本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及分子標(biāo)志物在骨關(guān)節(jié)炎中的應(yīng)用，具體的該分子標(biāo)志物為FGGY。

背景技術(shù)：

骨關(guān)節(jié)炎是一種慢性關(guān)節(jié)疾病。它以關(guān)節(jié)軟骨的變性、軟骨組織的破壞以及關(guān)節(jié)周圍骨質(zhì)的增生為特征。骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率隨著年齡的增長(zhǎng)而增高，它是一種常見的老年性的關(guān)節(jié)疾病，也是老年人疼痛和致殘的主要病因。全世界范圍內(nèi)的研究顯示60-65％的60歲以上老人患有癥狀性骨關(guān)節(jié)炎，并且80％的此類患者活動(dòng)受限。

隨著中國(guó)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展、營(yíng)養(yǎng)水平的提高以及醫(yī)療水平的改善，居民的平均壽命得到延長(zhǎng)且逐漸步入老齡化社會(huì)；因此對(duì)于慢性病的預(yù)防和控制變得更加重要。骨關(guān)節(jié)炎作為一種慢性病，給社會(huì)帶來(lái)了諸如殘疾、活動(dòng)障礙和疼痛的社會(huì)問題，更增加了醫(yī)療和護(hù)理的負(fù)擔(dān)。

雖然目前研究認(rèn)為骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病與年齡、性別有關(guān)，且與遺傳因素和環(huán)境因素等密切相關(guān)，但骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制仍不明確。骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病通常累及膝關(guān)節(jié)，早期癥狀較輕，容易延誤診斷，臨床上大多數(shù)骨關(guān)節(jié)炎患者至醫(yī)院就診時(shí)已經(jīng)處于中晚期，晚期患者往往只能通過關(guān)節(jié)置換手術(shù)治療，給患者和家屬帶來(lái)了巨大的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，骨關(guān)節(jié)炎的早期診斷、治療效果監(jiān)測(cè)和預(yù)后評(píng)估對(duì)于骨關(guān)節(jié)炎的防治具有重要作用。目前，骨關(guān)節(jié)炎的診斷仍然依賴于臨床癥狀和X線影像學(xué)診斷，K-L分級(jí)仍為判斷骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度、預(yù)后和指導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎治療的主要依據(jù)。理論上，分子標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)是疾病診斷、療效檢測(cè)和預(yù)后評(píng)估最敏感、最有效的指標(biāo)。因此，尋找新的骨關(guān)節(jié)炎分子標(biāo)志物和藥物靶點(diǎn)是骨關(guān)節(jié)炎早期防治中亟待解決的關(guān)鍵問題。

分子靶向治療是指在細(xì)胞分子水平上，調(diào)控疾病相關(guān)基因、干預(yù)疾病異常的信號(hào)通路或阻斷能量通路，尋找可干預(yù)的分子靶點(diǎn)對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的靶向治療具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種用于骨關(guān)節(jié)炎診斷和治療的分子標(biāo)志物。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了FGGY基因的應(yīng)用，用于制備診斷骨關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)品。

進(jìn)一步，所述產(chǎn)品通過測(cè)定樣本中FGGY的表達(dá)水平來(lái)診斷骨關(guān)節(jié)炎。

進(jìn)一步，F(xiàn)GGY在骨關(guān)節(jié)炎中表達(dá)上調(diào)。

進(jìn)一步，所述產(chǎn)品包括通過通過測(cè)序技術(shù)、核酸雜交技術(shù)、核酸擴(kuò)增技術(shù)或免疫測(cè)定的方法檢測(cè)FGGY基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物的變化。

進(jìn)一步，所述核酸擴(kuò)增技術(shù)選自聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、鏈置換擴(kuò)增和基于核酸序列的擴(kuò)增。

本發(fā)明提供了一種診斷骨關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品能夠通過檢測(cè)樣本中FGGY基因基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物的變化來(lái)診斷骨關(guān)節(jié)炎。

進(jìn)一步，所述產(chǎn)品包括芯片、試劑盒或制劑。

進(jìn)一步，所述產(chǎn)品包括芯片、試劑盒或制劑。其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片；所述基因芯片包括固相載體以及固定在固相載體的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括用于檢測(cè)FGGY基因轉(zhuǎn)錄水平的針對(duì)FGGY基因的寡核苷酸探針；所述蛋白質(zhì)芯片包括固相載體以及固定在固相載體的FGGY蛋白的特異性抗體或配體；所述試劑盒包括基因檢測(cè)試劑盒和蛋白免疫檢測(cè)試劑盒；所述基因檢測(cè)試劑盒包括用于檢測(cè)FGGY基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑；所述蛋白免疫檢測(cè)試劑盒包括FGGY蛋白的特異性抗體或配體。

本發(fā)明所述的基因芯片或基因檢測(cè)試劑盒可用于檢測(cè)包括FGGY基因在內(nèi)的多個(gè)基因(例如，與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的多個(gè)基因)的表達(dá)水平。所述蛋白芯片或蛋白免疫檢測(cè)試劑盒可用于檢測(cè)包括FGGY蛋白在內(nèi)的多個(gè)蛋白質(zhì)(例如與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的多個(gè)蛋白質(zhì))的表達(dá)水平。將骨關(guān)節(jié)炎的多個(gè)標(biāo)志物同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，可大大提高骨關(guān)節(jié)炎診斷的準(zhǔn)確率。

本發(fā)明提供了FGGY基因在制備治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物組合物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，所述藥物組合物包括FGGY基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物的下調(diào)劑。所述下調(diào)劑包括抑制FGGY基因表達(dá)的物質(zhì)、抑制FGGY基因表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定性的物質(zhì)、和/或抑制FGGY基因表達(dá)產(chǎn)物活性的物質(zhì)。

優(yōu)選的，所述下調(diào)劑為針對(duì)FGGY基因的siRNA、或針對(duì)FGGY蛋白的抗體。

進(jìn)一步，所述藥物組合物還包括抗骨關(guān)節(jié)的其他藥物，藥物之間的聯(lián)用，有利于疾病的有效的治療。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了分子標(biāo)志物FGGY與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展相關(guān)，通過檢測(cè)受試者FGGY的變化，可用于骨關(guān)節(jié)炎的診斷。

本發(fā)明為骨關(guān)節(jié)炎的機(jī)制研究提供了理論依據(jù)，為骨關(guān)節(jié)炎的臨床診斷和治療提供了一種輔助手段。

附圖說明

圖1為利用高通量測(cè)序檢測(cè)基因在骨關(guān)節(jié)炎組織中的差異表達(dá)情況圖；

圖2為利用QPCR檢測(cè)FGGY基因在骨關(guān)節(jié)炎患者中的表達(dá)情況圖。

具體的實(shí)施方式

本發(fā)明經(jīng)過廣泛而深入的研究，通過大量篩選，首次發(fā)現(xiàn)了在骨關(guān)節(jié)炎中FGGY呈現(xiàn)特異性低表達(dá)。

FGGY

FGGY基因編碼的蛋白可以磷酸化核酮糖、核糖醇、L-阿拉伯糖醇等碳水化合物，有研究發(fā)現(xiàn)在一些人群中，該基因的多態(tài)性與散發(fā)型肌萎縮側(cè)索硬化有關(guān)。

可用于本發(fā)明的FGGY多核苷酸或蛋白(多肽)序列包括各種來(lái)源和物種的FGGY，并且包括野生型、突變型的FGGY，或其活性片段。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述FGGY來(lái)源于人類，一種代表性的人FGGY的編碼序列或氨基酸序列分別如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。

本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。

編碼FGGY的成熟多肽的多核苷酸包括：只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。術(shù)語(yǔ)“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。

本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼多肽的功能。

本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段，包括正義和反義的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長(zhǎng)度至少含15個(gè)核苷酸，較好是至少30個(gè)核苷酸，更好是至少50個(gè)核苷酸，最好是至少100個(gè)核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼FGGY蛋白的多核苷酸。

本發(fā)明的人FGGY核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通常可以用PCR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)已公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。

宿主細(xì)胞和載體

本發(fā)明所述攜帶基因的載體是本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體、包括質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、病毒等。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有：大腸桿菌，鏈霉菌屬的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細(xì)胞；CHO、COS、或293細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞等。

用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用CaCl₂法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl₂。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法：磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。

在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于：常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。

分子標(biāo)志物

本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)“分子標(biāo)志物”是其在組織或細(xì)胞中的表達(dá)水平與正?；蚪】导?xì)胞或組織的表達(dá)水平相比發(fā)生改變的任何基因或蛋白。

本文包含用于檢測(cè)分子標(biāo)志物表達(dá)的現(xiàn)有技術(shù)中任何可用方法。本發(fā)明分子標(biāo)志物的表達(dá)可在核酸水平上被檢測(cè)(如，RNA轉(zhuǎn)錄物)或蛋白質(zhì)水平。通過“檢測(cè)表達(dá)”旨在確定RNA轉(zhuǎn)錄物或其分子標(biāo)志物基因的表達(dá)產(chǎn)物的數(shù)量或存在。因此，“檢測(cè)表達(dá)”包含一分子標(biāo)志物被確定不能被表達(dá)、不能被檢測(cè)表達(dá)，表達(dá)在低水平、表達(dá)在正常水平或過表達(dá)的實(shí)例。為了確定低表達(dá)，被檢查的所述身體樣本能夠與相應(yīng)的來(lái)自健康人的身體樣本比較。那就是說，所述表達(dá)的“正?！彼绞欠肿訕?biāo)志物的表達(dá)水平，例如在來(lái)自人類主體或未被骨關(guān)節(jié)炎折磨的病患的宮頸組織樣本中的分子標(biāo)志物表達(dá)水平。這個(gè)樣本可以以標(biāo)準(zhǔn)化形式呈現(xiàn)。在一些實(shí)施例中，分子標(biāo)志物過表達(dá)的確定需不比較身體樣本和相應(yīng)來(lái)自健康人的身體樣本。

檢測(cè)方法

本發(fā)明所述核酸擴(kuò)增技術(shù)選自聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、鏈置換擴(kuò)增(SDA)和基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)。其中，PCR需要在擴(kuò)增前將RNA逆轉(zhuǎn)錄成DNA(RT-PCR)，TMA和NASBA直接擴(kuò)增RNA。

通常，PCR使用變性、引物對(duì)與相反鏈的退火以及引物延伸的多個(gè)循環(huán)，以指數(shù)方式增加靶核酸序列的拷貝數(shù)；RT-PCR則將逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)用于從mRNA制備互補(bǔ)的DNA(cDNA)，然后將cDNA通過PCR擴(kuò)增以產(chǎn)生DNA的多個(gè)拷貝；TMA在基本上恒定的溫度、離子強(qiáng)度和pH的條件下自身催化地合成靶核酸序列的多個(gè)拷貝，其中靶序列的多個(gè)RNA拷貝自身催化地生成另外的拷貝，TMA任選地包括使用阻斷，部分、終止部分和其他修飾部分，以改善TMA過程的靈敏度和準(zhǔn)確度；LCR使用與靶核酸的相鄰區(qū)域雜交的兩組互補(bǔ)DNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸在熱變性、雜交和連接的重復(fù)多個(gè)循環(huán)中通過DNA連接酶共價(jià)連接，以產(chǎn)生可檢測(cè)的雙鏈連接寡核苷酸產(chǎn)物；SDA使用以下步驟的多個(gè)循環(huán)：引物序列對(duì)與靶序列的相反鏈進(jìn)行退火，在存在dNTPαS下進(jìn)行引物延伸以產(chǎn)生雙鏈半硫代磷酸化的(hemiphosphorothioated)引物延伸產(chǎn)物，半修飾的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行的核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)的切刻，以及從切口3'端進(jìn)行的聚合酶介導(dǎo)引的物延伸以置換現(xiàn)有鏈并產(chǎn)生供下一輪引物退火、切刻和鏈置換的鏈，從而引起產(chǎn)物的幾何擴(kuò)增。

探針

“探針”是指能夠用于測(cè)量特定基因的表達(dá)情況的分子。示例性探針包括PCR引物以及基因特異性DNA寡核苷酸探針，例如固定于微陣列基底上的微陣列探針、定量核酸酶保護(hù)檢驗(yàn)探針、與分子條形碼連接的探針、以及固定于珠上的探針。

本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)“探針”指能與另一分子的特定序列或亞序列或其它部分結(jié)合的分子。除非另有指出，“探針”通常指能通過互補(bǔ)堿基配對(duì)與另一多核苷酸(往往稱為“靶多核苷酸”)結(jié)合的多核苷酸探針。根據(jù)雜交條件的嚴(yán)謹(jǐn)性，探針能和與該探針缺乏完全序列互補(bǔ)性的靶多核苷酸結(jié)合。探針可作直接或間接的標(biāo)記，其范圍包括引物。雜交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位雜交測(cè)定法。

作為探針，可以使用熒光標(biāo)記、放射標(biāo)記、生物素標(biāo)記等對(duì)癌檢測(cè)用多核苷酸進(jìn)行了標(biāo)記的標(biāo)記探針。多核苷酸的標(biāo)記方法本身是公知的?？赏ㄟ^如下方法檢查試樣中是否存在受試核酸：固定受試核酸或者其擴(kuò)增物，與標(biāo)記探針進(jìn)行雜交，洗滌，以及然后測(cè)定與固相結(jié)合的標(biāo)記。備選地，還可固定癌檢測(cè)用多核苷酸，使受試核酸與其雜交，然后應(yīng)用標(biāo)記探針等檢測(cè)結(jié)合于固相上的受試核酸。在這種情況下，結(jié)合于固相上的癌檢測(cè)用多核苷酸也稱為探針。使用多核苷酸探針測(cè)定受試核酸的方法在本領(lǐng)域也是公知的?？梢匀缦逻M(jìn)行該方法：在緩沖液中使多核苷酸探針與受試核酸在Tm或者其附近(優(yōu)選在±4℃以內(nèi))接觸用于雜交，洗滌，然后測(cè)定雜交的標(biāo)記探針或者與固相探針結(jié)合的模板核酸。

在作為探針使用的多核苷酸的大小優(yōu)選為18個(gè)或更多個(gè)核苷酸、更優(yōu)選為20個(gè)或更多個(gè)核苷酸，以及編碼區(qū)域的全長(zhǎng)或更少。作為引物使用時(shí)，該多核苷酸大小優(yōu)選為18個(gè)或更多個(gè)核苷酸，以及50個(gè)或更少核苷酸。這些探針具有與靶點(diǎn)基因的特定的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列。這里，所謂“互補(bǔ)”，只要是雜交即可，可以不是完全互補(bǔ)。這些多核苷酸通常相對(duì)于該特定的堿基序列具有80％以上、優(yōu)選90％以上、更優(yōu)選95％以上、特別優(yōu)選100％的同源性。這些探針可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以為在其一部分或全部中核苷酸通過PN、LNA、ENA、GNA、TNA等人工核酸置換得到的多核苷酸。

芯片

術(shù)語(yǔ)“芯片”也稱為“陣列”，指包含連接的核酸或肽探針的固體支持物。陣列通常包含按照不同的已知位置連接至基底表面的多種不同的核酸或肽探針。這些陣列，也稱為“微陣列”，通?？梢岳脵C(jī)械合成方法或光引導(dǎo)合成方法來(lái)產(chǎn)生這些陣列，所述光引導(dǎo)合成方法合并了光刻方法和固相合成方法的組合。陣列可以包含平坦的表面，或者可以是珠子、凝膠、聚合物表面、諸如光纖的纖維、玻璃或任何其它合適的基底上的核酸或肽?？梢砸砸欢ǖ姆绞絹?lái)包裝陣列，從而允許進(jìn)行全功能裝置的診斷或其它方式的操縱。

抗體

在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“抗體”是指選擇性結(jié)合目標(biāo)抗原的天然或合成抗體。該術(shù)語(yǔ)包括多克隆和單克隆抗體。除了完整的免疫球蛋白分子外，那些免疫球蛋白分子的片段或聚合物以及選擇性結(jié)合目標(biāo)抗原的免疫球蛋白分子的人類或人源化形式也包括在術(shù)語(yǔ)“抗體”的范圍內(nèi)，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性即可?！皢慰寺】贵w”指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成群體的各個(gè)抗體相同和/或結(jié)合相同表位，除了生產(chǎn)單克隆抗體的過程中可能產(chǎn)生的可能變體外，此類變體一般以極小量存在。此類單克隆抗體典型的包括包含結(jié)合靶物的多肽序列的抗體，其中靶物結(jié)合多肽序列是通過包括從眾多多肽序列中選擇單一靶物結(jié)合多肽序列在內(nèi)的過程得到的。

單克隆抗體還包括“嵌合”抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性即可。

多克隆抗體包含對(duì)產(chǎn)生人抗體的動(dòng)物(例如，小鼠)免疫FGGY蛋白質(zhì)而得的抗體。當(dāng)制備了嵌合抗體或人源化抗體之后，可以將可變區(qū)(例如，F(xiàn)R)和/或恒定區(qū)中的氨基酸用其他氨基酸替換等。

藥物組合物

本發(fā)明的藥物組合物包括FGGY基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物的下調(diào)劑，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí)，可抑制FGGY基因和/或蛋白的表達(dá)或活性，從而抑制骨關(guān)節(jié)炎。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述下調(diào)劑包括抑制FGGY基因表達(dá)的物質(zhì)、抑制FGGY基因表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定性的物質(zhì)、和/或抑制FGGY基因表達(dá)產(chǎn)物活性的物質(zhì)。

通?？蓪⑦@些配置于無(wú)毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳的pH約為6-8，盡管pH值可隨被配置物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配置好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑給藥，其中包括但并不限于口服給藥、非胃腸道給藥、通過吸入噴霧給藥、局部給藥、直腸給藥、鼻給藥、頰給藥、或通過植入的貯藥裝置給藥。本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)非胃腸道包括皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞠內(nèi)、損傷部位內(nèi)、和顱內(nèi)注射或輸注技術(shù)。只要能達(dá)到目標(biāo)組織即可。

本發(fā)明中的藥物組合物，含有安全有效量的本發(fā)明FGGY蛋白或其下調(diào)劑以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但不限于)：鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類藥物組合物，可以通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無(wú)菌條件下制備?；钚猿煞值慕o藥量是治療的有效量。

本發(fā)明的藥物組合物可以用于下調(diào)內(nèi)源性的FGGY蛋白過多，通過降低FGGY蛋白的表達(dá)或減弱FGGY蛋白的功能，從而治療因FGGY蛋白增加導(dǎo)致的骨關(guān)節(jié)炎。

本發(fā)明的藥物還可與其他治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物聯(lián)用，其他治療性化合物可以與主要的活性成分同時(shí)給藥，甚至在同一組合物中同時(shí)給藥。還可以以單獨(dú)的組合物或與主要的活性成分不同的劑量形式單獨(dú)給予其它治療性化合物。主要成分的部分劑量可以與其它治療性化合物同時(shí)給藥，而其它劑量可以單獨(dú)給藥。在治療過程中，可以根據(jù)癥狀的嚴(yán)重程度、復(fù)發(fā)的頻率和治療方案的生理應(yīng)答，調(diào)整本發(fā)明藥物組合物的劑量。

本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)“治療”是指以治愈、改善、穩(wěn)定或預(yù)防疾病、病理狀態(tài)或病癥為目的對(duì)患者進(jìn)行的醫(yī)學(xué)管理。該術(shù)語(yǔ)包括積極療法，即專門以改善疾病、病理狀態(tài)或病癥為目的的治療，并且還包括病因治療，即以除去相關(guān)疾病、病理狀態(tài)或病癥的病因?yàn)槟康牡闹委?。此外，該術(shù)語(yǔ)還包括姑息治療，即設(shè)計(jì)用于緩解癥狀而非治愈疾病、病理狀態(tài)或病癥的治療；預(yù)防性治療，即以最大程度降低或者部分或完全抑制相關(guān)疾病、病理狀態(tài)或病癥的發(fā)展為目的的治療；以及支持性治療，即用于補(bǔ)充另一種以改善相關(guān)疾病、病理狀態(tài)或病癥為目的的特定療法的治療。

本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)“樣本”包括任何細(xì)胞、組織或體液取樣，其中包括但不限于，組織或細(xì)胞樣本的來(lái)源可以來(lái)自新鮮、冷凍和/或保存的器官或組織樣本的固體組織，或者活組織檢查或者抽吸物，血液或任何血液成分；體液如腦脊髓液、羊水、腹腔液或間質(zhì)液。組織樣本可以是初級(jí)或體外培養(yǎng)的細(xì)胞或細(xì)胞株?？蛇x地，組織或細(xì)胞樣本從疾病組織/器官獲取。組織樣本可能包含所述組織自然混合的化合物，諸如防腐劑、抗凝血?jiǎng)?、緩沖劑、固定劑、營(yíng)養(yǎng)劑、抗生素、或類似化合物。

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例1篩選與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的基因標(biāo)志物

1、樣品收集

各收集6例周圍正?；そM織和骨關(guān)節(jié)炎滑膜組織，均經(jīng)病理學(xué)診斷證實(shí)，所有患者術(shù)前未接受任何形式的治療。手術(shù)切下的樣本于液氮中凍存，患者均知情同意，上述所有標(biāo)本的取得均通過組織倫理委員會(huì)的同意。

2、RNA樣品的制備

取出凍存于液氮中的組織樣本，把組織樣本放入已預(yù)冷的研缽中進(jìn)行研磨，按照試劑盒中的說明書提取分離RNA。具體如下：

1)將1ml TRIzol在超凈臺(tái)里加入至玻璃勻漿瓶中(提前將勻漿瓶用烘箱180℃烘4個(gè)小時(shí))，將勻漿瓶按到儀器上，稱取50-100mg的組織放入玻璃勻漿瓶?jī)?nèi)，將轉(zhuǎn)速調(diào)至1500轉(zhuǎn)左右，開始在冰水浴中進(jìn)行勻漿，每研磨30s，停止30s，反復(fù)3-4次。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10％。

2)將加入TRIzol的樣品在室溫(15-30℃)放置10min，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3)1ml TRIzol加入200μl氯仿，劇烈振蕩2min，每隔1min晃動(dòng)一次，5-6次后，再靜止7min。

4)4℃，12000rpm，離心15min。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol的60％。

5)重復(fù)步驟3)和4)。

6)把上層水相轉(zhuǎn)移到新的EP管中(盡量不要吸取到中間層以免污染)。加入500μl異丙醇，室溫放置10min。

7)4℃，12000rpm，離心15min，離心后在管底出現(xiàn)白色沉淀。用移液器小心移去上清。

8)加入1ml 75％冷乙醇，震蕩洗滌沉淀。4℃，7500rpm，離心5min，小心棄掉上清。

9)重復(fù)步驟8)。

10)將EP管倒扣于濾紙上吸去多余的水分，并用10μl槍頭小心吸取管內(nèi)的液體(槍頭不要接觸RNA)，將EP管室溫放置5min。

11)加入40μl無(wú)RNase的水(DEPC水)，將提取的RNA稀釋5倍后，用Nanodrop檢測(cè)OD值與濃度，在管上做好標(biāo)記；置于-80℃冰箱保存。

3、高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

3.1 RNA-seq讀段定位

首先將低質(zhì)量的讀段去除得到清潔讀段，然后利用TopHat v1.3.1將清潔片段與UCSC H.sapiens參考基因組(hg19)進(jìn)行匹配，H.sapiens UCSC hg19版的預(yù)先構(gòu)建的索引從TopHat主頁(yè)下載，并作為參考基因組，利用TopHat與基因組匹配時(shí)，允許每個(gè)讀段(默認(rèn)到20)有多個(gè)匹配位點(diǎn)，最多2次錯(cuò)配。TopHat根據(jù)外顯子區(qū)域和GT-AG剪切信號(hào)建立可能的剪切位點(diǎn)庫(kù)，根據(jù)這些剪切位點(diǎn)庫(kù)將沒有定位到基因組的讀段定位到基因組上。我們使用TopHat方法的系統(tǒng)默認(rèn)參數(shù)。

3.2轉(zhuǎn)錄豐度評(píng)估

匹配上的讀段文件通過Cufflinks v1.0.3處理，Cufflinks v1.0.3將RNA-seq片段數(shù)目進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算轉(zhuǎn)錄本的相對(duì)豐度。FPKM值指的是每一百萬(wàn)測(cè)序片段中匹配到特定基因1kb長(zhǎng)的外顯子區(qū)域的片段數(shù)目。通過貝葉斯推理方法計(jì)算FPKM估計(jì)值的置信區(qū)間。Cufflinks使用的參考的GTF注釋文件從Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)下載(Homo_sapiens.GRCh37.63.gtf)。

3.3差異表達(dá)基因的檢測(cè)

將下載的Ensembl GTF文件和通過TopHat匹配的原始文件傳輸?shù)紺uffdiff，Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)豐度，檢測(cè)差異表達(dá)。在Cuffidff輸出中只有q值＜0.01，測(cè)試顯示成功的比較才被認(rèn)為是差異表達(dá)。

4、結(jié)果

RNA-seq結(jié)果顯示，F(xiàn)GGY基因在骨關(guān)節(jié)炎患者中的表達(dá)量顯著高于正常人的表達(dá)量。

實(shí)施例2 QPCR測(cè)序驗(yàn)證FGGY基因的差異表達(dá)

1、對(duì)FGGY基因差異表達(dá)進(jìn)行大樣本QPCR驗(yàn)證。按照實(shí)施例1中的樣本收集方式選擇正?；そM織和骨關(guān)節(jié)炎滑膜組織各80例。

2、RNA提取步驟如實(shí)施例1所述。

3、逆轉(zhuǎn)錄：(采用FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒(貨號(hào)：KR106)進(jìn)行mRNA反轉(zhuǎn)錄)

首先去除基因組DNA反應(yīng)，在試管中加入5×gDNA Buffer 2.0μl，TotalRNA 1μg，加Rnase Free ddH₂O使總體積至10μl，水浴鍋中42℃加熱3min，再將10×Fast RT Buffer 2.0μl，RT Enzyme Mix 1.0μl，F(xiàn)Q-RT Primer Mix 2.0μl，RNase Free ddH₂O 5.0μl，混合后加入上述試管中一起混合共20μl，水浴鍋中42℃加熱15min，95℃加熱3min，合成的cDNA需要長(zhǎng)期保存時(shí)，請(qǐng)于-20℃或更低溫度保存。

3)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(貨號(hào)：FP205)，進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

1)引物設(shè)計(jì)

根據(jù)Genebank中FGGY基因和GAPDH基因的編碼序列設(shè)計(jì)QPCR擴(kuò)增引物，由博邁德生物公司合成。具體引物序列如下：

FGGY基因：

正向引物為5’-GGACATATTCAGCAGAGA-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物為5’-AGCACTTGGTTTCCTATT-3’(SEQ ID NO.4)。

管家基因GAPDH的引物序列為：

正向引物：5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’(SEQ ID NO.5)

反向引物：5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’(SEQ ID NO.6)

2)按照表1配制20μl PCR反應(yīng)體系：

表1 PCR反應(yīng)體系

3)PCR反應(yīng)條件：：95°15min，(95℃10s，55℃30s，72℃32s)×40個(gè)循環(huán)，95℃15s，60℃60s，95℃15s。以SYBR Green作為熒光標(biāo)記物，在Light Cycler熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，ΔΔCT法進(jìn)行相對(duì)定量，每個(gè)樣進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

5、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算骨關(guān)節(jié)炎滑膜組織與正?；そM織熒光定量RT-PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，以P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

6、結(jié)果

如圖2所示，與對(duì)照組相比，F(xiàn)GGY基因在骨關(guān)節(jié)炎組織中表達(dá)顯著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，同RNA-sep結(jié)果一致。

上述實(shí)施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津市天津醫(yī)院

<120> 分子標(biāo)志物在骨關(guān)節(jié)炎中的應(yīng)用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1728

<212> DNA

<213> 人源

<400> 1

atgtctggtg gagaacagaa accagagagg tactatgtgg gtgtggacgt tggaacaggc 60

agtgtccgtg cagctctggt ggaccagagt ggggtcctgt tggcttttgc agaccagcca 120

attaagaatt gggagcccca gttcaaccac catgagcagt cctccgagga catctgggct 180

gcgtgctgtg ttgtcacaaa gaaagttgta caagggattg atttaaacca aattcgagga 240

cttgggtttg atgccacgtg ttctctggtt gttttggata agcagtttca cccattacca 300

gtcaaccagg aaggggattc ccatcgaaac gtcatcatgt ggctggacca tcgagcagtc 360

agtcaagtta acaggatcaa tgagaccaag cacagtgtcc tccagtacgt cgggggggtg 420

atgtctgtgg aaatgcaggc cccgaaactt ctgtggctga aagagaactt gagagagatt 480

tgctgggata aggcgggaca tttctttgat ctcccggact tcttatcgtg gaaggcaaca 540

ggtgtcacag cacggtctct ctgctccctg gtgtgtaagt ggacatattc agcagagaaa 600

ggctgggacg acagtttctg gaaaatgatt ggtttggaag actttgttgc agataattac 660

agcaaaatag gaaaccaagt gctacctcct ggagcttctc ttggaaatgg gctcacacca 720

gaggcagcaa gagaccttgg ccttctccct gggattgcgg tcgcagcttc actcattgat 780

gcccatgcag gaggactagg agtgattggg gcagatgtga gagggcacgg cctcatctgt 840

gaggggcagc cagtgacgtc acggctggct gtcatctgtg gaacgtcttc ttgtcacatg 900

gggatcagca aagacccgat ttttgtacca ggcgtctggg ggccttattt ctcagccatg 960

gtacctgggt tctggctgaa tgaaggtggt cagagcgtta ctggaaaatt gatagaccac 1020

atggtacaag gccatgctgc ttttccagaa ctacaagtaa aggccacagc cagatgccag 1080

agtatatatg catatttgaa cagtcacctg gatctgatta agaaggctca gcctgtgggt 1140

ttccttactg ttgatttaca tgtttggcca gatttccatg gcaaccggtc tcccttagca 1200

gatctgacac taaagggcat gagaaccact ggatatctgt atattccggc tttggcagcg 1260

ttgcactctc ccagttctct actctcccct caggtcaccg gattgaaact gtctcaggac 1320

cttgatgatc ttgccattct ctacctggcc acagttcaag ccattgcttt ggggactcgc 1380

ttcattatag aagccatgga ggcagcaggg cactcaatca gtactctttt cctatgtgga 1440

ggcctcagca agaatcccct ttttgtgcaa atgcatgcgg acattactgg catgcctgtg 1500

gtcctgtcgc aagaggtgga gtccgttctt gtgggtgctg ctgttctggg tgcctgtgcc 1560

tcaggggatt tcgcttctgt acaggaagca atggcaaaaa tgagcaaagt tgggaaagtt 1620

gtgttcccga gactacagga taaaaaatac tatgataaga aataccaagt attcctgaag 1680

ctggttgaac accagaagga gtatttggcg atcatgaatg atgactga 1728

<210> 2

<211> 575

<212> PRT

<213> 人源

<400> 2

Met Ser Gly Gly Glu Gln Lys Pro Glu Arg Tyr Tyr Val Gly Val Asp

1 5 10 15

Val Gly Thr Gly Ser Val Arg Ala Ala Leu Val Asp Gln Ser Gly Val

20 25 30

Leu Leu Ala Phe Ala Asp Gln Pro Ile Lys Asn Trp Glu Pro Gln Phe

35 40 45

Asn His His Glu Gln Ser Ser Glu Asp Ile Trp Ala Ala Cys Cys Val

50 55 60

Val Thr Lys Lys Val Val Gln Gly Ile Asp Leu Asn Gln Ile Arg Gly

65 70 75 80

Leu Gly Phe Asp Ala Thr Cys Ser Leu Val Val Leu Asp Lys Gln Phe

85 90 95

His Pro Leu Pro Val Asn Gln Glu Gly Asp Ser His Arg Asn Val Ile

100 105 110

Met Trp Leu Asp His Arg Ala Val Ser Gln Val Asn Arg Ile Asn Glu

115 120 125

Thr Lys His Ser Val Leu Gln Tyr Val Gly Gly Val Met Ser Val Glu

130 135 140

Met Gln Ala Pro Lys Leu Leu Trp Leu Lys Glu Asn Leu Arg Glu Ile

145 150 155 160

Cys Trp Asp Lys Ala Gly His Phe Phe Asp Leu Pro Asp Phe Leu Ser

165 170 175

Trp Lys Ala Thr Gly Val Thr Ala Arg Ser Leu Cys Ser Leu Val Cys

180 185 190

Lys Trp Thr Tyr Ser Ala Glu Lys Gly Trp Asp Asp Ser Phe Trp Lys

195 200 205

Met Ile Gly Leu Glu Asp Phe Val Ala Asp Asn Tyr Ser Lys Ile Gly

210 215 220

Asn Gln Val Leu Pro Pro Gly Ala Ser Leu Gly Asn Gly Leu Thr Pro

225 230 235 240

Glu Ala Ala Arg Asp Leu Gly Leu Leu Pro Gly Ile Ala Val Ala Ala

245 250 255

Ser Leu Ile Asp Ala His Ala Gly Gly Leu Gly Val Ile Gly Ala Asp

260 265 270

Val Arg Gly His Gly Leu Ile Cys Glu Gly Gln Pro Val Thr Ser Arg

275 280 285

Leu Ala Val Ile Cys Gly Thr Ser Ser Cys His Met Gly Ile Ser Lys

290 295 300

Asp Pro Ile Phe Val Pro Gly Val Trp Gly Pro Tyr Phe Ser Ala Met

305 310 315 320

Val Pro Gly Phe Trp Leu Asn Glu Gly Gly Gln Ser Val Thr Gly Lys

325 330 335

Leu Ile Asp His Met Val Gln Gly His Ala Ala Phe Pro Glu Leu Gln

340 345 350

Val Lys Ala Thr Ala Arg Cys Gln Ser Ile Tyr Ala Tyr Leu Asn Ser

355 360 365

His Leu Asp Leu Ile Lys Lys Ala Gln Pro Val Gly Phe Leu Thr Val

370 375 380

Asp Leu His Val Trp Pro Asp Phe His Gly Asn Arg Ser Pro Leu Ala

385 390 395 400

Asp Leu Thr Leu Lys Gly Met Arg Thr Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Pro

405 410 415

Ala Leu Ala Ala Leu His Ser Pro Ser Ser Leu Leu Ser Pro Gln Val

420 425 430

Thr Gly Leu Lys Leu Ser Gln Asp Leu Asp Asp Leu Ala Ile Leu Tyr

435 440 445

Leu Ala Thr Val Gln Ala Ile Ala Leu Gly Thr Arg Phe Ile Ile Glu

450 455 460

Ala Met Glu Ala Ala Gly His Ser Ile Ser Thr Leu Phe Leu Cys Gly

465 470 475 480

Gly Leu Ser Lys Asn Pro Leu Phe Val Gln Met His Ala Asp Ile Thr

485 490 495

Gly Met Pro Val Val Leu Ser Gln Glu Val Glu Ser Val Leu Val Gly

500 505 510

Ala Ala Val Leu Gly Ala Cys Ala Ser Gly Asp Phe Ala Ser Val Gln

515 520 525

Glu Ala Met Ala Lys Met Ser Lys Val Gly Lys Val Val Phe Pro Arg

530 535 540

Leu Gln Asp Lys Lys Tyr Tyr Asp Lys Lys Tyr Gln Val Phe Leu Lys

545 550 555 560

Leu Val Glu His Gln Lys Glu Tyr Leu Ala Ile Met Asn Asp Asp

565 570 575

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggacatattc agcagaga 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agcacttggt ttcctatt 18

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggagcgagat ccctccaaaa t 21

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggctgttgtc atacttctca tgg 23