本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物提取及應(yīng)用領(lǐng)域，涉及一種貽貝多糖及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

脂質(zhì)代謝紊亂導(dǎo)致的高脂血癥與人類健康的頭號殺手心腦血管疾病的發(fā)生有著密切的關(guān)系，是威脅人類生命健康的最重要的致病因素之一。目前市場上流行的降血脂藥物以他汀類藥物應(yīng)用最廣、療效最好，約占調(diào)血脂藥物銷售總額的80%以上。但他汀類藥物存在與肝、腎及體內(nèi)代謝障礙相關(guān)的不良反應(yīng)，另外，還常見有胃腸反應(yīng)、鼻炎、鼻竇炎、頭痛、咽痛、流感綜合癥、關(guān)節(jié)炎、胸痛、失眠、肌肉毒性等毒副作用。這使得對他汀類藥物替代產(chǎn)品的需求極為迫切。

多糖是所有生物有機體的重要組成部分，具有獨特的生物學(xué)活性，能提高機體的免疫功能，并參與一切重要的生命活動過程，具有廣泛的免疫增強、降血脂、抗腫瘤等作用，同時不良反應(yīng)又很小。近年來隨著開發(fā)海洋資源的興起，人們對海洋生物多糖產(chǎn)生了極大的興趣,發(fā)現(xiàn)了許多具有生物活性的多糖類物質(zhì)，包括具有抗病毒活性的硫酸多糖、促進骨愈合的海洋細菌多糖等。

貽貝多糖來源于海洋動物貽貝（mytilussp.）。貽貝是海洋貝類養(yǎng)殖中的重要種類，又名海虹，俗稱“海中雞蛋”，具有明顯的補肝腎、降血脂等功效，有很高的藥食價值。研究發(fā)現(xiàn)貽貝降血脂的功能主要源自于其體內(nèi)的多糖。目前，貽貝多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)尚不明確，其降脂功效和毒性評價也影響著其進一步應(yīng)用于藥物及保健食品。因此，制備高純度的貽貝多糖并對其進行結(jié)構(gòu)解析、功效研究和毒性評價，對進一步將其開發(fā)成天然來源降血脂藥物和保健食品具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種由貽貝中提取的貽貝多糖及其工業(yè)化提取方法。

本發(fā)明另一目的是提供貽貝多糖的在制備降血脂、抗動脈粥樣硬化的藥物和保健食品中的應(yīng)用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案。

一種貽貝多糖，以（1→4)-α-d-glc為主鏈，含有（1→2)-α-d-glc分枝，構(gòu)型為α-吡喃型葡聚糖，平均每12個葡萄糖主鏈中有1個（1→2)葡萄糖分枝，其結(jié)構(gòu)式為：

；

所述貽貝多糖相對分子量為800-8000kda。

所述貽貝多糖提取自貽貝屬（mytilussp.）動物，包括厚殼貽貝（mytiluscoruscus）和紫貽貝（mytilusedulis）。

一種上述貽貝多糖的提取方法，包括以下步驟：

（1）原料處理：貽貝加熱去殼留肉并干燥，粉碎機粉碎，過20-40目篩，得貽貝干粉；

（2）多糖提?。翰襟E（1）制得的貽貝干粉中加入6倍體積的水，100℃提取2h；過濾去除貽貝肉渣，得多糖提取液；

（3）酶解：將步驟（2）制得的多糖提取液調(diào)ph至8.0，加入0.2%w.t的堿性蛋白酶，50℃酶解2h，酶解完成后在80℃條件下滅活15-30min，得酶解液；以硅藻土為助濾劑，抽濾過濾，得到澄清的酶解液；

（4）乙醇沉淀：在步驟（3）制得的多糖溶液中加入1.5倍90-95%（v/v）的乙醇進行沉淀，靜置6h，傾去上清液，得到多糖沉淀；

（5）脫水：在步驟（4）制得的多糖沉淀中加入1倍體積90-95%（v/v）的乙醇進行脫水；

（6）過濾干燥：用400目篩網(wǎng)對脫水后的多糖沉淀進行過濾，收集沉淀，60℃真空干燥，得到粗多糖；

（7）重溶：將步驟（6）所得粗多糖溶于水，配制10%貽貝粗多糖溶液，12000rpm離心1h，將上清液用0.45μm濾膜過濾，得多糖濾液；

（8）離子交換層析：將步驟（7）的多糖濾液用deae-瓊脂糖（ff）層析柱純化，以0.05mol/lnacl溶液為洗脫液，收集洗脫組分；

（9）超濾：用截留分子量為5000的濾膜對步驟（8）所得洗脫組分進行超濾脫鹽和濃縮，得濃縮液；

（10）冷凍干燥：將步驟（9）濃縮液冷凍干燥，得貽貝多糖成品。

上述貽貝多糖成品的純度為99%以上。

所述的貽貝多糖在制備用于治療或預(yù)防心腦血管疾病藥物中的應(yīng)用，所述的心腦血管疾病包括高血脂癥、動脈粥樣硬化。

所述貽貝多糖在制備具有降血脂功效的保健品或特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中的應(yīng)用。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

本發(fā)明的貽貝多糖來源于海洋貝類動物貽貝，是海洋貝類養(yǎng)殖中的重要種類，也是最常見的一種食用貝類，可以通過人工養(yǎng)殖大量獲得，從而使貽貝多糖來源問題很容易得到解決，又能夠拉動海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展。本發(fā)明提取貽貝多糖的方法，條件溫和、純度高。本發(fā)明的貽貝多糖急性毒性分級屬無毒級，安全性高；且貽貝多糖能顯著降低甘油三酯、總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇，具有降脂作用。本發(fā)明的貽貝多糖在制備治療或預(yù)防高血脂癥、動脈粥樣硬化的藥物，制備具有降血脂功效的保健品或特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中具有廣泛應(yīng)用。

附圖說明

圖1為貽貝多糖的hpgpc洗脫曲線；

圖2為貽貝多糖pmp柱前衍生液相色譜分析譜圖：a為單糖標準品的pmp柱前衍生液相色譜圖（其中，1為man；2為glcn；3為rha；4為glca；5為gala；6為galn；7為glc；8為gal；9為xyl；10為ara；11為fuc）；b為貽貝多糖的pmp柱前衍生液相色譜圖。

圖3為貽貝多糖光譜分析譜圖：a為貽貝多糖的紫外吸收曲線；b為貽貝多糖的紅外吸收曲線；

圖4為貽貝多糖的¹h-nmr圖譜；

圖5為貽貝多糖的¹³c-nmr圖譜

圖6為貽貝多糖的dept圖譜；

圖7為貽貝多糖的hh-cosy圖譜；

圖8為貽貝多糖的hsqc圖譜；

圖9為貽貝多糖的tocsy圖譜；

圖10為貽貝多糖的hmbc圖譜；

圖11為貽貝多糖甲基化衍生物gc-ms總離子流圖；

圖12為1,5-二-o-乙?；?1-脫氧-2,3,4,6-四-o-甲基-d-葡萄糖醇質(zhì)譜圖：a為貽貝多糖所得質(zhì)譜圖；b為ccrc標準質(zhì)譜圖；

圖13為1,2,5-三-o-乙?；?1-脫氧-3,4,6-三-o-甲基-d-葡萄糖醇質(zhì)譜圖：a為貽貝多糖所得質(zhì)譜圖；b為ccrc標準質(zhì)譜圖；

圖14為1,4,5-三-o-乙酰基-1-脫氧-2,3,6-三-o-甲基-d-葡萄糖醇質(zhì)譜圖：a為貽貝多糖所得質(zhì)譜圖；b為ccrc標準質(zhì)譜圖；

圖15為1,2,4,5-四-o-乙?；?1-脫氧-3,6-二-o-甲基-d-葡萄糖醇質(zhì)譜圖：a為貽貝多糖所得質(zhì)譜圖；b為ccrc標準質(zhì)譜圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明做進一步說明，但本發(fā)明不受下述實施例的限制。

實施例1貽貝多糖的提取制備。

（1）原料處理：將浙江省嵊泗縣產(chǎn)厚殼貽貝加熱去殼留肉干燥，用粉碎機粉碎，過20目篩，得貽貝干粉；

（2）多糖提取：步驟（1）制得的貽貝干粉中加入6倍體積的水，100℃提取2h；

（3）除渣：用50目篩網(wǎng)分離貽貝肉渣與多糖提取液；

（4）酶解：將步驟（3）制得的多糖提取液用naoh調(diào)ph至8.0，加入質(zhì)量比為0.2%的堿性蛋白酶，50℃酶解2h，酶解完成后在80℃條件下滅活20min，得酶解液；

（5）過濾：以硅藻土為助濾劑，抽濾濾過，得到澄清的多糖溶液；

（6）乙醇沉淀：在步驟（5）制得的多糖溶液中加入1.5倍體積質(zhì)量分數(shù)為93%的食用酒精進行多糖沉淀，靜置6h，傾去上清液，得到多糖沉淀；

（7）脫水：在步驟（6）制得的多糖沉淀中加入1倍體積質(zhì)量分數(shù)為93%的食用酒精對多糖沉淀進行脫水；

（8）過濾干燥：用400目篩網(wǎng)對脫水后的多糖沉淀進行過濾，收集沉淀，60℃真空干燥，得到粗多糖。

（9）重溶：將步驟（8）所得粗多糖溶于水，配制10%貽貝粗多糖溶液，12000rpm離心1h以除去不溶物；

（10）過濾：步驟（9）離心所得上清液用0.45μm濾膜過濾，得多糖濾液；

（11）離子交換層析：用deae-瓊脂糖（ff）層析柱純化多糖，多糖濾液上樣后用0.05mol/lnacl溶液進行洗脫，收集洗脫組分；

（12）超濾：用截留分子量為5000的濾膜對步驟（11）所得洗脫組分進行超濾脫鹽和濃縮；

（13）冷凍干燥：濃縮液冷凍干燥，得貽貝多糖樣品。

實施例2貽貝多糖的結(jié)構(gòu)鑒定。

2.1化學(xué)分析

總糖含量采用硫酸/苯酚法測定：吸取1ml濃度為100μg/ml的貽貝多糖溶液，加入1ml6%苯酚溶液，迅速加入5ml濃硫酸，振蕩使之混勻，沸水浴20min后，冷至室溫在490nm波長處測定其吸光值。以葡萄糖濃度-吸光度做標準曲線，線性回歸方程為：y=3.8108x+0.0415（r²=0.9996），計算樣品總糖含量。

糖醛酸含量采用硫酸/咔唑法測定：吸取0.5ml濃度為50μg/ml的貽貝多糖溶液及空白試劑。在冰水浴中加入3ml四硼酸鈉-硫酸溶液，沸水浴15min，取出后立即冷卻至室溫，加0.1%咔唑溶液0.1ml，搖勻后在530nm波長處測定其吸光值。以葡萄糖醛酸濃度-吸光度做標準曲線，線性回歸方程為：y=4.1536x+0.0252（r²=0.9990），計算樣品糖醛酸含量。

硫酸根含量采用bacl2-明膠比濁法測定：吸取0.5ml濃度為10mg/ml的貽貝多糖溶液及空白試劑，依次加入3%三氟乙酸溶液3.8ml，氯化鋇-明膠溶液1.0ml，搖勻，室溫放置15min，以1mol/lhcl為空白對照，在500nm處測定其吸光值。以硫酸根濃度-吸光度做標準曲線，線性回歸方程為：：y=0.4733x-0.0035（r²=0.9977），計算樣品硫酸多糖含量。

測定結(jié)果結(jié)果如下：貽貝多糖樣品的總糖含量為99.2%，各批次無明顯的糖醛酸組分存在，不含有硫酸根?；瘜W(xué)分析結(jié)果表明，貽貝多糖是一種具有較高純度的中性多糖，不含有明顯的糖醛酸和硫酸多糖成分。

2.2相對分子量測定

采用高效液相色譜-分子排阻色譜法對貽貝多糖分子量進行測定。色譜條件如下：島津lc-20at高效液相色譜儀；色譜柱為tsk-gelgmpwxl（排阻限500萬）；柱溫：35℃；流動相：0.05mol/ml硝酸鈉溶液；流速：0.6ml/min；檢測器：rid-20at示差折光檢測器；上樣量20μl。

通過重均分子量分別為180、55500、102000、291600、534000、1185000，2990000dal的葡聚糖系列對照品繪制以分子量的對數(shù)值為縱坐標，以相應(yīng)色譜峰的保留時間為橫坐標的三次標準曲線，得回歸方程為：y=-0.00315x³+0.16469x²–3.47013x+29.24623，r²=0.9988。精密稱取貽貝多糖樣品50mg，加流動相溶解并定容至10ml，hplc檢測，gpc分析。

貽貝多糖的hpgpc洗脫曲線如圖1所示，除在11.9min含有主要多糖組分外，還含有少量低分子雜質(zhì)。根據(jù)標準曲線計算，貽貝多糖主要多糖組分的平均相對分子質(zhì)量為1212.7kda。

2.3單糖組成分析

采用柱前衍生高效液相色譜法（pc-hplc）測定貽貝多糖的單糖組成。色譜條件如下：ultimate3000高效液相色譜儀；色譜柱為bostongeenodsc18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；柱溫：30℃；流動相：磷酸鹽緩沖液（ph6.7）/ch3cn（82:18，v/v）；流速：1.0ml/min；檢測器：二極管陣列檢測器（dad，245nm）。

精密稱取貽貝多糖適量，用2mol/l三氟乙酸（tfa）完全水解。取貽貝多糖降解液100μl，在堿性條件下與pmp進行衍生反應(yīng)，經(jīng)氯仿萃取處理后，hplc分析。結(jié)果如圖2所示，結(jié)果顯示，貽貝多糖中只含有葡萄糖組分。

2.4紫外和紅外光譜分析

以純水為溶劑配制貽貝多糖溶液使用紫外-可見分光光度計在波長190-500nm范圍內(nèi)掃描，結(jié)果如圖3a所示。由圖譜可知，貽貝多糖在190-500nm范圍內(nèi)無明顯的紫外吸收，符合多糖的結(jié)構(gòu)特征。

取干燥的貽貝多糖2mg與干燥溴化鉀200mg研磨后壓片，于傅里葉變換紅外光譜儀在4000-500cm^-1波段掃描，結(jié)果如圖3b所示。由圖譜可知，貽貝多糖在3391cm^-1范圍內(nèi)存在寬而強的吸收，為o-h的伸縮振動峰；在2928cm^-1的吸收為糖環(huán)上次甲基和亞甲基中的c-h伸縮振動，表明樣品分子結(jié)構(gòu)中含有亞甲基和次甲基。在1154cm^-1、1081cm^-1、1021cm^-1的吸收峰為糖環(huán)c-o-h，c-o-c的特征骨架振動；在1417cm^-1、1368cm^-1、1238cm^-1為吡喃糖環(huán)o-h的面內(nèi)變形振動吸收，577cm^-1為o-h的面外變形振動吸收。848cm^-1處的吸收表明糖環(huán)為α-構(gòu)型；928cm^-1處的吸收表明糖環(huán)為d-構(gòu)型；1646cm^-1處的吸收為多糖類物質(zhì)常見的微量水分締合羥基造成。由此可以初步推測，貽貝多糖為α-d-吡喃型葡聚糖。

2.5核磁共振分析

2.5.1一維核磁共振波譜（1d-nmr）

儀器與試劑：agilentdd2-500核磁共振波譜儀（500mhz）；重水（d2o，99.96%）。

取貽貝多糖20mg，用1mld2o交換3次，凍干后再用d2o溶解，以氘代丙酮為內(nèi)標，在20℃下記錄¹h-nmr、¹³c-nmr和dept圖譜。

在貽貝多糖的¹h-nmr圖譜（圖4）中，在δ5.24ppm處存在端基h1的信號，且位于較低場（化學(xué)位移>δ5.0ppm），為較寬的單峰，表明貽貝多糖的構(gòu)型為α-構(gòu)型。在δ3.0~4.0ppm處的信號為糖環(huán)h2~h6信號，因其化學(xué)位移重疊嚴重，需借助hh-cosy、tocsy和hsqc等圖譜進行識別。

在貽貝多糖的¹³c-nmr圖譜（圖5）中，在δ99.74ppm處存在端基c1的信號，且位于較高場（化學(xué)位移<δ102ppm），符合α-構(gòu)型多糖的特征，與其¹h-nmr圖譜中和紅外光譜中的判斷一致；在高場區(qū)出現(xiàn)的δ60.48ppm信號，可能為貽貝多糖糖環(huán)c6的信號；在δ69~78ppm范圍內(nèi)的信號為貽貝多糖糖環(huán)c2~c5信號；在δ80~90ppm范圍內(nèi)未出現(xiàn)c的信號；表明貽貝多糖為吡喃型，且不存在（1→3）糖苷鍵。

在貽貝多糖的dept（圖6）圖譜中，δ60.4ppm的信號為負峰，表明對應(yīng)的c信號為亞甲基（-ch2），可能為貽貝多糖糖環(huán)結(jié)構(gòu)中的c6信號，這與其在¹³c-nmr圖譜的推測一致。因在貽貝多糖的dept圖譜中，其它位置均無負峰信號，表明貽貝多糖結(jié)構(gòu)中不存在（1→6）糖苷鍵。

2.5.2二維核磁共振波譜（2d-nmr）

儀器與試劑：agilentdd2-500核磁共振波譜儀（500mhz）；重水（d2o，99.96%）。

試驗方法：取貽貝多糖樣品20mg，用1mld2o交換3次，凍干后再用d2o溶解，以氘代丙酮為內(nèi)標，在20℃下記錄hsqc、hh-cosy、tocsy和hmbc圖譜。

根據(jù)貽貝多糖的hh-cosy圖譜（圖7），結(jié)合hsqc圖譜（圖8）、tocsy圖譜（圖9）、hmbc圖譜（圖10），可以對貽貝多糖c和h的化學(xué)位移歸屬進行確認（表1）。

表1貽貝多糖的¹h-nmr和¹³c-nmr信號歸屬

在貽貝多糖的hmbc圖譜中，可以分別看到h1（δ5.24ppm）與c4（δ76.74ppm）的偶合相關(guān)信號，c1（δ99.74ppm）與h4（δ3.51ppm）的偶合相關(guān)信號；h1（δ5.24ppm）與c2（δ77.26ppm）的偶合相關(guān)信號，c1（δ99.74ppm）與h2（δ3.47ppm）的偶合相關(guān)信號；表明貽貝多糖中存在（1→4）糖苷鍵和（1→2）糖苷鍵。

綜合對貽貝多糖的1d-nmr和2d-nmr分析，可以初步確定貽貝多糖是以（1→4)-α-d-glc為主鏈，含有（1→2)-α-d-glc分枝的α-吡喃型葡聚糖。

2.6單糖連接方式分析

將貽貝多糖進行甲基化反應(yīng)結(jié)合gc-ms分析測定單糖連接方式。

采用改良的hakomori法對貽貝多糖進行甲基化反應(yīng)。稱取經(jīng)五氧化二磷充分干燥48h后的多糖組分2mg，加入無水dmso，在n2氛中磁力攪拌1h使樣品充分溶解。快速加入干燥的nah粉末，繼續(xù)攪拌反應(yīng)1h。逐滴加入碘甲烷1ml，在n2氛中避光攪拌反應(yīng)1.5h，然后加純水1ml終止反應(yīng)。用氯仿多次萃取反應(yīng)液，合并氯仿層，減壓干燥即得甲基化多糖。

將貽貝多糖甲基化樣品采用2mol/ltfa完全酸水解，經(jīng)硼氘化鈉還原，用吡啶和乙酸酐反應(yīng)生成乙酰化衍生物后進行g(shù)c-ms分析。質(zhì)譜分析條件為：氣相色譜柱：agilentdb-225（0.25mm×30m×0.25μm）；載氣：氦氣；載氣流速：1.0ml/min；進樣口溫度：250℃；檢測器：質(zhì)譜檢測器（msd）；進樣量：1μl。

貽貝多糖甲基化衍生物進行g(shù)c-ms分析的總離子流圖如圖11所示。從圖中可以看出，貽貝多糖主要在21.48min、24.42min、25.13min和27.82min處出峰。參照美國佐治亞大學(xué)糖復(fù)合物研究中心的（complexcarbohydratestructuredatabase，ccsd）的gc/ms數(shù)據(jù)庫，對貽貝多糖甲基化樣品gc-ms分析中的色譜峰進行質(zhì)譜解析歸屬如下。

在21.48min處的色譜峰，為1,5-二-o-乙?；?1-脫氧-2,3,4,6-四-o-甲基-d-葡萄糖醇（圖12），由末端glc-(1→產(chǎn)生。

在24.42min處的色譜峰，為1,2,5-三-o-乙?；?1-脫氧-3,4,6-三-o-甲基-d-葡萄糖醇（圖13），是由→2)-glcp-(1→產(chǎn)生。

在25.13min處的色譜峰，為1,4,5-三-o-乙?；?1-脫氧-2,3,6-三-o-甲基-d-葡萄糖醇（圖14），是由→4)-glcp-(1→產(chǎn)生。

在27.82min處的色譜峰，為1,2,4,5-四-o-乙?；?1-脫氧-3,6-二-o-甲基-d-葡萄糖醇（圖15），是由→2,4)-glc-(1→產(chǎn)生。

對貽貝多糖的gc-ms結(jié)果進行歸屬分析，發(fā)現(xiàn)貽貝多糖中主要含有末端→(glc、→4)-glc-(1→、→2)-glc-(1→和→2,4)-glc-(1→等連接方式。對各信號進行積分，可以計算貽貝多糖中不同糖苷鍵連接方式的摩爾組成（表2）。

表2貽貝多糖的甲基化分析結(jié)果

根據(jù)貽貝多糖甲基化樣品經(jīng)硼氘化鈉還原和乙?；苌蟮膅c-ms分析結(jié)果，可以確定貽貝多糖的連接方式主要為→4)-glcp-(1→，還含有→2)-glcp-(1→和→2,4)-glcp-(1→等連接方式，這與其2d-nmr的分析結(jié)果相吻合。三種糖苷鍵連接方式的摩爾比依次約為11:1:1。

2.7貽貝多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)

綜合貽貝多糖的化學(xué)分析和紫外光譜（uv）、紅外光譜（ir）、核磁共振波譜（nmr）和氣質(zhì)聯(lián)用分析（gc-ms）等現(xiàn)代儀器分析結(jié)果，可以確定貽貝多糖是一種純度較高的，以（1→4)-α-d-glc為主鏈，含有（1→2)-α-d-glc分枝的α-吡喃型葡聚糖，且平均每12個葡萄糖中有1個末端的葡萄糖分枝。

實施例3貽貝多糖降血脂功效研究。

3.1試驗動物

選雄性sd大鼠，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號：scxk(魯)20140007。動物合格證號：no.37009200002065，體重170±10g。

3.2試驗方法

隨機分為6組，分別為空白組、模型組、l1組（100mg/kg）、l2組（200mg/kg）、l3組（400mg/kg）、l4組（800mg/kg）。全部大鼠喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料觀察1周，禁食12h后稱重，眼內(nèi)眥取血，室溫25℃靜置1h，3000rpm離心10min，取血清，用自動生化分析儀測定tc，tg，hdl-c和ldl-c水平?？瞻捉M始終基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，其余各組大鼠均用高脂飼料喂養(yǎng)（高脂飼料配方為膽固醇1%、膽鹽0.1%、豬油10%、蛋黃粉與全脂奶粉分別為5%，購于北京華阜康生物科技有限公司）。4周后眼內(nèi)眥取血（取血前禁食12h），測定血清tc（總膽固醇），tg（甘油三酯），hdl-c（高密度脂蛋白膽固醇）和ldl-c（低密度脂蛋白膽固醇）水平。用高脂飼料喂養(yǎng)4周后各組大鼠血清總膽固醇水平和甘油三酯水平與空白組比較有顯著性差異（p<0.05），表明脂代謝紊亂模型成功建立。

脂代謝紊亂模型建立成功后，空白組與模型組每日灌胃蒸餾水1ml，l1、l2、l3、l4組分別按照相應(yīng)的劑量每天灌胃給藥1次，連續(xù)8周。給藥8周后大鼠隔夜禁食12h，取血和肝臟，測定血清tc，tg，hdl-c和ldl-c水平。

3.3統(tǒng)計分析

計量資料以x±sd表示，均使用spss13.0軟件統(tǒng)計分析。若計量資料的方差齊，采用單因素方差分析lsd檢驗進行組間比較；若計量資料的方差不齊，采用兩獨立樣本非參數(shù)檢驗。p<0.05認為有統(tǒng)計學(xué)意義。

3.4試驗結(jié)果

在高脂模型建立后的給藥過程中，連續(xù)用藥8周，與模型組比較，貽貝多糖所有劑量組均能顯著降低大鼠血清甘油三酯水平（p<0.01），其中400mg/kg·d、800mg/kg·d劑量組可明顯降低血清總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇含量（p<0.05）（表3）。提示貽貝多糖有顯著降血脂功能，在低劑量條件下只降低血清甘油三酯水平，高劑量條件下可降低血清甘油三酯、總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇水平。

表3給藥前后各組大鼠的血清tc、tg、hdl-c、ldl-c比較(mmol/l)

注：n=10，^##表示p<0.01，與正常組比較；*表示p<0.05，**表示p<0.01與模型組比較

實施例4貽貝多糖急性毒性試驗。

4.1試驗動物

昆明種（km）小鼠，spf級，40只，雌雄各半，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司生產(chǎn)，合格證號：37009200000705，實驗動物生產(chǎn)許可證號：scxk（魯）2014-0007。體重范圍為18.4-22.0g。

4.2試驗方法

小鼠分性別、按體重隨機分為實驗組和對照組，每組20只，雌雄各半。配制0.6g/ml貽貝多糖溶液，實驗組一日內(nèi)灌胃給藥2次，每次給藥體積40ml/kg，間隔約10h，總給藥劑量為48g/kg·d。對照組同法灌胃給予純水。

給藥后即刻觀察動物的反應(yīng)情況，記錄動物的中毒癥狀、外觀體征以及中毒癥狀出現(xiàn)時間、持續(xù)時間和恢復(fù)情況等。給藥當日應(yīng)密切觀察，然后每日上午觀察一次，連續(xù)觀察14天，藥前、藥后第3、7、10、14天各稱一次體重。體重值用x±sd表示，以das1.0軟件進行組間t檢驗比較，以觀察藥物對動物體重增長的影響。

4.3試驗結(jié)果

藥后第3、7、10、14天實驗組與對照組體重基本一致（表4）。小鼠主要癥狀表現(xiàn)為藥后約2min內(nèi)出現(xiàn)小鼠活動次數(shù)減少，約20min內(nèi)基本恢復(fù)，其它觀察未見明顯異常。觀察結(jié)束后處死動物剖檢，腦、心、肝、脾、肺、腎等主要臟器未有肉眼可見異常。

貽貝多糖小鼠最大給藥量為48g/kg·d，約相當于人每日擬用劑量(16mg/kg·d）的3000倍，急性毒性分級屬無毒級。

表4貽貝多糖灌胃給藥對小鼠體重的影響(x±sd，n=20)

綜上所述，一定劑量的貽貝多糖能夠顯著降低大鼠血清中甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇的含量；能顯著降低大鼠血清甘油三酯水平，顯著降低血清總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇含量；貽貝多糖急性毒性分級屬無毒級。