一種固定化右旋糖酐酶降解小分子右旋糖酐的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明公開了一種固定化右旋糖酐酶降解小分子右旋糖酐的制備方法，屬于右旋糖酐領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]右旋糖酐，又名葡聚糖，是一種由葡萄糖單元脫水形成的高分子聚合物，它的結(jié)構(gòu)具有多樣性，通常被定義為一種完全由α-D-吡喃葡萄糖單體構(gòu)成的多糖。右旋糖酐是某些細(xì)菌產(chǎn)生的一種胞外多糖，是由分泌性酶催化生成的胞外產(chǎn)物，作為最早發(fā)現(xiàn)的微生物多糖，右旋糖酐是美國FDA(食品和藥物管理局)批準(zhǔn)的第一種可用于食品的微生物胞外多糖，也是世界上第一個工業(yè)化生產(chǎn)的微生物多糖。右旋糖酐因其安全、無毒、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、色譜分析等多個領(lǐng)域。
[0003]右旋糖酐的生產(chǎn)包括有如下兩種方法:微生物直接發(fā)酵法和酶合成法，而工業(yè)生產(chǎn)上主要以直接發(fā)酵法為主。但直接發(fā)酵法生產(chǎn)葡聚糖時，產(chǎn)物分子大小難以控制，發(fā)酵后菌體與產(chǎn)品很難分離，生產(chǎn)中引入的氮、氯等雜質(zhì)，致使右旋糖酐質(zhì)量低，臨床副反應(yīng)多。而利用誘導(dǎo)分離出的葡聚糖合成酶來制備右旋糖酐可以克服這些不足，因此，從特有的微生物中通過分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建和篩選的右旋糖酐合成酶的全新酶源是目前研究重點(diǎn)之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題:針對目前右旋糖酐分子量的調(diào)控方法包括有化學(xué)法、物理法和生物法，其中化學(xué)法是傳統(tǒng)所使用的方法，主要是通過鹽酸把大分子量的右旋糖酐降解成小分子量的右旋糖酐，該法由于反應(yīng)條件劇烈，不易控制，反應(yīng)后部分右旋糖酐被降解成了單糖，因而導(dǎo)致收率很低的問題，提供了一種固定化右旋糖酐酶降解小分子右旋糖酐的制備方法，本發(fā)明先得發(fā)酵培養(yǎng)基，將棘孢青霉菌和醋桿菌接在培養(yǎng)基上發(fā)酵培養(yǎng)得菌體，再超聲破碎后得菌液，將菌液和卡拉膠混合滴加到氯化鈣溶液中，制得右旋糖酐酶固定化細(xì)胞微球，將微球轉(zhuǎn)接至底物溶液中搖床反應(yīng)，反應(yīng)后用乙醇沉淀，捏洗干燥后即可本發(fā)明將棘孢青霉菌和醋桿菌發(fā)酵得菌體，里，面含有右旋糖酐酶，并利用卡拉膠進(jìn)行固化，固定化率高而且提高右旋糖酐酶的活性和穩(wěn)定性，用其降解右旋糖酐，可使其分子量降低，副廣物少，提尚右旋糖IfF的質(zhì)量。
[0005]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
(I)按重量份數(shù)計，分別選取30?40份葡萄糖，10?15份蛋白胨，5?8份磷酸氫二鈉，2?4份磷酸二氫鉀，0.5?1.2份氯化鉀，3?5份酵母浸膏和30?50份去離子水，用0.5mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為7.0，在105?110°C和0.1MPa下滅菌處理10?15min得發(fā)酵培養(yǎng)基;
(2 )向上述發(fā)酵培養(yǎng)基中加入培養(yǎng)基體積8?12%棘孢青霉菌種子液和培養(yǎng)基體積1?15%醋桿菌種子液，放入37°C恒溫?fù)u床培養(yǎng)中，在200?220r/min下培養(yǎng)15?20h，將培養(yǎng)后的發(fā)酵液在4°C和5000?7000r/min轉(zhuǎn)速下離心分離12?15min，收集沉淀物，將沉淀物按固液比I: 2加入去離子水，得菌體懸浮液；
(3)將上述菌體懸浮液按體積比1:1加入pH6.8濃度0.05mol/LHAC-NaAC緩沖液，混合后在0°C和250?300W下超聲破碎15?20min，每破碎2s，間隔2s，超聲破碎后再在4°C和10000?12000r/min條件下離心分離15?20min，去除沉淀物，得上清液即菌液；
(4)取50?80mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)3?5%卡拉膠溶液，將卡拉膠溶液和菌液按體積比1:1混合，將混合液緩慢滴加到質(zhì)量分?jǐn)?shù)5?8%的氯化鈣溶液中，控制在50?60min滴完，滴加同時在250?350r/min轉(zhuǎn)速下攪拌，滴加后再攪拌固定25?35min，固定后加入總體積5?8%戊二醛進(jìn)行交聯(lián)I?2h，形成卡拉膠鈣珠，將卡拉膠鈣珠按固液比1:5放入pH6.5磷酸鹽緩沖液中靜置過夜，過濾，將過濾物用蒸餾水洗滌2?3次，即可得到右旋糖酐酶固定化細(xì)胞微球；
(5)將上述右旋糖酐酶固定化細(xì)胞微球按體積5?10%轉(zhuǎn)接量接至底物溶液中，在270C和100?150r/min恒溫?fù)u床中反應(yīng)18?20h，反應(yīng)結(jié)束后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%乙醇按體積比3:1混合進(jìn)行沉淀，將沉淀物放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)90%乙醇中捏洗2?3次，捏洗后的過濾物放入烘箱中在70?80 °C下干燥5?6h即可。
[0006]所述的底物溶液是每升水中含100?120g蔗糖，1.7?2.2g蛋白胨，1.8?2.2g磷酸氫二鈉，0.02?0.05g氯化鈣和0.003?0.006g硫酸鎂配比組成。
[0007]本發(fā)明制備得到的右旋糖酐酶固定化細(xì)胞微球在15?65°C進(jìn)行測試熱穩(wěn)定性，右旋糖酐酶的相對活性從35?40%升高到100%，隨著溫度的升高又降低至25?30%，在42°C時達(dá)到最高，對右旋糖酐轉(zhuǎn)化率高達(dá)92%以上，重均分子量平均為3000?7000Da。
[0008]本發(fā)明的有益效果是:
(1)本發(fā)明將棘孢青霉菌和醋桿菌發(fā)酵得菌體，里面含有右旋糖酐酶，并利用卡拉膠進(jìn)行固化，固定化率高而且提高右旋糖酐酶的活性和穩(wěn)定性；
(2)用本發(fā)明制備得到右旋糖酐酶固定化細(xì)胞微球降解右旋糖酐，可使其分子量降低，副廣物少，提尚右旋糖圈1的質(zhì)量；
(3)本發(fā)明的方法不僅綠色、環(huán)保、低成本、簡便，而且右旋糖酐轉(zhuǎn)化率高。
【具體實(shí)施方式】
[0009]首先按重量份數(shù)計，分別選取30?40份葡萄糖，10?15份蛋白胨，5?8份磷酸氫二鈉，2?4份磷酸二氫鉀，0.5?1.2份氯化鉀，3?5份酵母浸膏和30?50份去離子水，用0.5mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為7.0，在105?110°C和0.1]\0^下滅菌處理10?1511^11得發(fā)酵培養(yǎng)基；向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入培養(yǎng)基體積8?12%棘孢青霉菌種子液和培養(yǎng)基體積10?15%醋桿菌種子液，放入37°C恒溫?fù)u床培養(yǎng)中，在200?220r/min下培養(yǎng)15?20h，將培養(yǎng)后的發(fā)酵液在4°C和5000?7000r/min轉(zhuǎn)速下離心分離12?15min，收集沉淀物，將沉淀物按固液比I: 2加入去離子水，得菌體懸浮液;將菌體懸浮液按體積比1:1加入pH6.8濃度0.05mol/LHAC-NaAC緩沖液，混合后在0°C和250?300W下超聲破碎15?20min，每破碎2s，間隔2s，超聲破碎后再在4°C和10000?12000r/min條件下離心分離15?20min，去除沉淀物，得上清液即菌液;取50?80mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)3?5%卡拉膠溶液，將卡拉膠溶液和菌液按體積比1:1混合，將混合液緩慢滴加到質(zhì)量分?jǐn)?shù)5?8%的氯化鈣溶液中，控制在50?60min滴完，滴加同時在250?350r/min轉(zhuǎn)速下攪拌，滴加后再攪拌固定25?35min，固定后加入總體積5?8%戊二醛進(jìn)行交聯(lián)I?2h，形成卡拉膠鈣珠，將卡拉膠鈣珠按固液比1:5放入pH6.5磷酸鹽緩沖液中靜置過夜，過濾，將過濾物用蒸餾水洗滌2?3次，即可得到右旋糖酐酶固定化細(xì)胞微球;將右旋糖酐酶固定化細(xì)胞微球按體積5?10%轉(zhuǎn)接量接至底物溶液中，在27°C和100?150r/min恒溫?fù)u床中反應(yīng)18?20h，反應(yīng)結(jié)束后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%乙醇按體積比3:1混合進(jìn)行沉淀，將沉淀物放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)90%乙醇中捏洗2?3次，捏洗后的過濾物放入烘箱中在70?80 °C下干燥5?6h即可。
[0010]所述的底物溶液是每升水中含100?120g蔗糖，I.7?2.2g蛋白胨，I.8?2.2g磷酸氫二鈉，0.02?0.05g氯化鈣和0.003?0.006g硫酸鎂配比組成。
[0011]實(shí)例I
首先按重量份數(shù)計，分別選取40份葡萄糖，15份蛋白胨，8份磷酸氫二鈉，2份磷酸二氫鉀，1.2份氯化鉀，3.8份酵母浸膏和30份去離子水，用0.5mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為7.0，在105°C和0.1MPa下滅菌處理1min得發(fā)酵培養(yǎng)基；向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入培養(yǎng)基體積8%棘孢青霉菌種子液和培養(yǎng)基體積10%醋桿菌種子液，放入37°C恒溫?fù)u床培養(yǎng)中，在200r/min下培養(yǎng)15h，將培養(yǎng)后的發(fā)酵液在4°C和5000r/min轉(zhuǎn)速下離心分離12min，收集沉淀物，將沉淀物按固液比1:2加入去離子水，得菌體懸浮液;將菌體懸浮液按體積比1:1加入pH6.8濃度0.05mol/LHAC-NaAC緩沖液，混合后在O °C和250W下超聲破碎15min，每破碎2s，間隔2s，超聲破碎后再在4°C和10000r/min條件下離心分離15min，去除沉淀物，得上清液即菌液;取50mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%卡拉膠溶液，將卡拉膠溶液和菌液按體積比1:1混合，將混合液緩慢滴加到質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的氯化鈣溶液中，控制在50min滴完，滴加同時在250r/m