本發(fā)明涉及微生物檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種散囊菌的探針熒光定量pcr快速檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：黑茶為后發(fā)酵茶，基本工藝流程是殺青、初揉、渥堆、復(fù)揉、烘焙。黑茶包括湖南黑茶、湖北青磚茶、四川藏茶(邊茶)、安徽古黟黑茶(安茶)、云南黑茶(普洱茶)、廣西六堡茶及陜西黑茶(茯茶)。部分地區(qū)黑茶在渥堆發(fā)酵過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)“金花”現(xiàn)象，而這“金花”為散囊菌的金黃色孢子。散囊菌屬在生長(zhǎng)過(guò)程中能產(chǎn)生淀粉酶、氧化酶及其他次級(jí)代謝產(chǎn)物，能夠改善茶的色澤、口感及功能特性。金花(即散囊菌)越多，品質(zhì)越好。目前關(guān)于茶葉中微生物的測(cè)定局限于傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)法和梯度凝膠變性電泳(dgge-pcr)技術(shù)。對(duì)于茶葉中散囊菌微生物數(shù)目的測(cè)定，目前有以下幾種方法：1.傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)法該方法操作過(guò)程為：①用滅菌水對(duì)茶葉表面微生物進(jìn)行洗脫。②將上述洗脫液置于滅菌平板中恒溫培養(yǎng)一段時(shí)間。③待微生物長(zhǎng)出菌落，數(shù)出菌落數(shù)量，按公式計(jì)算茶葉表面含有微生物數(shù)量。該方法操作繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)、只能計(jì)算活菌數(shù)，數(shù)菌落工程中主觀性強(qiáng)。不能準(zhǔn)確反應(yīng)菌株的定值狀況。2.梯度凝膠變性電泳(dgge-pcr)技術(shù)梯度凝膠變性電泳(dgge-pcr)技術(shù)的原理是不同的雙鏈dna片段因其序列組成不一樣，所以其解鏈區(qū)域及解鏈條件變性劑使用濃度也不相同。長(zhǎng)度相同、序列不同的dna片段在不同濃度的變性劑條件下不同位置發(fā)生部分解鏈，遷移到膠體的不同位置，從而被區(qū)分開(kāi)來(lái)。該方法的操作過(guò)程為：微生物總基因的提取—18srrna可變區(qū)擴(kuò)增—梯度變性凝膠電泳—染色成像—切膠回收—轉(zhuǎn)化克隆—測(cè)序比對(duì)，分析數(shù)據(jù)可得到每個(gè)茶葉樣品中菌系組成和顯色條帶的菌的相對(duì)含量。dgce—pcr側(cè)重于茶葉樣品中微生物多樣性的分析，能夠反映茶葉菌群構(gòu)成與多樣性，該方法可準(zhǔn)確定性，但其通過(guò)對(duì)比dna條帶的明暗度半定量分析方法不能夠達(dá)到準(zhǔn)確定量的目的。電泳過(guò)程涉及劇毒試劑，嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)者身體健康。電泳結(jié)束后的數(shù)據(jù)分析、處理過(guò)程復(fù)雜，在測(cè)序比對(duì)這一步會(huì)產(chǎn)生大量的費(fèi)用，不是一種準(zhǔn)確快捷的定值能力測(cè)定方法。分子生物學(xué)技術(shù)是一項(xiàng)對(duì)微生物免培養(yǎng)檢測(cè)的新技術(shù)，實(shí)時(shí)定量pcr，是指在pcr反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)pcr進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。熒光定量pcr有如下顯著的優(yōu)點(diǎn)：①特異性好，使用特異性探針對(duì)定量分子進(jìn)行識(shí)別，具有很高的準(zhǔn)確性。同時(shí)，靶序列由引物和探針雙重控制，特異性好、假陽(yáng)性低。②靈敏度高，熒光pcr檢測(cè)技術(shù)是綜合了pcr技術(shù)、熒光標(biāo)記技術(shù)、激光技術(shù)、數(shù)碼顯象技術(shù)為一體的技術(shù)，因此它的檢測(cè)靈敏度很高。③線性關(guān)系好、線性范圍寬，由于熒光信號(hào)的產(chǎn)生和每次擴(kuò)增產(chǎn)物成一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系，通過(guò)熒光信號(hào)的檢測(cè)可以直接對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定量；定量范圍可在0-1010拷貝/毫升。④操作簡(jiǎn)單、安全、自動(dòng)化程度高、防污染。擴(kuò)增和檢測(cè)可以在同一管內(nèi)檢測(cè)，不需要開(kāi)蓋，不易污染；同時(shí)擴(kuò)增和檢測(cè)一步完成，不需要后期處理，不再需要擔(dān)心放射性污染。在實(shí)時(shí)定量熒光pcr反應(yīng)體系中，加入熒光基團(tuán)或熒光染料，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，pcr反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度逐漸增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，通過(guò)熒光強(qiáng)度的變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段、熒光信號(hào)指數(shù)增長(zhǎng)階段和非指數(shù)平臺(tái)階段。在熒光信號(hào)指數(shù)增長(zhǎng)階段，pcr產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，qrt-pcr結(jié)果是可以準(zhǔn)確地反映反應(yīng)體系中模板的初始量。為了便于對(duì)所檢測(cè)樣本進(jìn)行比較，在熒光信號(hào)指數(shù)增長(zhǎng)階段，首先需設(shè)定一個(gè)熒光信號(hào)的域值，這個(gè)域值(threshold)一般是以pcr反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)(baseline)。ct值是擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。ct值主要由擴(kuò)增反應(yīng)體系中模板的初始濃度決定的。通常用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品的ct值來(lái)產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計(jì)算相對(duì)方程式。方程式的斜度可以用來(lái)檢查pcr的效率。實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀都有軟件，可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線中自動(dòng)地計(jì)算出未知樣本的初始模板量。國(guó)外學(xué)者應(yīng)用多重?zé)晒舛縫cr法對(duì)空氣中的微生物的多樣性及所占比率進(jìn)行，發(fā)現(xiàn)空氣中微生物很多，其中包括散囊菌屬。目前尚未發(fā)現(xiàn)應(yīng)用探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)對(duì)茶葉中散囊菌屬進(jìn)行計(jì)數(shù)的相應(yīng)研究或報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于：針對(duì)上述存在的問(wèn)題，提供一種散囊菌的探針熒光定量pcr快速檢測(cè)方法，本發(fā)明方法克服了傳統(tǒng)平板培養(yǎng)法的局限性和耗時(shí)長(zhǎng)，dgce-pcr法的操作繁瑣和工作量大、費(fèi)用高等缺陷，具有快速、準(zhǔn)確、高通量、靈敏度高且特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：一種散囊菌的探針熒光定量pcr快速檢測(cè)方法，其特征在于：包括以下步驟：(1)菌株dna提取純種培養(yǎng)散囊菌屬微生物，收集其菌絲，進(jìn)行散囊菌屬基因組dna的提取，得到dna溶液；(2)特異性引物及熒光探針設(shè)計(jì)正向引物forwardprimereamstf1：5'-gtggcggcaccatgtct反向引物reverseprimereamstr1：5'-ctggttaaaaagattggttgcga熒光探針的序列probeeamstp1：5’-cagctggacctacgggagcggg探針修飾：6-fam\eclipse(3)引物特異性檢測(cè)用步驟(1)提取得到的dna溶液，以ddh2o為陰性對(duì)照，檢測(cè)步驟(2)的特異性引物的特異性；(4)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立將已知濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋，即稀釋濃度分別為2.0×107，2.0×106，2.0×105，2.0×104，2.0×103，2.0×102，2.0×101copies/μl；每個(gè)稀釋度平行三次，同時(shí)以無(wú)菌水為模板作為陰性對(duì)照；通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增，檢測(cè)引物靈敏度，并以拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值為x軸，以ct值為y軸，構(gòu)建實(shí)時(shí)熒光定量pcr標(biāo)準(zhǔn)曲線，并確定其靈敏度；(5)茶樣dna提取(a)將茶樣預(yù)處理，得到菌絲體，備用；(b)將上述菌絲體加入裝有1ml裂解液的離心管中，靜置5min；然后震蕩混勻，在90～100℃恒溫水浴8-15min；(c)水浴后，將上述混合液在4℃，12000rpm的條件下離心2min；然后取上清液，得到茶樣dna提取液，在-20℃條件下保存?zhèn)溆茫?6)茶樣中散囊菌的數(shù)目檢測(cè)將步驟(5)得到的茶樣dna提取液中真菌菌絲基因組dna為模板，采用步驟(3)中的特異性引物進(jìn)行熒光定量pcr擴(kuò)增，得到不同樣品熒光定量pcr的ct值，帶入步驟(4)中標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，計(jì)算出拷貝數(shù)，通過(guò)換算，即可得到茶樣中散囊菌屬的數(shù)目。較佳地，在步驟(1)，所述菌株dna提取，包括如下步驟：(a)往經(jīng)高溫滅菌、預(yù)冷的研缽中倒入液氮，再加入0.05～0.15g散囊菌菌絲樣品，待液氮完全揮發(fā)后，快速研磨樣品至粉末狀，得到菌絲粉末；(b)將菌絲粉末放于離心管中，加入150～250μlbufferdigestion、1～3μlβ-巰基乙醇和10～30μlproteinasek溶液，震蕩混勻后，50～60℃恒溫水浴0.5～1.5h；(c)往上述水浴后的離心管中加入80～120μlbufferpf，混勻后于-15～-25℃的條件下靜置3-6min；然后室溫10000rpm離心5min，取上清液；(d)往取出的上清液中加入150～250μlbufferbd混勻后，再加入150～250μl無(wú)水乙醇，混勻后，將溶液和半透明纖維狀懸浮物全部移至收集管的吸附柱內(nèi)，靜置1-5min，然后10000rpm室溫離心1min，倒掉收集管中的廢液；(e)將吸附柱放回收集管，加入400～600μlpwsolution，10000rpm離心30s倒掉收集管中的廢液；再加入400～600μlwashsolution，10000rpm離心30s倒掉收集管中的廢液，然后于室溫12000rpm離心2min，離去殘留的washsolution，擦凈管口；(f)取出上述吸附柱，放入新的離心管中，加入40-60μltebuffer靜置3min，12000rpm室溫離心2min，然后收集dna溶液，在-20℃條件下保存?zhèn)溆谩］^佳地，在步驟(3)，所述引物特異性檢測(cè)的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件為：(a)反應(yīng)體系：使用eppendorf熒光定量pcr儀器進(jìn)行，每個(gè)樣品取1μl作為模板；25μl的熒光定量pcr反應(yīng)體系含有成分如下：premiextaqtm，12.5μl；引物f，0.5μl；引物r，0.5μl；dna模板，2μl；6-fam修飾探針，0.1μl；dh2o，25μl；(b)反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30s，1個(gè)循環(huán)：95℃變性5s、55℃退火10s、72℃延伸20s，45個(gè)循環(huán)。較佳地，在步驟(4)，所述質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法為：采用上述散囊菌屬基因組為模板，采用步驟(3)中特異性引物，進(jìn)行普通pcr，得到產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，將切膠回收的目的dna片段經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)化，制備成質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，并測(cè)定質(zhì)粒濃度，計(jì)算出質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)。較佳地，所述質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的計(jì)算公式為：拷貝數(shù)＝6.02×1023×濃度×10-9/(擴(kuò)增堿基數(shù)×660)。較佳地，在步驟(5)，所述茶樣預(yù)處理由以下步驟組成：稱取茶葉樣品各20g倒入經(jīng)滅菌的錐形瓶中，室溫下150rpm振蕩30min，將液體轉(zhuǎn)移至50mi離心管中，在4℃條件下，10000r/min離心10min，去除上清液，收集沉淀，用滅菌生理鹽水沖洗錐形瓶中茶葉；重復(fù)上述步驟4次，將得到的沉淀物用1.0ml滅菌生理鹽水懸浮，得到菌絲體，備用。較佳地，所述滅菌為往錐形瓶中加入生理鹽水和玻璃珠后，進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。較佳地，所述茶樣為茯茶、千兩茶、黑磚茶、青磚茶、邊茶、安茶、普洱茶或六堡茶。本發(fā)明是申請(qǐng)人在前期研究基礎(chǔ)上，從廣西壯族自治區(qū)梧州市的六堡茶中鑒定了多株“金花”菌，證明其都同屬散囊菌屬，而非單一的冠突散囊菌，從而建立依據(jù)金花六堡茶中的散囊菌屬為特征指標(biāo)的實(shí)時(shí)熒光定量pcr的定量方法，進(jìn)而也建立金花黑茶中散囊菌數(shù)目的快速定量方法。綜上所述，由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明方法改善了傳統(tǒng)定量pcr勞動(dòng)強(qiáng)度大、定量不準(zhǔn)確、重復(fù)性差的缺點(diǎn)，也克服了傳統(tǒng)平板培養(yǎng)法的局限性和耗時(shí)長(zhǎng)，dgce-pcr法的操作繁瑣和工作量大、費(fèi)用高等缺陷，其應(yīng)用特異性引物，通過(guò)一次熒光定量pcr將模板中的對(duì)應(yīng)種屬的菌株絕對(duì)定量，具有特異性強(qiáng)、耗時(shí)短、操作方便、定量準(zhǔn)確的特點(diǎn)，能很好的應(yīng)用于茶葉中菌株的定量測(cè)定。進(jìn)而通過(guò)茶葉中散囊菌數(shù)量的測(cè)定，快速確定該黑茶是否為金花黑茶，從而建立對(duì)金花黑茶的快速鑒偽方法。附圖說(shuō)明圖1梯度稀釋質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線圖；圖2散囊菌熒光定量pcr檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖3熒光定量法靈敏度檢測(cè)圖；圖4熒光定量法特異性檢測(cè)圖；圖5六堡茶樣品熒光定量pcr擴(kuò)增曲線圖；圖6六堡茶樣品初始散囊菌數(shù)目圖。具體實(shí)施方式為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下參考附圖，并舉出優(yōu)選實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。然而，需要說(shuō)明的是，說(shuō)明書(shū)中列出的許多細(xì)節(jié)僅僅是為了使讀者對(duì)本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)方面有一個(gè)透徹的理解，即便沒(méi)有這些特定的細(xì)節(jié)也可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的這些方面。本發(fā)明所選用的原料均可以在市面上購(gòu)買(mǎi)；其中：裂解液即為dna提取液，該試劑盒由寶生物工程有限公司生產(chǎn)，試劑盒英文全稱：mightyprepreagentfordna寶生物公司生產(chǎn)，產(chǎn)品編號(hào)：9182。premiextaqtm即探針?lè)晒舛縫cr反應(yīng)專用試劑，購(gòu)自寶生物工程有限公司，產(chǎn)品編號(hào)：rr390q。rnase，即rna酶。購(gòu)自索萊寶生物公司，產(chǎn)品編號(hào)：r1030。proteinasek，即蛋白酶k，購(gòu)自索萊寶生物公司，產(chǎn)品編號(hào)：p1120。bufferdigestion(緩沖消化液)，bufferpf(緩沖液pf)，bufferbd(緩沖液bd)，pwsolution(溶液pw)，washsolution(洗液)及tebuffer(te緩沖液)均購(gòu)自ezup柱式真菌基因組dna抽提試劑盒，產(chǎn)品編號(hào)：b518259-0050生產(chǎn)廠家：生工生物工程(上海)股份有限公司。solutioni*，pmd19-t載體、controlinsertdna*2均來(lái)自廠家寶生物工程有限公司，試劑盒名稱：pmd19-tsimplevector，產(chǎn)品編號(hào)：d104a。jm-109感受態(tài)細(xì)胞，soc培養(yǎng)基，均購(gòu)自寶生物大腸桿菌(jm109)感受態(tài)細(xì)胞試劑盒，產(chǎn)品編號(hào)：9052，廠家：寶生物工程有限公司。x-gal，即用型溶液，廠家：生工生物工程(上海)股份有限公司，規(guī)格編號(hào)：b541006-0001。iptg即用型溶液，廠家：生工生物工程(上海)股份有限公司，規(guī)格編號(hào)：b541007-0001。amp滅菌氨芐青霉素鈉溶液，產(chǎn)品編號(hào)：b540722-0010廠家：生工生物工程(上海)股份有限公司。solutioni，solutionii，solutioniii，spincolumn：核酸純化柱，bufferwa，bufferwb均購(gòu)自takara質(zhì)粒dna小量純化試劑盒產(chǎn)品編號(hào)：9760廠家：寶生物工程有限公司。本發(fā)明所選用的特異性引物及熒光探針序列，為參考期刊《epatechnologyformoldidentificationandenumeration》，第7-8頁(yè)所述的特異性引物和探針序列，內(nèi)容為：eurotium(aspergillus)amstelodami/chevalieri/herbariorum/rubrum/repens(assayname：eamst)forwardprimereamstf1：5'-gtggcggcaccatgtctreverseprimereamstr1：5'-ctggttaaaaagattggttgcgaprobeeamstp1：5’-cagctggacctacgggagcggg一、實(shí)施方法(1)菌株dna提取進(jìn)行散囊菌屬基因組dna的提取，得到dna溶液；具體步驟如下：(a)純種培養(yǎng)散囊菌屬微生物，收集其菌絲；(b)將潔凈且干燥的研缽、研磨棒及鑰匙用錫箔紙包裹嚴(yán)實(shí)，進(jìn)行高溫滅菌，研磨前，先倒適量液氮于研缽中，對(duì)研缽和研磨棒進(jìn)行預(yù)冷；(c)待液氮揮發(fā)干，再倒適量液氮于研缽中，稱取0.10g菌絲樣品，加入研缽中，待液氮完全揮發(fā)，快速研磨樣品至粉末狀，得到菌絲粉末；(d)用鑰匙刮取菌絲粉末于1.5ml離心管中，于離心管底部正上方加入200μlbufferdigestion和2μlβ-巰基乙醇，再加入20μlproteinasek溶液，震蕩混勻后，56℃恒溫水浴1h至細(xì)胞完全裂解；水浴過(guò)程中，每10min混勻一次離心管，混勻方法：用手指彈撥離心管底端至液體為均一液體；(c)往上述水浴后的離心管中加入100μlbufferpf，混勻后于-20℃的條件下靜置5min；然后室溫10000rpm離心5min，取上清液，將其轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管中；(d)往取出的上清液中加入200μlbufferbd混勻后，再加入200μl的無(wú)水乙醇，充分混勻后，將溶液和半透明纖維狀懸浮物全部移至收集管的吸附柱內(nèi)，靜置2min，然后10000rpm室溫離心1min，倒掉收集管中的廢液，用潔凈紙片擦干收集管口的廢液；(e)將吸附柱放回收集管，加入500μlpwsolution，10000rpm離心30s倒掉收集管中的廢液，擦凈管口；將吸附柱放回收集管，加入500μlwashsolution，10000rpm離心30s倒掉收集管中的廢液，擦凈管口；然后將吸附柱重新放回收集管中，于室溫12000rpm離心2min，離去殘留的washsolution，擦凈管口；(f)取出上述吸附柱，放入新的1.5ml離心管中，加入50μltebuffer靜置3min，12000rpm室溫離心2min，然后收集dna溶液，在-20℃條件下保存?zhèn)溆谩?2)特異性引物及熒光探針設(shè)計(jì)本發(fā)明所選用的特異性引物及熒光探針序列，為參考期刊《epatechnologyformoldidentificationandenumeration》，第7-8頁(yè)所述的特異性引物和探針序列。正向引物forwardprimereamstf1：5'-gtggcggcaccatgtct反向引物reverseprimereamstr1：5'-ctggttaaaaagattggttgcga熒光探針的序列probeeamstp1：5’-cagctggacctacgggagcggg探針修飾：6-fam\eclipse(3)引物特異性檢測(cè)用步驟(1)提取方法得到的dna溶液，以ddh2o為陰性對(duì)照，檢測(cè)步驟(2)的特異性引物的特異性；實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)體系：使用eppendorf熒光定量pcr儀器進(jìn)行，每個(gè)樣品取1μl作為模板。反應(yīng)體系及反應(yīng)條件如下：(a)反應(yīng)體系：使用eppendorf熒光定量pcr儀器進(jìn)行，每個(gè)樣品取1μl作為模板；25μl的熒光定量pcr反應(yīng)體系含有成分如下：premiextaqtm，12.5μl；引物f，0.5μl；引物r，0.5μl；dna模板，2μl；6-fam修飾探針，0.1μl；dh2o，25μl；(b)反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30s，1個(gè)循環(huán)：95℃變性5s、55℃退火10s、72℃延伸20s，45個(gè)循環(huán)。(4)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立(a)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備采用上述散囊菌屬基因組為模板，采用步驟(3)中的特異性引物，進(jìn)行普通pcr，得到產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，純化回收具體步驟參照試劑盒天根通用型dna純化回收試劑盒(離心柱型)操作步驟；將純化回收的目的dna片段經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)化，制備成質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，并測(cè)定質(zhì)粒濃度，計(jì)算出質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)。具體步驟如下：1)pmd載體連接將散囊菌基因組連接入pmd載體中，在微量離心管中加入表1所示物質(zhì)，全量為5μl；然后加入5ul的solutioni*；16℃反應(yīng)30min。表1試劑使用量pmd19-t載體1ulcontrolinsertdna*21uldh2oupto5ul2)導(dǎo)入jm-109感受態(tài)細(xì)胞a)將感受態(tài)細(xì)胞使用前在冰上融化，輕微混合，取100μl上述jm109感受態(tài)細(xì)胞于4ml離心管中；b)將10ul上述連接載體加入到100uljm109感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30min，用無(wú)菌水設(shè)置陰性對(duì)照；c)42℃加熱60s后，再在冰上放置1min，加入890ulsoc培養(yǎng)基，37℃條件下振蕩培養(yǎng)60min，振蕩頻率：180rpm；d)然后在含有x-gal、ipgt、amp的lb-瓊脂平板培養(yǎng)劑上培養(yǎng)，形成單菌落，37℃過(guò)夜培養(yǎng)；在超凈工作臺(tái)中，從長(zhǎng)有菌落的lb平板上挑取3個(gè)白色陽(yáng)性菌落和1個(gè)藍(lán)色陰性菌落，分別接種于裝有4mllb氨芐培養(yǎng)液的a、b、c和d試管內(nèi)，于37℃震蕩15h；e)配制25μl上述步驟(3)的反應(yīng)體系，進(jìn)行pcr，其條件及體系與普通pcr一致，電泳及凝膠成像，再進(jìn)行陽(yáng)性重組質(zhì)粒測(cè)序。3)質(zhì)粒提取及濃度檢測(cè)a)將上述a、b、c及d試管的菌落培養(yǎng)液進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)15h，并取出菌落長(zhǎng)勢(shì)較好的2種菌落培養(yǎng)液，再?gòu)脑?種菌落培養(yǎng)液中分別取出1.5ml的菌落培養(yǎng)液，12000rpm離心2min，以沉淀菌種，棄上清；b)用250ul的solutioni(含rnasea)充分懸浮細(xì)菌沉淀，加入250ul的solutionii用手指彈動(dòng)離心管底端，使菌體充分裂解，形成透明溶液，加入350ul的4℃的預(yù)冷的solutioniii，用手指彈動(dòng)離心管底端，使菌體充分裂解，直至形成緊實(shí)凝集塊，然后室溫靜置2min；c)室溫12000rpm離心10min，取上清液，將試劑盒中的spincolumn安置于離心管中，然后將上清液轉(zhuǎn)移至spincolumn中，12000rpm離心1min，棄濾液；d)將500ul的bufferwa加入spincolumn中，12000rpm離心30s，棄濾液；e)將700ul的bufferwb加入spinculumn中，12000rpm離心30s，棄濾液，重復(fù)一次；f)重新將spinculumn安置于收集管上，12000rpm，離心1min。除盡殘留洗液，將spinculumn安置于新的1.5mld的離心管上，在spinculumn膜的中央處加入30ul滅菌蒸餾水，室溫靜置1min，12000rpm離心1min洗脫dna，-20℃保存，備用；g)用nanodrop(超微量紫外分光光度計(jì))檢測(cè)質(zhì)粒原液的濃度及純度，計(jì)算其拷貝數(shù)(copies/ml)，計(jì)算公式：拷貝數(shù)＝6.02×1023×濃度×10-9/(擴(kuò)增堿基數(shù)×660)4)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制將上述已知濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋，即稀釋濃度分別為2.0×107，2.0×106，2.0×105，2.0×104，2.0×103，2.0×102，2.0×101copies/μl；每個(gè)稀釋度平行三次，同時(shí)以無(wú)菌水為模板作為陰性對(duì)照；通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增，檢測(cè)引物靈敏度，并以拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值為x軸，以ct值為y軸，構(gòu)建實(shí)時(shí)熒光定量pcr標(biāo)準(zhǔn)曲線，并確定其靈敏度。(5)茶樣dna提取(a)將茶樣預(yù)處理，得到菌絲體，備用；茶樣預(yù)處理的具體步驟為：取500ml錐形瓶裝100ml生理鹽水(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.85％naci)和少量玻璃珠，高壓蒸汽滅菌；稱取茶葉樣品各20g倒入經(jīng)滅菌的錐形瓶中，室溫下150rpm振蕩30min，將液體轉(zhuǎn)移至50mi離心管中，在4℃條件下，10000r/min離心10min，去除上清液，收集沉淀，用滅菌生理鹽水沖洗錐形瓶中茶葉；并重復(fù)振蕩、離心、收集沉淀及生理鹽水沖洗茶葉的上述步驟4次，將得到的沉淀物用1.0ml滅菌生理鹽水懸浮，得到菌絲體，備用；(b)將上述菌絲體加入裝有1ml裂解液的離心管中，靜置5min；然后震蕩混勻，在95℃恒溫水浴10min；(c)水浴后，將上述混合液在4℃，12000rpm的條件下離心2min；然后取上清液，得到茶樣dna提取液，在-20℃條件下保存?zhèn)溆谩?6)茶樣中散囊菌的數(shù)目檢測(cè)將步驟(5)得到的茶樣dna提取液中真菌菌絲基因組dna為模板，采用步驟(3)中的特異性引物進(jìn)行熒光定量pcr擴(kuò)增，得到不同樣品熒光定量pcr的ct值，帶入步驟(4)中標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，計(jì)算出拷貝數(shù)，通過(guò)換算，即可得到茶樣中散囊菌屬的數(shù)目。二、測(cè)試結(jié)果(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線用dh2o按10倍梯度稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，取拷貝數(shù)為2.0×107-2.0×102copies/ul的6個(gè)梯度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量pcr反應(yīng)，得到相應(yīng)梯度的擴(kuò)增曲線，如圖1所示為梯度稀釋質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線圖。系統(tǒng)根據(jù)各個(gè)梯度的ct值自動(dòng)擬合出標(biāo)準(zhǔn)曲線，以ct值為縱坐標(biāo)，起始拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)做回歸曲線，即為散囊菌熒光定量pcr檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示。本發(fā)明所指系統(tǒng)為takaratp800寶生物熒光定量檢測(cè)儀內(nèi)部自帶系統(tǒng)。所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y＝-3.683×log(x)+42.39。該曲線斜率為-3.683，縱坐標(biāo)截距為42.39，相關(guān)系數(shù)r2＝0.999，擴(kuò)增效率為86.1％，cq值和濃度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。(2)引物及探針的靈敏性檢測(cè)用10×倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒(2.0×101copies/ul和2.0×100copies/ul)為模板，按照上述熒光定量反應(yīng)條件進(jìn)行靈敏性檢測(cè)。如圖3所示為熒光定量法靈敏度檢測(cè)圖，由圖可知最低檢測(cè)限為2.0×100copies/ul，即每個(gè)反應(yīng)需要2個(gè)拷貝，檢測(cè)以上的濃度均出現(xiàn)良好的擴(kuò)增信號(hào)，空白對(duì)照沒(méi)有擴(kuò)增信號(hào)。(3)熒光定量pcr特異性分析選取10種真菌，包括4中散囊菌及6種非散囊菌，以赤散囊菌(eurotiumrubrum)，匍匐散囊菌(eurotiumrepens)，雪黃散囊菌(eurotiumniveoglaucum)，阿姆斯特丹散囊菌(eurotiumamstelodami)dna為模板，以ddh2o為陰性對(duì)照，同上條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)，分析該方法的特異性；如圖4所示為熒光定量法特異性檢測(cè)圖，經(jīng)檢測(cè)，雪黃散囊菌、阿姆斯特丹散囊囊菌、赤散囊囊菌、匍匐散囊菌通過(guò)菌株擴(kuò)增為陽(yáng)性，而黑曲霉菌、米曲霉菌、塔賓曲霉菌、產(chǎn)黃曲霉菌、桔青霉菌、溜曲霉菌均未出現(xiàn)熒光信號(hào)，擴(kuò)增結(jié)果為陰性，空白對(duì)照ntc為陰性，說(shuō)明該引物及探針對(duì)散囊菌屬的檢測(cè)具有良好的特異性。(4)熒光定量法重現(xiàn)性檢測(cè)分別取2μl上述系列稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為模板，同上條件進(jìn)行探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)，每個(gè)稀釋梯度標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒做3個(gè)復(fù)孔。如表2所示為taqman探針實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)散囊菌的重現(xiàn)性檢測(cè)結(jié)果。表2上表中x為平均值，sd為標(biāo)準(zhǔn)差，cv為變異系數(shù)。由表2可知，該方法的cv值在0.10％～0.98％之間，小于1％。(5)茶葉中散囊菌檢測(cè)結(jié)果參照實(shí)施方法中的步驟(5)對(duì)茶葉(以六堡茶為例)進(jìn)行預(yù)處理及dna提取，同上條件進(jìn)行探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)，如圖5所示為六堡茶樣品熒光定量pcr擴(kuò)增曲線圖，圖6為六堡茶樣品初始散囊菌數(shù)目。表3為六堡茶樣品初始樣品散囊菌數(shù)目。表3茶樣名稱拷貝數(shù)copies/2l初始數(shù)目(cfu/g)蒼順六堡茶333174.509229210金花黑茶六堡茶331741.509189515梧州六堡茶(1910#)231841.706422207三鶴六堡茶(錫箔裝)172813.404787074三鶴六堡茶071213652.61378188梧州六堡茶(1916#)14263.07395098中茶六堡茶11972.82331657三鶴六堡茶1709151.464195六堡茶成品茶(簍)108.062993由圖5、圖6及表3可知，本發(fā)明的方法能準(zhǔn)確、快速測(cè)定茶葉中散囊菌的數(shù)目，本發(fā)明方法檢測(cè)特異性強(qiáng)、靈敏性高，能在較短的時(shí)間內(nèi)得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果，大大減少工作量和工作時(shí)間，值得推廣應(yīng)用。本發(fā)明的散囊菌的探針熒光定量pcr快速檢測(cè)方法，可應(yīng)用于所有的黑茶，包括但不限于湖南黑茶(茯茶、千兩茶、黑磚茶、三尖)、湖北青磚茶、四川藏茶(邊茶)、安徽古黟黑茶(安茶)、云南黑茶(普洱茶)、廣西六堡茶及陜西黑茶(茯茶)。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以作出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁(yè)12