本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于油滴生成技術(shù)的轉(zhuǎn)基因玉米高通量檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

轉(zhuǎn)基因作物的研制和管理是世界各國(guó)都非常關(guān)注的問(wèn)題。我國(guó)同樣高度重視轉(zhuǎn)基因植物安全管理，2001年5月23日頒布了《轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》，之后國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局等部門制定了《出入境轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢驗(yàn)檢疫管理辦法》加強(qiáng)對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的監(jiān)管力度。

轉(zhuǎn)基因檢測(cè)多以外源DNA為目標(biāo)，檢測(cè)方法包括普通PCR、熒光定量PCR、southern雜交等技術(shù)。然而，基于PCR技術(shù)的檢測(cè)方法通常每管只能進(jìn)行一對(duì)引物的反應(yīng)，無(wú)法擺脫通量低的缺點(diǎn)。常規(guī)的多重PCR反應(yīng)，由于一個(gè)反應(yīng)管中的引物過(guò)多會(huì)產(chǎn)生相互的干擾并且產(chǎn)生引物多聚，會(huì)對(duì)靶標(biāo)DNA的擴(kuò)增產(chǎn)生干擾，有時(shí)還會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性的情況?；谛酒夹g(shù)的檢測(cè)方法，可以實(shí)現(xiàn)高通量、高靈敏等要求，但對(duì)于轉(zhuǎn)基因特殊目標(biāo)基因的檢測(cè)還需要對(duì)芯片進(jìn)行特制，操作較為繁瑣。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明基于油滴生成技術(shù)建立新型的多重PCR，實(shí)現(xiàn)多重靶標(biāo)DNA的擴(kuò)增，并于高靈敏度的毛細(xì)管電泳檢測(cè)技術(shù)相偶聯(lián)，提高轉(zhuǎn)基因多重檢測(cè)的檢測(cè)極限。本發(fā)明旨在利用本技術(shù)實(shí)現(xiàn)更大規(guī)模地篩選靶基因，進(jìn)而對(duì)轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行大范圍覆蓋。

一種基于油滴生成技術(shù)的轉(zhuǎn)基因玉米高通量檢測(cè)方法，按照如下步驟進(jìn)行：

1)轉(zhuǎn)基因玉米基因組DNA模板的提??；

2)采用油滴生成器制備多重油滴；

3)多重油滴定性PCR反應(yīng)；

4)多重油滴定性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化；

5)多重油滴定性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳分離；

6)毛細(xì)管電泳圖像采集；

7)進(jìn)行多重樣品分析，獲得樣品最優(yōu)結(jié)果。

所述步驟1)中的轉(zhuǎn)基因玉米基因組DNA提取是用TianGen Plant Genomic DNA Kit(Cat.#DP-305)試劑盒對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(AOCS,IRMM)進(jìn)行提取。

所述步驟1)后可設(shè)置多重油滴PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化；根據(jù)不同目的片段的大小以及相對(duì)引物的擴(kuò)增效率進(jìn)行優(yōu)化，選出最優(yōu)的反應(yīng)體系以及反應(yīng)條件。

所述步驟2)中油滴生成器采用Bio-Rad公司QX200Auto DG Droplet Digital PCR System，油包水反應(yīng)體系大小均勻，直徑1nm。

所述步驟4)中多重油滴定性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為油水混合物，采用TianGen公司Universal DNA Purification Kit(Cat.#DP214-02)試劑盒進(jìn)行純化。

所述步驟5)對(duì)于多重油滴定性PCR反應(yīng)純化產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳定量分離的儀器為Agilent 2100Bioanalyzer system。

所述步驟6)中毛細(xì)管電泳圖像采集方法為：采用Agilent 2100 Bioanalyzer system軟件對(duì)不同擴(kuò)增產(chǎn)物閾值以及Maker進(jìn)行設(shè)定，最終形成可見(jiàn)的峰圖電泳圖。

所述步驟7)中多重樣品分析：對(duì)于20-32種不同轉(zhuǎn)基因玉米目的片分為4組，分別進(jìn)行4-6重油滴PCR，對(duì)于不同組進(jìn)行分別優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)20-32種同時(shí)檢測(cè)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明通過(guò)油滴生成技術(shù)，建立新型多重PCR反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)多重靶標(biāo)DNA的擴(kuò)增，并與高靈敏度的毛細(xì)管電泳檢測(cè)技術(shù)相偶聯(lián)，提高轉(zhuǎn)基因多重檢測(cè)的檢測(cè)極限。本發(fā)明旨在利用本技術(shù)實(shí)現(xiàn)更高大規(guī)模地篩選靶基因，進(jìn)而對(duì)轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行大范圍覆蓋。本發(fā)明提供基于油滴生成技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米進(jìn)行高通量檢測(cè)的方法，包括轉(zhuǎn)基因玉米材料挑選、多重油滴PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物的純化和毛細(xì)管電泳及圖像采集分析。

附圖說(shuō)明

圖1是提取的樣本DNA定性PCR產(chǎn)物電泳圖(編號(hào)1-11)；

圖2是提取的樣本DNA定性PCR產(chǎn)物電泳圖(編號(hào)1-12)；

圖中，M：100bp Maker；1-22：59122、MIR162、NK603、BVLA430101、ZSSIIb、CaMV35S、MIR604、T-NOS、C0030.3.5、MON89034、C0030.3.7、SK12-5、Bt176、NPTII、4114、T25、MON810、MON87460、MON863、bar、TC1507、Bt11特異性片段；

圖3是毛細(xì)管電泳圖像；

圖4是毛細(xì)管電泳圖像；

圖中，L：Ladder；1-12：多重PCR結(jié)果，12個(gè)重復(fù)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)描述，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的保護(hù)范圍并不受具體實(shí)施方式的限制。

在下述實(shí)施例中，用本發(fā)明的油滴多重定性PCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米20多個(gè)靶標(biāo)DNA，DNA模板為轉(zhuǎn)基因玉米包括玉米59122、MIR162、NK603、BVLA430101、MIR604、C0030.3.5、MON89034、C0030.3.7、SK12-5、Bt176、4114、T25、MON810、MON87460、MON863、TC1507、Bt11。涉及靶標(biāo)DNA片段包括59122、MIR162、NK603、BVLA430101、MIR604、C0030.3.5、MON89034、C0030.3.7、SK12-5、Bt176、4114、T25、MON810、MON87460、MON863、TC1507、Bt11、ZSSIIb、CaMV35S、T-NOS、NPTII、bar特異性序列；油滴定性PCR反應(yīng)體系可為：Supermix For Evagreen 10μL，混合模板(包含上述中的玉米基因組DNA)2μl，多重引物0.5μl(上游引物濃度10μmol/L，下游引物濃度10μmol/L)，ddH₂O補(bǔ)齊至20μl；油滴定性PCR反應(yīng)條件為：95℃10min；95℃30s，60℃1min，共40個(gè)循環(huán)；98℃10min，4℃停止反應(yīng)。該實(shí)施例多重反應(yīng)體系為4組，即分為4管進(jìn)行油滴多重PCR擴(kuò)增，其中每組包含4-6重PCR引物對(duì)。下述實(shí)施例中所述方法無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。

實(shí)施例1利用油滴多重PCR檢測(cè)方法對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米涉及的22個(gè)靶標(biāo)基因進(jìn)行檢測(cè)。

如圖1-2所示，油滴多重PCR檢測(cè)方法對(duì)多個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米包含片段進(jìn)行檢測(cè)，首先通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米基因組DNA模板的提?。贿M(jìn)一步對(duì)多重油滴定性PCR反應(yīng)體系的制備與優(yōu)化；緊接著對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行油滴處理、多重油滴定性PCR反應(yīng)；然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物純化、毛細(xì)管電泳進(jìn)行分離、采集圖像；最后進(jìn)行多重樣品分析，獲得22種樣品最優(yōu)結(jié)果。

1)轉(zhuǎn)基因玉米基因組DNA模板制備

轉(zhuǎn)基因玉米基因組DNA提取是用TianGen Plant Genomic DNA Kit(Cat.#DP-305)試劑盒對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(AOCS,IRMM)進(jìn)行提取。

①取轉(zhuǎn)基因玉米標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(AOCS,IRMM)種子粉末150mg，加入液氮充分碾磨。

②將研磨好的粉末迅速轉(zhuǎn)移到EP管中，加入預(yù)先65℃預(yù)熱緩沖液GP1(實(shí)驗(yàn)前在預(yù)熱的GP1中加入巰基乙醇，使其終濃度為0.1％)，迅速顛倒混勻后，65℃水浴20min，水浴過(guò)程中顛倒離心管以混合樣品數(shù)次。

③加入體積比為1：1的酚和氯仿進(jìn)行抽提，12000rpm離心5min。取上清液，加入700μl氯仿，充分混勻，12000rpm離心5min。

④小心地將上一步所得上層水相到一個(gè)新的離心管中，加入700μl的緩沖液GP2，充分混勻。

⑤將混均的液體轉(zhuǎn)入吸附柱CB3中，12000rpm離心30sec，棄掉廢液。

⑥向吸附柱CB3中加入500μl緩沖液GD(使用前加入無(wú)水乙醇)，12000rpm離心30sec，倒掉廢液，將吸附住CB3放入收集管中。

⑦向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW(使用前加入無(wú)水乙醇)，12000rpm理性30sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。

⑧重復(fù)步驟⑦。

⑨將吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm離心2min，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

⑩將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中間部位懸空滴加50μl洗脫緩沖液TE，室溫放置5min，12000rpm離心2min，將溶液收集到離心管中。

最后將上述提取的多種DNA進(jìn)行混合、濃縮，制備成混合DNA，分別進(jìn)行PCR反應(yīng)并電泳驗(yàn)證(圖1、圖2)。

2)多重油滴定性PCR反應(yīng)體系的制備

Supermix For Evagreen 10μl，混合模板(包含上述中的玉米基因組DNA)2μl，多重引物0.5μl(上游引物濃度10μmol/L，下游引物濃度10μmol/L)，ddH₂O補(bǔ)齊至20μl。

3)多重油滴的形成

油滴生成器是Bio-Rad公司QX200Auto DG Droplet Digital PCR System，油包水反應(yīng)體系大小均勻(直徑1nm)。按照以下過(guò)程形成油滴：配置20μl反應(yīng)體系，振蕩混勻，離心除氣泡；將新的DG8cartridge放入holder中；將20μl樣品反應(yīng)體系加入到DG8cartridge中間的一排8個(gè)孔內(nèi)，不足8個(gè)樣品時(shí)用稀釋一倍的20μl 1×buffer control補(bǔ)足；在DG8cartridge最底下一排8個(gè)孔中各加入70μl位點(diǎn)生成油(DG Oil)，同樣不能有空著的孔；蓋上膠墊(gasket)，注意兩邊的小孔都要鉤牢；將以上holder輕輕平穩(wěn)放置于油滴生成儀中，開始生成油滴；油滴生成于cartridge最上面一排孔內(nèi)，緩慢吸出到96孔板相應(yīng)位置孔內(nèi)；轉(zhuǎn)移完成后，將熱封膜朝上置于96孔板上并固定好，放置在PX1熱封儀對(duì)其進(jìn)行封膜，運(yùn)行程序：180℃，10s。

4)多重油滴定性PCR反應(yīng)

將上述96孔板加入PCR儀，按照以下條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增：95℃10min；95℃30s，60℃1min，共40個(gè)循環(huán)；98℃10min，4℃停止反應(yīng)。

5)多重油滴定性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化

純化過(guò)程采用的TianGen公司Universal DNA Purification Kit(Cat.#DP214-02)試劑盒進(jìn)行純化，得到較為純凈的產(chǎn)物。過(guò)程如下：

①向吸附柱CB2中加入500μl的平衡液BL，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附住重新放回收集管中。

②向PCR產(chǎn)物中加入等體積溶液PC，充分混勻。

③將上一步所得溶液加入吸附柱CB2中，室溫放置2min，12000rpm離心1min，倒收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。

④向吸附柱CB2中加入600μl漂洗液PW，1200rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB2放入收集管中。

⑤重復(fù)操作步驟④。

⑥將吸附柱CB2放回收集管中，12000rpm離心2min，盡量除去漂洗液。將吸附柱CB2放置溫室數(shù)分鐘，徹底地晾干。

⑦將吸附柱CB2放入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量的洗脫緩沖液EB，室溫放置2min。12000rpm離心2min收集DNA溶液。

6)多重油滴定性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳分離

對(duì)于多重油滴PCR反應(yīng)純化產(chǎn)物毛細(xì)管電泳定量分離儀器為Agilent 2100Bioanalyzer system。

7)毛細(xì)管電泳圖像采集

采用Agilent 2100Bioanalyzer system軟件對(duì)于不同擴(kuò)增產(chǎn)物閾值以及Maker設(shè)定，最終形成可見(jiàn)的峰圖電泳圖(圖3、圖4)。

8)多重樣品分析

對(duì)于22種不同轉(zhuǎn)基因玉米目的片分為4組，分別進(jìn)行4-6重油滴PCR，對(duì)于不同組進(jìn)行分別優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)22種同時(shí)檢測(cè)。

以上公開的僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例，但是，本發(fā)明并非局限于此，任何本領(lǐng)域的技術(shù)人員能思之的變化都應(yīng)落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。