本發(fā)明總地涉及微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體地，涉及一種微生物多糖絮凝劑及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：絮凝劑分為無機(jī)絮凝劑、有機(jī)合成高分子絮凝劑和天然絮凝劑。無機(jī)絮凝劑主要有聚合氯化鋁、聚合氯化鐵等，存在使用量大，鋁鹽有毒性，可致老年性癡呆癥等問題。有機(jī)合成高分子絮凝劑主要為聚丙烯酰胺及其衍生物。由于聚丙烯酰胺單體是很強(qiáng)的神經(jīng)毒素，并具有強(qiáng)致癌性，發(fā)達(dá)國家嚴(yán)格規(guī)定了其使用濃度。天然絮凝劑主要為改性淀粉、殼聚糖和微生物絮凝劑等。改性淀粉絮凝效果欠佳，使用較少。殼聚糖價格昂貴。微生物絮凝劑是具有絮凝活性的微生物次生代謝產(chǎn)物或具有絮凝活性的菌體，是一類新型絮凝劑，其化學(xué)成份主要是多糖、蛋白質(zhì)、纖維素和核酸等物質(zhì)，分子量可達(dá)到為幾十萬甚至以上，具有高效、無毒、易降解、無二次污染等特點，有效地克服了無機(jī)絮凝劑和人工合成有機(jī)絮凝劑在安全和環(huán)境方面存在的問題，是環(huán)境友好型的綠色絮凝劑，越來越受到各國水處理工作者的重視，其中研究較多的是微生物多糖。微生物多糖又稱為多聚糖，是一類至少由10個碳組成的天然高分子碳水化合物，分子量一般在5000～106Da之間。高分子量的生物多糖可以用于增稠劑、懸浮劑、穩(wěn)定劑等，除了應(yīng)用于環(huán)保領(lǐng)域還廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、建筑、石油開采等行業(yè)。根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報道，現(xiàn)有的的微生物多糖絮凝劑的分子量大部分在104～106Da范圍，尚未見更高分子量的微生物多糖絮凝劑的報道。絮凝劑的絮凝活性受分子量的影響很大。通常，絮凝劑分子量大，吸附位點多，網(wǎng)捕和卷掃作用明顯，絮凝活性高，使用時添加量少。目前的微生物多糖絮凝劑有單純的多糖、也有糖和蛋白、脂的混合物。糖蛋白中糖和蛋白的比例差別較大，其中糖的含量變化范圍為5％-98.4％，蛋白的含量變化范圍在0.87％-69％之間。這些多糖、糖蛋白或者脂多糖對高嶺土的絮凝活性范圍在85-95％之間，且絕大多數(shù)多糖絮凝劑需要添加鈣離子或者鎂離子等助凝劑才能發(fā)揮最佳的絮凝效果?？傊壳笆袌錾系亩嗵巧镄跄齽┰谑褂脮r通常添加量較大，且需要添加輔助離子。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種微生物多糖絮凝劑及其應(yīng)用，該絮凝劑主要由阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖和葡萄糖醛酸組成的酸性雜多糖，分子量大，絮凝效果好，且使用時不需添加輔助離子。本發(fā)明的一個方面，提供一種微生物多糖絮凝劑，所述微生物多糖絮凝劑為主要由阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖和葡萄糖醛酸組成的酸性雜多糖，所述絮凝劑分子量為0.8～3.2×107Da。在上述技術(shù)方案中，所述甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的摩爾比為26～54：1：80～110：10～23：2～6。在上述技術(shù)方案中，糖苷鍵構(gòu)型為β型，包括β-1,2糖苷鍵,β-1,3糖苷鍵和β-1,6糖苷鍵。在上述技術(shù)方案中，所述β-1,2糖苷鍵,β-1,3糖苷鍵和β-1,6糖苷鍵的比例為20:10:1。在上述技術(shù)方案中，所述絮凝劑中總糖含量為95％～98％。本發(fā)明的另一個方面，還提供了以上所述的微生物多糖絮凝劑在處理污水中的用途。本發(fā)明的再一個方面，還提供了以上所述微生物多糖絮凝劑在污泥板框壓濾深度脫水中的用途，可達(dá)到與聚丙烯酰胺相同的污泥脫水效果。本發(fā)明的微生物多糖絮凝劑分子量大，可達(dá)到0.8～3.2×107Da，因此絮凝活性好，使用時只需添加污水中懸浮物質(zhì)量或污泥質(zhì)量的0.2％～0.4％即可達(dá)到96％的絮凝活性或使板框壓濾脫水的泥餅含水率降低到60％以下，并且在使用時無需添加任何助劑，污泥的脫水效果與同樣添加量的聚丙烯酰胺相當(dāng)，相比聚丙烯酰胺更加環(huán)保。附圖說明圖1為本發(fā)明實施例提供的多糖絮凝劑的紅外掃描結(jié)果；圖2為本發(fā)明實施例提供的多糖絮凝劑的β-葡萄糖苷酶水解物核磁共振H譜；圖3為本發(fā)明實施例提供的多糖絮凝劑的β-葡萄糖苷酶水解物核磁共振C譜；圖4為本發(fā)明實施例提供的多糖絮凝劑的單糖組成HPLC分析圖。具體實施方式以下結(jié)合附圖和實施例，對本發(fā)明的具體實施方式進(jìn)行更加詳細(xì)的說明，以便能夠更好地理解本發(fā)明的方案以及其各個方面的優(yōu)點。然而，以下描述的具體實施方式和實施例僅是說明的目的，而不是對本發(fā)明的限制。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1：多糖絮凝劑制備使用地衣芽孢桿菌BacilluslicheniformisLZ-1(于2012年11月06日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，郵編100101，菌種保藏號為：CGMCCNo.6782)發(fā)酵生產(chǎn)多糖絮凝劑，發(fā)酵生產(chǎn)條件為溫度37℃，空速0.5L/L/min，攪拌速率200rpm，采用毛細(xì)管粘度計測定發(fā)酵液粘度，當(dāng)發(fā)酵液粘度不再增加時停止發(fā)酵，總發(fā)酵時間為46小時，發(fā)酵液中多糖濃度為10g/L。所用培養(yǎng)基組成為蔗糖30g/L，硝酸鈉3.0g/L，磷酸氫二鉀0.5g/L，硫酸鎂0.5g/L，氯化鉀0.5g/L，硫酸亞鐵0.01g/L，pH10。發(fā)酵液中多糖濃度測定方法如下：取3mL發(fā)酵液，加3mL去離子水稀釋，離心(10000rpm，60min)去菌體，取3mL上清液加4倍體積乙醇沉淀產(chǎn)物，輕輕振蕩后，4℃過夜，1000×g離心15min，棄上清；用75％乙醇清洗沉淀2次，沉淀用去離子水溶解，采用蒽酮-硫酸比色法測定溶液中的多糖濃度為10g/L。測定發(fā)酵液中總糖含量:取上述發(fā)酵液，離心(10000rpm，60min)去除菌體或采用0.2μm微濾膜過濾；在上清液或濾液中加入4倍體積無水乙醇沉淀產(chǎn)物；沉淀用75％乙醇水溶液清洗2次；沉淀重溶于去離子水后，用4倍體積無水乙醇再次沉淀產(chǎn)物；沉淀物用去離子水重溶；重溶液采用Sevage法除蛋白3次；除蛋白后的地衣芽孢桿菌LZ-1多糖溶液采用透析膜(截留分子量100,000Da)于4℃去離子水中透析除鹽和小分子；透析液采用4倍無水乙醇沉淀；沉淀物重溶于水，真空冷凍干燥，得地衣芽孢桿菌LZ-1多糖絮凝劑純品。多糖絮凝劑純品經(jīng)蒽酮法測總糖的含量為95-98％。實施例2：多糖絮凝劑結(jié)構(gòu)分析對實施例1中得到的多糖絮凝劑純品的結(jié)構(gòu)進(jìn)行以下的分析：1、元素分析元素分析采用型號為VarioELⅢ元素分析系統(tǒng)(德國Elementar公司)分析C、H、N、S和O。取經(jīng)過充分干燥的多糖絮凝劑純品樣品15～20mg包在錫容器內(nèi)，在1200℃進(jìn)行分解，采用TCD-熱導(dǎo)檢測器(德國Elementar公司)對氣化后的氣體進(jìn)行檢測，其中載氣為He氣，純度≥99.995％；燃燒氣為O2，純度≥99.995％，每個樣品做二個平行。提純產(chǎn)物元素分析結(jié)果如下表所示，C、H、O的含量超過92％，說明該多糖絮凝劑純品主要以多糖為主，含有少量的蛋白，蛋白含量占多糖含量的0.5-1％。表1多糖提取物元素分析結(jié)果元素名稱CHNOS合計提取樣品，％39.576.282.5446.3<0.3094.69提取樣品，％37.286.852.9247.31<0.3094.662、分子量測定分子量采用凝膠排阻色譜測定(委托北京市理化分析測試中心測定)，多角度激光光散射儀：DAWNHELEOS-II(美國Wyatt公司)，示差折光檢測器Optilab(美國wyatt公司)，色譜柱型號：ShodexSB-806m-HQ，色譜柱規(guī)格：8.0mmID×300mmL。提取的多糖絮凝劑純品經(jīng)檢測，數(shù)均分子量Mn為0.8～3.2×107Da，重均分子量Mw為1.0～3.2×107Da，多分散度Mw/Mn為1.0～1.2，Mw/Mn比值小，說明分子量分布較窄，分子的大小相對勻一。3、紅外光譜檢測采用的紅外掃描儀器型號為SpectrumGX(美國Pekin-Elmer公司)。首先制備溴化鉀空白片和樣品壓片，將壓制好的溴化鉀空白片放入紅外掃描儀樣品倉的樣品架上，確認(rèn)采集參比背景光譜，然后將待測樣品放入光譜儀內(nèi)，對樣品進(jìn)行掃描。樣品每次用量為2～5mg，結(jié)果如圖1所示：紅外光譜結(jié)果顯示，1000～1300cm-1是C-O和C-O-C常見的吸收峰，脂肪醚的峰在1150～1060cm-1，而多糖以C-O-C連接；1500～1680cm-1是苯環(huán)的骨架振動；2100～2400是C≡N鍵的吸收峰，屬于多糖類物質(zhì)。另外，β-型的C-H取直立鍵，在891±7cm-1處有一個吸收峰，在圖中也可以看到這個位置附近峰比較明顯。因此，可以看出該產(chǎn)物符合多糖的特征峰。4、核磁共振高分辨核磁共振波譜儀系統(tǒng)BrukerAVANCEIII500(瑞士布魯克公司)；將50mg的多糖絮凝劑純品溶于D2O，H譜的頻率為500赫茲，C譜的頻率為125赫茲。多糖產(chǎn)物由于分子量比較大，在分析前先用β-葡萄糖苷酶進(jìn)行水解(配制1g/L的多糖溶液，加入1ml10ku的β-葡萄糖苷酶水解2h，溫度為50)，水解后的產(chǎn)物經(jīng)過sephadex-G200(美國通用電氣公司)層析，取10-15min樣品進(jìn)行檢測。核磁共振結(jié)果：H譜的核磁如圖2所示。異頭碳的構(gòu)型對應(yīng)的峰通常在4.3～5.9ppm(δ>5.00為α-型,δ<5.00為β-型)，在圖2中沒有發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的峰，在2.0～2.2ppm處為乙酰氨基的甲基峰。從H譜上不能確定糖苷鍵是α還是β構(gòu)型。C譜的結(jié)果如圖3所示，異頭碳的共振峰一般出現(xiàn)在90～112ppm，在圖3中有四個峰出現(xiàn)，說明存在四個異頭碳。β-型糖苷鍵的位置為103～105ppm，而上述四個異頭碳在103～105的范圍內(nèi)，屬于β型。另外170～176ppm范圍的低場信號反映有己糖醛酸的羧基或乙?；拇嬖?。所以該多糖是含有四個異頭碳的β型的糖苷鍵連接而成，同時含有羧基和乙?；Y(jié)構(gòu)。5、單糖組成對單糖組成的測定采用硫酸水解多糖樣品后用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)進(jìn)行衍生，然后用高壓液相儀(Agilent1260，C18柱：Agilent，EclipseplusC18，3.5UM，4.6×100MM)進(jìn)行檢測。多糖的水解條件是將98％濃硫酸稀釋400倍，取80mg實施例1中的多糖絮凝劑純品溶解于5ml稀釋后的硫酸，然后120℃水解2h。水解后的液體用碳酸鋇進(jìn)行中和至pH＝7左右，然后進(jìn)行凍干，凍干后的水解物重溶于1ml去離子水后用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮進(jìn)行衍生，然后對衍生后的單糖在C18的柱子上分離，得到各單糖清晰的峰，結(jié)果如圖4所示。色譜條件：流動相采用水和乙腈，體積比為78：22，流速為1ml/min，柱溫為30℃，檢測器為示差檢測器(30℃)，進(jìn)樣量6微升。測得多糖絮凝劑純品中的單糖組成是：葡萄糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖，還有葡萄糖醛酸。這幾種糖和糖醛酸的摩爾比例是(平均值)：甘露糖：葡萄糖醛酸：葡萄糖：半乳糖：阿拉伯糖＝40：1：94：16：4。其中葡萄糖和甘露糖的比例接近2：1。6、高碘酸氧化高碘酸可以選擇性地斷裂糖分子中連二羥基或連三羥基處，生成相應(yīng)的多糖醛、甲醛或甲酸。反應(yīng)定量地進(jìn)，每開裂一個C-C鍵消耗一分子高碘酸。由于高碘酸在波長223nm處呈最大吸收，因此可通過分光光度法測定高碘酸消耗及甲酸的釋放量，據(jù)此可以判斷糖苷鍵的位置、直鏈多糖的聚合度、支鏈多糖的分枝數(shù)目等。以葡聚糖為例，具有1-2糖苷鍵或1-4糖苷鍵的糖基經(jīng)高碘酸氧化，平均每個糖基僅消耗一分子高碘酸，并且無甲酸釋放；具有1-3糖苷鍵的的糖基不被高碘酸氧化；具有1-6糖苷鍵的糖基或非還原末端經(jīng)高碘酸氧化，消耗兩分子高碘酸，同時釋放一分子甲酸。取0.5g實施例1中的多糖絮凝劑純品加入5ml去離子水，溶脹后再用30mmol的高碘酸溶液溶解，定容至50ml。每隔4h取0.2ml稀釋50倍，測高碘酸含量的變化；當(dāng)高碘酸含量不變時，加入2ml的乙二醇結(jié)束反應(yīng)去除未反應(yīng)的高碘酸。通過高壓液相色譜檢測甲酸的含量確定1-6糖苷鍵的含量。甲酸測定條件：色譜柱為Hiplex-H(300*7.7mm，Agilent)，流動相：0.002M的硫酸溶液，流量0.6ml/min，柱溫80℃，示差檢測器，色譜儀為waters1260。表2多糖提取物高碘酸氧化結(jié)果注：采用30mmol的高碘酸10ml+10ml水作為初始值高碘酸氧化結(jié)果表明產(chǎn)物中含有1-6糖苷鍵。7、Smith降解Smith降解是將高碘酸氧化產(chǎn)物還原后進(jìn)行酸水解或部分酸水解。由于糖基之間以不同的位置縮合，用高碘酸氧化后生成不同的產(chǎn)物。產(chǎn)物用硼氫化鈉(鉀)還原成穩(wěn)定的多羥基化合物，經(jīng)酸水解后用HPLC鑒定水解產(chǎn)物，由降解的產(chǎn)物可以推斷糖苷鍵的位置。以1-3位鍵合的糖苷鍵產(chǎn)生葡萄糖或其它單糖，以1-2位鍵合的糖苷鍵產(chǎn)生甘油和甘油醛，以1-4位鍵合的糖苷鍵產(chǎn)生赤蘚醇和乙二醇，以1-6位鍵合的糖苷鍵產(chǎn)生甘油和乙二醇，非還原末端基的降解產(chǎn)物亦為甘油。將高碘酸氧化產(chǎn)物透析48h，凍干后溶于5ml水中，加入100mg硼氫化鈉進(jìn)行還原24h，調(diào)節(jié)pH將硼氫化鈉破壞，3000Da的半透膜透析48h后凍干。用0.045M硫酸水解，直接用Hiplex-H柱子檢測，RID檢測器檢測。平行進(jìn)行兩次檢測，結(jié)果見下表3。水解液中存在大量的甘油(15.577min)和甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖混合物(12.140min)，少量的葡萄糖醛酸(10.721min)、葡萄糖(11.2min)和乙二醇(18.355min)。因此，Smith降產(chǎn)物中除了存在1-6糖苷鍵，還存在1-3糖苷鍵(存在單糖)，1-2糖苷鍵(存在甘油)。糖苷鍵比例1-2糖苷鍵:1-3糖苷鍵:1-6糖苷鍵＝20:10:1。表3多糖Smith氧化結(jié)果樣品名稱樣品量甘油含量乙二醇含量糖含量單位mgmmolmmolnmol樣品1125.20.072560.003540.038267樣品1125.40.072310.003630.039547實施例3將高嶺土配成5g/L的溶液；取實施例1中發(fā)酵至粘度為180mPa·s發(fā)酵液(其中多糖濃度為15g/L)稀釋100倍，取1ml加入高嶺土溶液100ml；在300rpm下攪拌0.5min，然后在100rpm攪拌2min，倒入100ml的量筒靜置5min；取上清液在λ＝600nm測吸光度OD600，和對照OD600,0相比(不加發(fā)酵液)，加入發(fā)酵液的高嶺土溶液變得澄清，絮凝率為98％，以高嶺土的重量計，多糖的加入量為0.03wt％。絮凝率計算公式如下：取實施例1中發(fā)酵液的粘度增加到2000mPa·s時的發(fā)酵液(多糖濃度為35g/L)，稀釋400倍，按照上述方法對高嶺土溶液進(jìn)行絮凝，絮凝率為95％，以高嶺土的重量計，多糖的加入量為0.0175wt％。取實施例1中發(fā)酵液的粘度增加到200mPa·s時的發(fā)酵液(多糖濃度為20g/L)，稀釋200倍，按照上述方法對高嶺土溶液進(jìn)行絮凝，絮凝率為95％，以高嶺土的重量計，多糖的加入量為0.02wt％。將實施例1中得到的多糖絮凝劑純品配成10g/L的溶液，稀釋100倍，取1ml加入100ml高嶺土溶液中，在300rpm下攪拌0.5min，然后在100rpm攪拌2min，倒入100ml的量筒靜置5min，取上清液在λ＝600nm測吸光度，和對照(不加多糖的高嶺土溶液)相比，加入絮凝劑的高嶺土溶液變得澄清，絮凝率為95％，以高嶺土的重量計，多糖的加入量為0.02wt％。實施例4：多糖絮凝劑在污泥板框壓濾上的應(yīng)用對比例：污泥來自生活污水處理廠，用板框壓濾之前先將污泥的含水率調(diào)節(jié)為90％，然后加入濃度為30％聚合氯化鐵作為絮凝劑，絮凝劑的加入量為10mg/L，板框壓濾機(jī)(山東景津環(huán)保設(shè)備有限公司，1600型)的板框邊長是1.6米，自動拆卸壓濾板20塊。經(jīng)過現(xiàn)場連續(xù)60天的實驗表面，再加入與污泥質(zhì)量比為0.2％、0.3％和0.4％的聚丙烯酰胺作為助凝劑，經(jīng)過板框壓濾機(jī)的壓濾，含水率變?yōu)?0％、57％和56％。實驗例：用該生物絮凝劑在大型邊框壓濾機(jī)上對生活污泥和工業(yè)污泥的混合物進(jìn)行脫水，將實施例1中粘度為180、200、2000mPa·s的發(fā)酵液按照多糖與污泥的質(zhì)量比為0.2％、0.3％和0.4％的比例添加到含水率為90％污泥中,然后加入濃度為30％聚合氯化鐵作為絮凝劑，絮凝劑的加入量為10mg/L。板框壓濾機(jī)(山東景津環(huán)保設(shè)備有限公司，1600型)的板框邊長是1.6米，自動拆卸壓濾板20塊。經(jīng)過現(xiàn)場連續(xù)60天的實驗表面，加入質(zhì)量比為0.2％、0.3％和0.4％的生物絮凝劑經(jīng)過壓濾后，污泥的含水率降低到60％、58％和55％，和使用聚丙烯酰胺相比含水率及加藥劑的量基本相同，說明本發(fā)明的多糖絮凝劑可以替代聚丙烯酰胺。當(dāng)前第1頁1 2 3