí)定量pcr診斷多發(fā)性骨髓瘤的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增bub1b基因的引物，序列如：seqidno.3和seqidno.4所示。

一種用于診斷多發(fā)性骨髓瘤的工具，該工具能夠檢測(cè)樣本中bub1b基因的表達(dá)。

上述工具包括芯片、試劑盒、試紙或高通量測(cè)序平臺(tái)。

上述芯片包括基因芯片或蛋白質(zhì)芯片，所述基因芯片包括固相載體以及固定在固相載體的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括用于檢測(cè)bub1b基因轉(zhuǎn)錄水平的針對(duì)bub1b基因的寡核苷酸探針；所述蛋白質(zhì)芯片包括固相載體以及固定在固相載體的bub1b蛋白的特異性抗體；所述試劑盒包括基因檢測(cè)試劑盒和蛋白免疫檢測(cè)試劑盒；所述基因檢測(cè)試劑盒包括用于檢測(cè)bub1b基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑；所述蛋白免疫檢測(cè)試劑盒包括bub1b蛋白的特異性抗體；所述試紙包括用于檢測(cè)bub1b基因轉(zhuǎn)錄水平的試紙；所述高通量測(cè)序平臺(tái)包括用于檢測(cè)bub1b基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑。

上述檢測(cè)bub1b基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑包括針對(duì)bub1b基因的引物和/或探針。

有益效果：本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了bub1b基因表達(dá)與多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)。通過(guò)受試者中bub1b的表達(dá)，來(lái)判斷受試者是否患有多發(fā)性骨髓瘤或者判斷受試者是否存在患有多發(fā)性骨髓瘤的風(fēng)險(xiǎn)，為臨床醫(yī)師提供診斷的依據(jù)和個(gè)性化預(yù)防方案或治療方案。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種新的生物標(biāo)記物-bub1b基因，相比傳統(tǒng)的檢測(cè)手段，基因診斷具有特異性好、靈敏度高、針對(duì)性強(qiáng)、診斷快速等優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)多發(fā)性骨髓瘤的早期診斷，降低多發(fā)性骨髓瘤的死亡率。

附圖說(shuō)明

圖1顯示利用基因芯片檢測(cè)bub1b基因在多發(fā)性骨髓瘤患者和正常人中的表達(dá)差異圖。分析22例正常骨髓，44例意義未明的單克隆丙種球蛋白疾病(monoclonalgammopathyofundeterminedsignificance，mgus，mm前體疾病)，351例mm初診樣本，發(fā)現(xiàn)bub1b基因的表達(dá)水平在mm患者中要明顯高于正常以及mgus樣本。

圖2顯示利用qpcr檢測(cè)bub1b基因在多發(fā)性骨髓瘤患者和正常人中的表達(dá)差異圖。

圖3顯示利用免疫組化染色分析bub1b在多發(fā)性骨髓瘤患者中的表達(dá)水平圖，與正常漿細(xì)胞相比，bub1b在mm樣本中顯著增高。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(newyork：coldspringharborlaboratorypress，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

本發(fā)明提供了檢測(cè)bub1b基因表達(dá)的產(chǎn)品在制備診斷多發(fā)性骨髓瘤的工具中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，上面所提到的檢測(cè)bub1b基因表達(dá)的產(chǎn)品包括：通過(guò)rt-pcr，實(shí)時(shí)定量pcr、免疫檢測(cè)、原位雜交、芯片或高通量測(cè)序平臺(tái)等檢測(cè)bub1b基因表達(dá)水平以診斷多發(fā)性骨髓瘤的產(chǎn)品。

進(jìn)一步，所述用rt-pcr診斷多發(fā)性骨髓瘤的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增bub1b基因的引物；所述用實(shí)時(shí)定量pcr診斷多發(fā)性骨髓瘤的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增bub1b基因的引物；所述用免疫檢測(cè)診斷多發(fā)性骨髓瘤的產(chǎn)品包括：與bub1b蛋白特異性結(jié)合的抗體；所述用原位雜交診斷多發(fā)性骨髓瘤的產(chǎn)品包括：與bub1b基因的核酸序列雜交的探針；所述用芯片診斷多發(fā)性骨髓瘤的產(chǎn)品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括與bub1b蛋白特異性結(jié)合的抗體，基因芯片包括與bub1b基因的核酸序列雜交的探針。

在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述用實(shí)時(shí)定量pcr診斷多發(fā)性骨髓瘤的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增bub1b基因的引物的序列如：seqidno.3和seqidno.4所示。

優(yōu)選地，所述診斷工具包括芯片、試劑盒、試紙或高通量測(cè)序平臺(tái)。其中，高通量測(cè)序平臺(tái)是一種特殊的診斷工具，檢測(cè)bub1b基因表達(dá)的產(chǎn)品可以應(yīng)用于該平臺(tái)實(shí)現(xiàn)對(duì)bub1b基因的表達(dá)情況的檢測(cè)。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，對(duì)一個(gè)人的基因表達(dá)譜的構(gòu)建將成為十分便捷的工作。通過(guò)對(duì)比疾病患者和正常人群的基因表達(dá)譜，容易分析出哪個(gè)基因的異常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測(cè)序中獲知bub1b基因的異常與多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)也屬于bub1b基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

本發(fā)明還提供了一種多發(fā)性骨髓瘤的工具，所述產(chǎn)品包括芯片、試劑盒、試紙、或高通量測(cè)序平臺(tái)。

其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片；所述基因芯片包括固相載體以及固定在固相載體的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括用于檢測(cè)bub1b基因轉(zhuǎn)錄水平的針對(duì)bub1b基因的寡核苷酸探針；所述蛋白質(zhì)芯片包括固相載體以及固定在固相載體的bub1b蛋白的特異性抗體；所述基因芯片可用于檢測(cè)包括bub1b基因在內(nèi)的多個(gè)基因(例如，與多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)的多個(gè)基因)的表達(dá)水平。所述蛋白質(zhì)芯片可用于檢測(cè)包括bub1b蛋白在內(nèi)的多個(gè)蛋白質(zhì)(例如與多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)的多個(gè)蛋白質(zhì))的表達(dá)水平。通過(guò)將多個(gè)與多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)的標(biāo)志物同時(shí)檢測(cè)，可大大提高多發(fā)性骨髓瘤診斷的準(zhǔn)確率。

其中，所述試劑盒包括基因檢測(cè)試劑盒和蛋白免疫檢測(cè)試劑盒；所述基因檢測(cè)試劑盒包括用于檢測(cè)bub1b基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑；所述蛋白免疫檢測(cè)試劑盒包括bub1b蛋白的特異性抗體。進(jìn)一步，所述試劑包括使用rt-pcr、實(shí)時(shí)定量pcr、免疫檢測(cè)、原位雜交或芯片方法檢測(cè)bub1b基因表達(dá)水平過(guò)程中所需的試劑。優(yōu)選地，所述試劑包括針對(duì)bub1b基因的引物和/或探針。根據(jù)基因的核苷酸序列信息容易設(shè)計(jì)出可以用于檢測(cè)bub1b基因表達(dá)水平的引物和探針。

所述高通量測(cè)序平臺(tái)包括檢測(cè)bub1b基因表達(dá)水平的試劑。

所述試紙包括試紙載體和固定在試紙載體上的寡核苷酸，所述寡核苷酸能夠檢測(cè)bub1b基因的轉(zhuǎn)錄水平。

與bub1b基因的核酸序列雜交的探針可以是dna、rna、dna-rna嵌合體、pna或其他衍生物。所述探針的長(zhǎng)度沒(méi)有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結(jié)合，任何長(zhǎng)度都可以。所述探針的長(zhǎng)度可短至25、20、15、13或10個(gè)堿基長(zhǎng)度。同樣，所述探針的長(zhǎng)度可長(zhǎng)至60、80、100、150、300個(gè)堿基對(duì)或更長(zhǎng)，甚至整個(gè)基因。由于不同的探針長(zhǎng)度對(duì)雜交效率、信號(hào)特異性有不同的影響，所述探針的長(zhǎng)度通常至少是14個(gè)堿基對(duì)，最長(zhǎng)一般不超過(guò)30個(gè)堿基對(duì)，與目的核苷酸序列互補(bǔ)的長(zhǎng)度以15-25個(gè)堿基對(duì)最佳。所述探針自身互補(bǔ)序列最好少于4堿基對(duì)，以免影響雜交效率。

進(jìn)一步，所述bub1b蛋白的特異性抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體。所述bub1b蛋白的特異性抗體包括完整的抗體分子、抗體的任何片段或修飾(例如：嵌合抗體，scfv、fab、f(ab’)2、fv等)。只要所述片段能夠保留與bub1b蛋白的結(jié)合能力即可。用于蛋白質(zhì)水平的抗體的制備時(shí)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且本發(fā)明可以使用任何方法來(lái)制備所述抗體。

本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述針對(duì)bub1b基因的引物序列如下：正向引物序列如seqidno.3所示，反向引物序列如seqidno.4所示。

用于診斷多發(fā)性骨髓瘤的bub1b基因及其表達(dá)產(chǎn)物的來(lái)源包括但不限于骨髓、血液、組織液、尿液、唾液等可以獲得基因組dna的體液。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，用于診斷多發(fā)性骨髓瘤的bub1b基因及其表達(dá)產(chǎn)物的來(lái)源是骨髓。

本發(fā)明的上下文中，“bub1b基因”包括bub1b基因以及bub1b基因的任何功能等同物的多核苷酸。bub1b基因包括與目前國(guó)際公共核酸序列g(shù)enebank中bub1b基因(nc_000015.10)dna序列具有70％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的dna序列；

優(yōu)選地，bub1b基因的編碼序列包括以下任意一種：

(1)序列表中seqidno.1所示的dna序列；

(2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的dna序列雜交且編碼相同蛋白質(zhì)的dna序列；

(3)與(1)或(2)限定的dna序列具有70％、優(yōu)選地，90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的dna分子。

在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述bub1b基因的編碼序列是seqidno.1所示的dna序列。

在本發(fā)明的上下文中，bub1b基因表達(dá)產(chǎn)物包括bub1b蛋白以及bub1b蛋白的部分肽。所述bub1b蛋白的部分肽含有與多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)的功能域。

“bub1b蛋白”包括bub1b蛋白以及bub1b蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括bub1b蛋白保守性變異蛋白質(zhì)、或其活性片段，或其活性衍生物，等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與bub1b的dna雜交的dna所編碼的蛋白質(zhì)。

優(yōu)選地，bub1b蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白質(zhì)：

(1)由序列表中seqidno.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

(2)將seqidno.2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與seqidno.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由seqidno.2所示的氨基酸序列衍生物的蛋白質(zhì)。取代、缺失或者添加的氨基酸的個(gè)數(shù)通常為1-50個(gè)，較佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè)。

(3)與seqidno.2所示的氨基酸序列至少具有80％同源性(又稱(chēng)為序列統(tǒng)一性)，更優(yōu)選地，與seqidno.2所示的氨基酸序列至少約90％至95％的同源性，常為96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列構(gòu)成的多肽。

在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述bub1b蛋白是具有seqidno.2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。

通常，已知的是，一個(gè)蛋白質(zhì)中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的修飾不會(huì)影響蛋白質(zhì)的功能。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)可改變單個(gè)氨基酸或小百分比的氨基酸或?qū)Π被嵝蛄械膫€(gè)別添加、缺失、插入、替換是保守修飾，其中蛋白質(zhì)的改變產(chǎn)生具有相似功能的蛋白質(zhì)。提供功能相似的氨基酸的保守替換表是本領(lǐng)域公知的。

通過(guò)添加一個(gè)氨基酸或多個(gè)氨基酸殘基修飾的蛋白質(zhì)的例子是bub1b蛋白的融合蛋白。對(duì)于與bub1b蛋白融合的肽或者蛋白質(zhì)沒(méi)有限制，只要所得的融合蛋白保留bub1b蛋白的生物活性即可。

本發(fā)明的bub1b蛋白也包括對(duì)seqidno.2所示的氨基酸序列的非保守修飾，只要經(jīng)過(guò)修飾的蛋白質(zhì)仍然能夠保留bub1b蛋白的生物學(xué)活性即可。在此類(lèi)修飾蛋白質(zhì)中突變的氨基酸數(shù)目通常是10個(gè)或者更少，例如6個(gè)或者更少，例如3個(gè)或者更少。

在本發(fā)明的上下文中，“多發(fā)性骨髓瘤”既包括判斷受試者是否已經(jīng)患有多發(fā)性骨髓瘤、也包括受試者是否存在患有多發(fā)性骨髓瘤的風(fēng)險(xiǎn)。

實(shí)施例1篩選多發(fā)性骨髓瘤患者和正常人中差異表達(dá)的基因

1、研究對(duì)象：

收集多發(fā)性骨髓瘤患者8例，正常人8例

多發(fā)性骨髓瘤患者的納入標(biāo)準(zhǔn)：所有多發(fā)性骨髓瘤的診斷根據(jù)who診斷多發(fā)性骨髓瘤標(biāo)準(zhǔn)，所有初治多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞標(biāo)本獲得病人的知情同意。

多發(fā)性骨髓瘤患者的排除標(biāo)準(zhǔn)：轉(zhuǎn)移癌，反應(yīng)性漿細(xì)胞增多癥和未定性的單克隆免疫球蛋白病。

2、骨髓中總rna的提取

(1)骨髓單個(gè)核細(xì)胞的分離：向收集到的骨髓標(biāo)本中加入3倍體積的紅細(xì)胞裂解液，用滴管反復(fù)吹打混勻后于冰上放置10～15min，使骨髓標(biāo)本中的紅細(xì)胞充分裂解；1200rpm/min離心5min，棄上清，pbs洗滌細(xì)胞1次。棄上清，加入1mlpbs吹打混勻后轉(zhuǎn)移至1.5mlep管中，1200rpm/min離心5min，棄上清。每個(gè)樣本加1mltrizol，吹打混勻。

(2)每1mltrizol加入氯仿200μl，充分混勻劇烈震蕩15秒，室溫靜置10min等待分層。

(3)于4℃12000rpm/min離心15min。離心后可見(jiàn)管中混合物液面分為3層，最上層為無(wú)色水相，含有rna；中間層為白色絮狀，含有蛋白層與dna；最下層為紅色的酚-氯仿有機(jī)相。

取上層水相約400μl至另一ep管中，注意避免吸入中間的蛋白層，每管加入等體積異丙醇，輕輕上下顛倒混勻，室溫靜置10min，于4℃12000rpm/min離心10min，可見(jiàn)管底白色沉淀。

棄上清，加入-20℃預(yù)冷的75％depc酒精1ml，懸起沉淀，4℃7500rpm/min離心5min。

棄上清，室溫放置10-20min風(fēng)干沉淀，依據(jù)沉淀量的多少酌情加入depc水溶解沉淀。-80℃冰箱保存。

3、rna樣品的質(zhì)量分析

紫外分光光度計(jì)檢測(cè)rna樣品，od260/od280為1.8-2.0。

4、基因芯片雜交及掃描

采用affymetrixu133plus2.0microarrays檢測(cè)rna水平。多發(fā)性骨髓瘤患者組的數(shù)據(jù)可在nih基因表達(dá)綜合(geo)下gse2658檢索號(hào)查得，正常組和未定性的單克隆免疫球蛋白病的基因芯片數(shù)據(jù)在gse5900下。

5、芯片數(shù)據(jù)處理與分析

基因芯片的數(shù)據(jù)分析基于gco1.1軟件(affymetrix)，包含對(duì)與疾病相關(guān)相關(guān)的生存的單變量的對(duì)數(shù)等級(jí)檢測(cè)。對(duì)于兩組比值的自然對(duì)數(shù)絕對(duì)值大于2.0或小于0.5的基因作為差異表達(dá)基因。

6、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用spss13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間差異比較采用單因素方差分析法，p＜0.05有顯著意義。

7、結(jié)果

如圖1所示，分析22例正常骨髓，44例意義未明的單克隆丙種球蛋白疾病(monoclonalgammopathyofundeterminedsignificance，mgus，mm前體疾病)，351例mm初診病人漿細(xì)胞基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)bub1b基因的表達(dá)水平在mm患者中要明顯高于正常以及mgus樣本)，與正常人相比，多發(fā)性骨髓瘤患者bub1b基因的mrna水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。

實(shí)施例2qpcr實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證多發(fā)性骨髓瘤患者和正常人中差異表達(dá)的基因

1、研究對(duì)象

篩選標(biāo)準(zhǔn)同實(shí)施例1，多發(fā)性骨髓瘤患者46例，正常人66例。

2、骨髓中總rna的提取

步驟同實(shí)施例1。

3、逆轉(zhuǎn)錄

根據(jù)takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行rna逆轉(zhuǎn)錄。采用10μl反應(yīng)體系，分別加入5×primescriptrtmastermix2μl，總rna0.5μg，加一定量rnasefreewater至10μl。37℃反應(yīng)15min，85℃反應(yīng)5s。產(chǎn)物cdna置-20℃冰箱保存。

4、qpcr

采用10μl反應(yīng)體系，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，加樣過(guò)程避光。配制以下反應(yīng)體系：2×sybgreenmastermix5μl，正向引物0.5μl，反向引物(5pm)0.5μl，反向引物(5pm)0.5μl，模板cdna1μl，ddh2o3μl。擴(kuò)增foxm1基因的正向引物序列為5’-gcaccgacaattccaagctc-3’(seqidno.3)，反向引物序列為5’-tgtgcttcgttgtggtacaga-3’(seqidno.4)；擴(kuò)增gapdh基因的正向引物序列為5’-gcaccgtcaaggctgagaac-3’(seqidno.5)，反向引物序列為5’-tggtgaagacgccagtgga-3’(seqidno.6)，各項(xiàng)操作均于冰上進(jìn)行。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃1min，95℃15s，60℃15s，72℃30s；共40個(gè)循環(huán)。以sybrgreen作為熒光標(biāo)記物，在lightcycler熒光實(shí)時(shí)定量pcr儀上進(jìn)行反應(yīng)，通過(guò)融解曲線分析和電泳確定目的條帶，△△ct法進(jìn)行相對(duì)定量。

5、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來(lái)表示，采用spss13.0統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩者之間差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)p＜0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

6、結(jié)果

結(jié)果如圖2所示，與正常人相比，多發(fā)性骨髓瘤患者的bub1b基因的mrna水平顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，結(jié)果同基因芯片實(shí)驗(yàn)。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>南京中醫(yī)藥大學(xué)

<120>分子標(biāo)志物bub1b基因的應(yīng)用

<130>

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>60128

<212>dna

<213>人源

<400>1

aggggcgtggccacgtcgaccgcgcgggaccgttaaatttgaaacttggcggctaggggt60

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agcaggacgaggacctgagccaggaatgcaggatggcggcggtgaagaaggaagggggtg240

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cccagcggaacaaagagtttggaagttgcaatgttgtctgtttgtaactcagctcagcca540

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ccttacgtggttctgggggaattcaaagtatttgttaagtaactgcttccaaataagcgc660

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atagagatctaaattatgccaataacatagagatctaaaagcctttttctgcatgtttgc780

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aacaagtatttttttggctaagctctgagtgcagcaaatatacagacacaaaaatctcaa960

ccctcatgaagcttaagttctggcatgggatgaaggtgggggagtcagacaataaagaca1020

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tttaaaaagtttatataaagtgtgtatgataatcatataaatgcatgacaataaacaatg2460

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acatgtcattttgattaaagtcatagtttccaagaagctgtctccaacgagttttcagtg2880

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gcttcgacccctgaacccaagcaatgctcccacctcagtcttctaagtagccacgaccat3360

gggcgtgtaccaccacgcctggctaatttttcactttttgtagagatgggggtcttccta3420

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aagtggtaggattacaggcatgagctaccacatccggcactaattttaaattaaactaga3540

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tataacacttttgttcccttcttttctttctgccttaagccctattcatttttctttttt3660

tttttttttttaaagaaagaggcagggtcttgctatgttgcccaggctggtatcaaactc3720

ctggctcaagaaatcctcccacttcggcctcacaaagtggtgggattacaggtgtgagcc3780

accgcacatagccatgccctattcttatagtactgtctacgatatccttgccaagttgtc3840

ttctatcaggcaatactgtagccataaacttgaaaaacagctaacaaagaagcttaggca3900

tataataataataataattatgtgtcagtccactatattcaacccaagaccatgaataat3960

cacctttcggaagacatttacaataatctagtgctataatagtcaatgttggtatgagat4020

ttacatttgtttccttcttcacagtgaagccatgtccctggagggagatgaatgggaact4080

gagtaaagaaaatgtacaacctttaaggcaagggcggatcatgtccacgcttcagggagc4140

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gctgagtctcaacctgtcgtcattcatcctaaatgttgtagataacgtgggtgtggatcc4260

atgagagatggcataatgagtacttttcaaaaattggtagtatgagaatctgttctctac4320

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ttaactaatacatgttttgataaatatgctttttaaaaaaaaaggtaaatcagagtatca4740

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ttgggattataatgcaatgactattcttattcatctctttggatttttttttttttttta4860

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tcccaaagtgctgggattacaggcgtaagctaccgcactcagcctcattcatcatatttt5160

ttcatgttacatgcatcagtagattgctctttttattgctgaataggatttcatttattt5220

attcaccaattgatgaatatttagattcttccagttttgtgctttataaataatgttgct5280

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gtatagattcaagtttccctgattcaagtttcaggagcatagattcaagattccctgaat6060

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ttagcattttttgtgtcctcttcaggagacttttgcctaccccaaagtgacaaagttact6300

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ttgttcttttcaaaattgctttagttattcttggtcctttgcctttgcaaacaaagtttg7020

aaatcatcttgtcaatttctagaaaagagcctactgaaaaagaaaaaaaaaaaaaaaggc7080

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aatacaaaattagccgggcgtggtggcgcatgcctgtaatcccagctactcgggaggctg7260

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