本發(fā)明涉及蛋白的表達(dá)純化，更具體地，涉及巴斯德畢赤酵母中人rank胞外段蛋白的表達(dá)純化。

背景技術(shù)：

1.1rank

tnf和tnfr超家族具有功能多樣性，tnf超家族成員在一系列組織和器官中都有表達(dá)，通常在免疫細(xì)胞表面有表達(dá)，近年來(lái)對(duì)tnf/tnfr的研究揭示了免疫系統(tǒng)和其他生物學(xué)系統(tǒng)之間的關(guān)系，以及許多疾病的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。nf-κb的受體活化因子rank,或稱為tnf相關(guān)活化誘導(dǎo)的細(xì)胞因子受體(trance-r)^[1]、破骨細(xì)胞分化激活受體(odar)^[2]是rankl的信號(hào)受體。rank(tnfrsf11a)屬于腫瘤壞死因子受體家族中的一員與rankl(rank配體)、opg(骨保護(hù)素)共同組成骨代謝穩(wěn)態(tài)的基礎(chǔ)，其中opg/rankl的比率變化影響著破骨細(xì)胞的發(fā)育及活化。rank是一種i型三聚跨膜蛋白，胞外段蛋白富含4個(gè)同型半胱氨酸假重復(fù)序列與大鼠具有70％的同源性。人的rank基因由616個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，c端胞內(nèi)區(qū)沒(méi)有內(nèi)源酶活性，需要n端(胞外段)與三聚體rankl(nf-κb受體激活劑配體)結(jié)合后引發(fā)自身三聚化，招募下游的接合體和對(duì)接蛋白，從而激活下游信號(hào)開始細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)級(jí)聯(lián)傳導(dǎo)。主要激活nf-κb和jnk通路^[5]。rank基因缺陷性小鼠中因?yàn)槿狈ζ乒羌?xì)胞而表現(xiàn)為骨硬化癥及淋巴細(xì)胞缺失、淋巴結(jié)的發(fā)育不良。研究發(fā)現(xiàn)rank-rankl-opg系統(tǒng)對(duì)骨生成穩(wěn)態(tài)、淋巴結(jié)的形成、淋巴細(xì)胞的發(fā)育、乳腺發(fā)育、m細(xì)胞的發(fā)育、樹突狀細(xì)胞(dc)的存活、中樞免疫耐受的建立、血管鈣化、體溫調(diào)節(jié)等生理過(guò)程發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用^[5-8]。t細(xì)胞表達(dá)的rankl可以促進(jìn)t細(xì)胞增殖，同時(shí)t細(xì)胞分泌ifn-γ又促使traf6蛋白酶體降解，進(jìn)而抑制了rank信號(hào)^[9,10]。這暗示著rank-rankl-opg系統(tǒng)是骨與免疫系統(tǒng)之間相互關(guān)聯(lián)的重要介質(zhì)。骨免疫作用機(jī)制的發(fā)現(xiàn)為骨質(zhì)疏松癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨轉(zhuǎn)移性腫瘤等骨破壞性疾病提供一個(gè)新的思路與治療手段。

然而rank/rankl/opg并不局限于骨及免疫系統(tǒng)，其在動(dòng)脈粥樣硬化及糖尿病中也扮演著重要角色。在動(dòng)脈粥樣硬化中rankl/rank可以直接促進(jìn)血管平滑肌的鈣化，或者通過(guò)分泌il-6和tnfa增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的旁分泌間接促進(jìn)血管平滑肌的鈣化，其中opg可預(yù)防血管鈣化。關(guān)于糖尿病的研究指出在i型糖尿病小鼠模型中，rankl參與的調(diào)節(jié)性t細(xì)胞可以保護(hù)β胰島細(xì)胞免受細(xì)胞毒性破壞。最近研究在臨床水平上揭示了血清中高水平的可溶性肝rankl與2型糖尿病(t2dm)風(fēng)險(xiǎn)正相關(guān)。

此外，胸腺中樞耐受的建立是為了防止自身免疫性疾病，但在對(duì)腫瘤患者的免疫治療中，解除患者的免疫耐受狀態(tài)是個(gè)新的治療思路。最近的一項(xiàng)研究表明通過(guò)瞬時(shí)阻斷rankl可以打破中樞耐受，進(jìn)而增加腫瘤特異性效應(yīng)t細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用。

rank可以廣泛表達(dá)于胸腺、肝、結(jié)腸、乳腺、前列腺、胰腺、骨髓、心臟、肺、腦、骨骼肌、腎、肝和皮膚^[26]。在本實(shí)驗(yàn)室前期研究中通過(guò)動(dòng)物成瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，rank-fc對(duì)結(jié)直腸癌具有抑制作用。這為我們利用人源化結(jié)直腸癌小鼠模型對(duì)rank胞外段蛋白進(jìn)行體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)的功能驗(yàn)證奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。另外，因哺乳動(dòng)物中的表達(dá)量低及及大腸桿菌中的純化困難，而巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)作為目前最成功的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一，與大腸桿菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)相比具有使用簡(jiǎn)單、表達(dá)量高、蛋白便于純化、接近人源蛋白糖基化等優(yōu)點(diǎn)，因此我們利用此系統(tǒng)大量表達(dá)人源rank胞外段蛋白(以下簡(jiǎn)稱rank-n)。

本研究中通過(guò)rank受體胞外段蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)阻斷rankl-rank信號(hào)通路，這種重組蛋白能結(jié)合rankl而自己本身由于沒(méi)有細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)不能傳遞下游信號(hào)，這樣可以阻斷rankl-rank信號(hào)。雖然已經(jīng)有人使用rank-fc融合蛋白阻斷該信號(hào)通路，但是其表達(dá)量和蛋白活性都不是很高。我們這里表達(dá)的rank-n相比rank-fc融合蛋白具有更高的蛋白表達(dá)量，同時(shí)避免了復(fù)雜的蛋白與融合部分的分離操作，增加了產(chǎn)品的回收率。本次研究構(gòu)建了rank-n巴斯德畢赤酵母表達(dá)菌株，并建立超濾-sephadexg-50凝膠過(guò)濾層析-qsepharoseff離子交換層析三步純化方法，得到具有功能活性，純度超過(guò)95％的可溶性的人rank-n蛋白。體外體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均證明其具有阻斷rankl-rank信號(hào)的功能，為進(jìn)一步研究rankl-rank信號(hào)通路的科研和臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1.2巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)

巴斯德畢赤酵母是一甲醇營(yíng)養(yǎng)型巴斯德畢赤酵母，能夠利用甲醇作為唯一碳源。它兼具原核表達(dá)系統(tǒng)成本低廉、操作簡(jiǎn)易、表達(dá)量高及真核生物表達(dá)系統(tǒng)對(duì)外源蛋白翻譯后進(jìn)行加工修飾等優(yōu)點(diǎn)。因此其在生物制藥業(yè)中受到越來(lái)越多的關(guān)注已被廣泛應(yīng)用于外源蛋白的表達(dá)。巴斯德畢赤酵母能代謝甲醇源于過(guò)氧化物酶中的醇氧化酶1(aox1)基因，aox1啟動(dòng)子是目前已知的最強(qiáng)及最嚴(yán)格的調(diào)節(jié)真核啟動(dòng)子之一。巴斯德畢赤酵母有兩個(gè)醇氧化酶基因，aox1和aox2，其中aox1比aox2被更強(qiáng)烈地轉(zhuǎn)錄^[27]。目前，越來(lái)越多的蛋白質(zhì)已使用此啟動(dòng)子表達(dá)，其產(chǎn)率高達(dá)14.8克/l^[28]，優(yōu)化條件后可達(dá)重組蛋白的20-30克/l^[29]。aox1啟動(dòng)子在葡萄糖或甘油的存在下被抑制，但在甲醇的存在下會(huì)強(qiáng)烈上調(diào)。aox1啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)aox1蛋白質(zhì)或其它重組蛋白質(zhì)以非常高的水平表達(dá)，達(dá)到總可溶性蛋白的表達(dá)30％以上^[30]。

巴斯德畢赤酵母通常以營(yíng)養(yǎng)單倍體狀態(tài)存在，當(dāng)有氮限制時(shí)會(huì)導(dǎo)致交配并形成雙倍體細(xì)胞^[31]。所有巴斯德畢赤酵母表達(dá)菌株源自野生型菌株nrrl-y11430。營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變體(gs115)、蛋白酶缺陷型菌株(smd1163，smd1165，smd1168)是最常被使用的表達(dá)菌株。從甲醇的利用率可將巴斯德畢赤酵母可分為三種表型，即mut⁺(甲醇利用快型)，mut^s(甲醇利用慢型)，mut^-(甲醇不利用型)^[32]。ppic9k是一種分泌型表達(dá)載體,它通過(guò)釀酒酵母α-信號(hào)肽，使外源蛋白質(zhì)分泌入培養(yǎng)液中，其中目的蛋白可占分泌總蛋白的50％以上且自身分泌的蛋白少易于下游靶蛋白的分離純化^[30,^33-35]。anandghosalkar^[36]等發(fā)現(xiàn)在gs115菌株使用α-mf信號(hào)肽(肽釀酒酵母α交配因子前導(dǎo)肽)，蛋白表達(dá)量可高達(dá)200mg/l。

巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)有以下優(yōu)點(diǎn)：

(1)具有快速生長(zhǎng)速率且易于高密度發(fā)酵；(2)發(fā)酵培養(yǎng)基成本低廉，表達(dá)量高，外源基因的表達(dá)水平比原核細(xì)胞及釀酒酵母高，多數(shù)>1g/l。(3)應(yīng)用分泌型表達(dá)載體通過(guò)α-信號(hào)肽可使表達(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中便于靶蛋白的分離純化。(3)無(wú)內(nèi)毒素和噬菌體的污染；(4)有易于基因操縱的酵母表達(dá)載體；(5)針對(duì)巴斯德畢赤酵母的裂解病毒無(wú)人類致病性；(6)具有多肽折疊，糖基化，甲基化，酰基化，蛋白剪切等翻譯后修飾功能(7)遺傳背景清楚，遺傳性狀穩(wěn)定^[37]。

巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn)：

(1)發(fā)酵周期較長(zhǎng)，容易污染，應(yīng)及時(shí)通過(guò)sds-page和考馬斯亮藍(lán)染色鑒定縮短時(shí)間避免菌體蛋白干擾。

(2)甲醇易燃易爆具有細(xì)胞毒性，大量堆放存在潛在危險(xiǎn)。

(3)蛋白酶降解經(jīng)常影響著巴斯德畢赤酵母外源蛋白的成功分泌^[38-40]。

(4)高度甘露糖型糖基化：巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)較釀酒酵母是最接近人源蛋白糖基化的表達(dá)系統(tǒng)^[41]。酵母執(zhí)行的翻譯后修飾如n-和o-糖基化對(duì)保證重組蛋白的生物學(xué)活性是必不可少的^[41]。然而，酵母菌的n-多聚糖是異質(zhì)高甘露糖型糖基化。當(dāng)高甘露糖型n-多聚糖從人血液中清除時(shí)可以引起免疫原性反應(yīng)。目前的解決策略主要集中以下兩種方法：1.糖基化位點(diǎn)的定點(diǎn)突變^[42]；2.糖基化的基因工程改造^[43][44]。

1.3rank/rankl/opg簡(jiǎn)介

1.3.1rankl-rank-opg系統(tǒng)

nf-κb受體激活劑配體(rankl)

rankl最早是由四個(gè)不同的研究組獨(dú)立發(fā)現(xiàn)的，并分別稱之為rankl，trance，odf和opgl，現(xiàn)在也統(tǒng)一命名為tnfsf^[11]。rankl屬于tnf超家族成員，是一種二型跨膜蛋白，與tnf配體超家族成員如trail，fasl以及tnfa具有明顯的同源性，人與大鼠的rankl的同源性高達(dá)83％，說(shuō)明rankl在進(jìn)化過(guò)程中是高度保守的^[45]。rankl可以以膜結(jié)合或者游離的方式存在，其中游離形式的rankl由金屬蛋白酶-解偶聯(lián)蛋白tnfα轉(zhuǎn)化酶(tace)對(duì)膜結(jié)合形式的rankl的剪切而產(chǎn)生的^[7]。進(jìn)一步研究顯示rankl在體內(nèi)有三種同源異構(gòu)體，其中最短的同源異構(gòu)體缺少胞內(nèi)區(qū)和跨膜區(qū)并且可能具有抑制性作用，這與游離形式的rankl在介導(dǎo)破骨細(xì)胞生成過(guò)程中的效率更低發(fā)現(xiàn)一致^[46]。rankl在多種組織細(xì)胞中都有表達(dá)，包括t淋巴細(xì)胞^[45]、成骨細(xì)胞、骨基質(zhì)細(xì)胞和肺上皮細(xì)胞^[47]。在發(fā)育過(guò)程中，小鼠胚胎的腦、心臟、腎臟、骨骼肌和皮膚中均可以檢測(cè)到ranklmrna存在，另外，小鼠胚胎15天的軟骨細(xì)胞中也檢測(cè)到大量的ranklmrna存在。許多細(xì)胞因子或者激素如糖皮質(zhì)激素、維生素d3⁴⁷、il-1、tnf-a、tgf-b、wnt配體^[48]和lps^[49]可以高效誘導(dǎo)rankl的表達(dá)。

nf-κb受體激活劑(rank)

rank是rankl的信號(hào)受體，也被稱為trance-r和odar，現(xiàn)在也被統(tǒng)一命名為tnfrsf11a。rank屬于tnf受體超家族成員，是一種一型三聚體跨膜蛋白，與cd40胞外域部分具有高度的同源性，人與大鼠的rank同源性高達(dá)70％，在進(jìn)化上高度保守。人的rank由616個(gè)氨基酸組成，n端胞外區(qū)含有4個(gè)同型半胱氨酸假重復(fù)序列，跨膜區(qū)很短，c端胞內(nèi)區(qū)沒(méi)有內(nèi)源酶活性，需要n端的胞外區(qū)與三聚體rankl結(jié)合后引發(fā)自身三聚化，從而招募下游的接合體和tnfr相關(guān)因子(tnfreceptorassociatedfactors，trafs)中的traf2，3，5和6，接頭/支架蛋白gab2和泛素連接酶cbl，激活胞質(zhì)內(nèi)的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終激活jnk2/stat5通路和nf-κb通路^[50]。rank可以廣泛表達(dá)于胸腺、肝、結(jié)腸、乳腺、前列腺、胰腺、骨髓、心臟、肺、腦、骨骼肌、腎、肝和皮膚。

骨保護(hù)素(opg)

骨保護(hù)素是在嘗試靶向大鼠tnfrsf同源蛋白的探索中首次發(fā)現(xiàn)的，也被稱之為破骨細(xì)胞形成抑制因子(ocif)，tr1，或?yàn)V泡樹突狀細(xì)胞源性受體-1(fdcr-1)，現(xiàn)在被統(tǒng)一命名為tnfr11b。opg屬于tnf受體超家族成員，是一種分泌型糖蛋白，結(jié)構(gòu)上具有tnf受體超家族特征性的半胱氨酸假重復(fù)序列，人與小鼠的opg的同源性高達(dá)85％，進(jìn)化上高度保守^[51]。全長(zhǎng)的opg蛋白由401個(gè)氨基酸組成，n端含有21個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽，經(jīng)過(guò)糖基化后，成熟的opg含有380個(gè)氨基酸，整個(gè)蛋白含有7個(gè)結(jié)構(gòu)域：4個(gè)富含半胱氨酸的n末端結(jié)構(gòu)域(結(jié)構(gòu)域1-4)，兩個(gè)死亡域同源區(qū)(域5和6)和一個(gè)c-末端的肝素結(jié)合域多肽區(qū)(結(jié)構(gòu)域7)^[17,52]。

研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)多種組織如皮膚，肝，肺，和成年小鼠的心臟均可以分泌opg，并且胚胎期7天和15天的胚胎組織中表達(dá)的opg處于峰值^[51]。opg主要在骨基質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)，但也可以在樹突狀細(xì)胞，和濾泡樹突狀細(xì)胞，b淋巴細(xì)胞中被誘導(dǎo)表達(dá)^[53]。opg的表達(dá)可以被一系列維持骨穩(wěn)態(tài)的因子正向的或者負(fù)向的調(diào)控^[54]。例如tgf-b，il-1，tnf，雌激素和wnt配體可以誘導(dǎo)opg的表達(dá)，而前列腺素e2(pge2)和糖皮質(zhì)激素則抑制opg的表達(dá)^[54]。

rank信號(hào)通路如圖1所示。rank受體缺乏內(nèi)源酶活性，因此，利用接合體和對(duì)接蛋白的相互作用去激活下游信號(hào)，包括trafs2，3，5和6，接頭/支架蛋白gab2和泛素連接酶cbl。gab2和cbl與rank介導(dǎo)激活的蛋白酪氨酸激酶(c-src)、3-磷酸肌醇激酶(pi3k)和蛋白激酶bγ(akt3)依次相結(jié)合，而腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子trafs2和6可以激活tab1/tab2/tak1復(fù)合物，這些(連同其他上游激酶)激活iκb激酶β(ikkβ)和絲裂原活化蛋白激酶(mapk)。這些途徑的激活促進(jìn)了轉(zhuǎn)錄因子的移位和活化，包括破骨細(xì)胞活化t細(xì)胞核因子l(nfatc1)、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)因子creb、nfκb、ap-1和mitf。另外，在破骨細(xì)胞生成中重要的介導(dǎo)物質(zhì)dap12、fcrγ(免疫球蛋白樣受體)與細(xì)胞表面受體oscar，pir-a及trem-2協(xié)同激活syk-plcγ通路和鈣通道。walshmc,choiy.frontimmunol.2014oct20；5:511.

1.3.2rankl-rank信號(hào)在發(fā)育過(guò)程中的作用

rank-rankl信號(hào)在多種組織的上皮細(xì)胞發(fā)育和分化過(guò)程發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，這種rank依賴的調(diào)控機(jī)制不但影響器官發(fā)育過(guò)程，也影響著免疫系統(tǒng)的功能和癌癥的發(fā)生。

rank和rankl基因缺陷小鼠表現(xiàn)為二級(jí)淋巴組織發(fā)育缺陷，如淋巴結(jié)，派爾集合淋巴結(jié)，腸粘膜的微小腸道隱窩斑以及脾臟^[55,56]。rank和rankl基因缺陷小鼠的乳腺組織發(fā)育也存在著缺陷。乳腺組織的發(fā)育需要通過(guò)rank激活下游ikka依賴的非經(jīng)典nf-κb信號(hào)通路^[57]。微皺細(xì)胞(m細(xì)胞)來(lái)源于腸道黏膜上皮細(xì)胞，是粘膜免疫中的一種抗原呈遞細(xì)胞，可誘導(dǎo)免疫黏膜免疫應(yīng)答或免疫耐受。rankl信號(hào)在m細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中非常關(guān)鍵。rankl基因缺陷小鼠中m細(xì)胞發(fā)育分化缺陷^[7]。

rankl-rank信號(hào)在胸腺器官發(fā)育中扮演著非常關(guān)鍵的角色，是尤其在胸腺髓質(zhì)上皮細(xì)胞的發(fā)育和分化過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的調(diào)控作用，進(jìn)而影響發(fā)育中的t細(xì)胞進(jìn)行陰性選擇^[8,58]。定位于胸腺髓質(zhì)區(qū)的上皮細(xì)胞被稱為髓胸腺上皮細(xì)胞(mtecs)，其來(lái)源于非造血細(xì)胞，胸腺髓質(zhì)上皮細(xì)胞通過(guò)消除那些潛在表達(dá)的自身反應(yīng)性tcr的t細(xì)胞和產(chǎn)生具有免疫抑制性質(zhì)的foxp3陽(yáng)性調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(treg細(xì)胞)從而建立中樞免疫耐受^[8,59]。在缺少胸腺細(xì)胞提供的rankl時(shí)mtecs數(shù)目和比例顯著減少，這個(gè)過(guò)程似乎在發(fā)生在新生兒期，在tcrαβt細(xì)胞未產(chǎn)生之前，tcrγδt細(xì)胞表達(dá)的rankl就可以提供mtec前體細(xì)胞發(fā)育分化的所需要的信號(hào)^[60]。mtecs的發(fā)育分化需要tnf受體超家族成員ltβr、cd40和rank依賴的信號(hào)通路，以便誘導(dǎo)自身免疫調(diào)節(jié)因子(aire)和組織特異性抗原(tsas)的充分表達(dá)，但這些受體的下游激活的通路是否完全一致目前尚不清楚。traf3基因缺陷鼠提示ltβr和cd40在激活非經(jīng)典的nf-κb通路上發(fā)揮著相似的作用，但rank在mtecs發(fā)育中顯然還提供了額外的必須信號(hào)^[61]。遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示rank信號(hào)是通過(guò)下游的traf6分子介導(dǎo)的[⁵⁸]?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明rank介導(dǎo)的信號(hào)在免疫調(diào)節(jié)和免疫穩(wěn)態(tài)的發(fā)育過(guò)程中是必需的。

1.3.3rankl-rank-opg與骨代謝穩(wěn)態(tài)

骨代謝包括骨形成與骨吸收，骨形成與骨吸收之間只有處于動(dòng)態(tài)平衡，骨組織才能具有正常的形態(tài)，發(fā)揮應(yīng)有的功能。骨代謝穩(wěn)態(tài)是主要由兩種細(xì)胞維持的：成骨細(xì)胞先形成類骨物質(zhì)并礦化形成新骨，破骨細(xì)胞清除舊骨的礦物質(zhì)。骨代謝穩(wěn)態(tài)過(guò)程是由成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞共同介導(dǎo)的，許多細(xì)胞因子、激素、以及生長(zhǎng)因子均參與其中。在體外，可以通過(guò)破骨細(xì)胞/骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)得到破骨細(xì)胞，需細(xì)胞-細(xì)胞接觸依賴性培養(yǎng)，rankl-rank信號(hào)可以激活這個(gè)發(fā)育過(guò)程^[62,63]。巨噬細(xì)胞集落刺激因子m-csf可以刺激破骨前體細(xì)胞的增殖以及誘導(dǎo)rank及rank信號(hào)下游的轉(zhuǎn)錄因子c-fos，nfatc1/nfatc2以及nf-κb的家族成員p50和p52的表達(dá)從而促進(jìn)破骨細(xì)胞的發(fā)育^[64,65]。rankl基因缺陷鼠由于破骨細(xì)胞本身正常的發(fā)育而表現(xiàn)為嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松癥以及牙齒發(fā)育不全^[66]。

1.3.4rankl-rank-opg系統(tǒng)與腫瘤的關(guān)系

rankl-rank-opg系統(tǒng)在眾多破骨細(xì)胞依賴的骨轉(zhuǎn)移癌癥病理過(guò)程中都發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。癌細(xì)胞骨轉(zhuǎn)移后以及其產(chǎn)生的腫瘤相關(guān)因子加速了骨吸收的過(guò)程，并且釋放了一些生長(zhǎng)因子促進(jìn)了癌細(xì)胞的增殖。許多研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)阻斷rankl來(lái)抑制破骨細(xì)胞的發(fā)育可以抑制骨癌組織邊緣癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。這一現(xiàn)象在前列腺癌^[67]，乳腺癌^[68]，骨髓瘤^[69]的小鼠動(dòng)物模型中都已被證實(shí)。然而，rankl-rank-opg系統(tǒng)也可以通過(guò)破骨細(xì)胞非依賴的途徑參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，前列腺癌，乳腺癌，肺癌，腎癌，黑色素瘤的癌細(xì)胞都有rank的表達(dá)，重要的是，對(duì)一系列實(shí)體瘤分析發(fā)現(xiàn)原發(fā)的腫瘤細(xì)胞和骨轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞上rank的表達(dá)并沒(méi)有顯著的不同，說(shuō)明rankl-rank-opg系統(tǒng)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著多方面復(fù)雜的作用^[70]。

rankl，rank以及opg在前列腺癌組織中表達(dá)水平是增高的，而正常組織中這三種蛋白表達(dá)水平是很低的。rankl，rank以及opg的表達(dá)高低與前列腺癌的臨床病理組織指標(biāo)是正相關(guān)的，即高水平的rankl，rank以及opg顯示著腫瘤的惡性程度更高^[71]。另外，在前列腺癌細(xì)胞中，rankl可以激活ikka以及抑制轉(zhuǎn)移抑制基因maspin，促進(jìn)前列腺癌的發(fā)生發(fā)展^[72]。

rankl/rank系統(tǒng)是lobulo-alveolar區(qū)乳腺組織發(fā)育所必需的。rankl和rank基因缺陷鼠不能分泌乳液，并且乳腺小泡上皮細(xì)胞不能正常的增殖^[73]。在小鼠的乳腺癌模型中，rank信號(hào)過(guò)度激活促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生，而抑制rank信號(hào)可以抑制乳腺癌的發(fā)生發(fā)展^[74]。

1.3.5以rankl作為治療靶點(diǎn)

由于rankl在破骨細(xì)胞的分化和激活中扮演了至關(guān)重要的角色，以及可作為溶骨性疾病發(fā)展過(guò)程的中介因子，使得rankl成為一個(gè)潛在應(yīng)用的藥物作用靶點(diǎn)^[75]。目前，已經(jīng)開發(fā)了不同種類的rankl阻斷劑在體內(nèi)來(lái)阻斷rankl，如fc-opg、rank-fc和opg模擬多肽。fc-opg和rank-fc分別由opg和rank的胞外段與fc片段融合而成，重組人源和鼠源的fc-opg和rank-fc已被成功研制出來(lái)。鼠源rank-fc融合蛋白已被證明既能與鼠rankl結(jié)合也能與人rankl結(jié)合，卻不能與腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)因子(trail)結(jié)合^[15,^16]。鑒于鼠源性單克隆抗體的多次給藥易出現(xiàn)人抗鼠抗體的情況，目前人源單克隆抗體是進(jìn)行臨床治療的主要發(fā)展趨勢(shì)。

rank/rankl信號(hào)通路在癌癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中所扮演的角色還不是很清楚，但是，最近的研究已經(jīng)證明rank/rankl信號(hào)通路的激活可以促進(jìn)孕激素誘導(dǎo)的乳腺上皮細(xì)胞增殖以及癌變，抑制rank信號(hào)可以阻斷乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)以及乳腺癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移^[74]。因此，阻斷rank/rankl/opg信號(hào)通路可能有抗腫瘤的作用。在小鼠模型中，opg可以抑制骨溶解相關(guān)的骨疾病同時(shí)也能縮小病灶的大小，opg-fc融合蛋白也被開發(fā)為一種潛在的治療藥物，并且在臨床試驗(yàn)中用來(lái)治療多發(fā)性骨髓瘤，乳腺癌，前列腺癌以及胃癌等^[76,77]。雖然opg-fc在減少骨吸收的方面和pamidronate的效果類似，但是它的半衰期更短，并且對(duì)rankl沒(méi)有特異性，opg可以阻斷trail，而trail在介導(dǎo)先天免疫細(xì)胞殺傷腫瘤過(guò)程中發(fā)揮著重要作用^[17]。而最近的研究顯示opg可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活，雖然opg作為腫瘤細(xì)胞的保護(hù)因子目前還缺乏體內(nèi)的證據(jù)，但是其潛在的促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移功能限制了它的臨床研究以及應(yīng)用前景^[17]。

作為rankl的唯一靶受體的rank，其應(yīng)用優(yōu)勢(shì)越來(lái)越多的受到人們關(guān)注。目前rank-fc這種融合蛋白已經(jīng)被獲得并開展了一系列試驗(yàn)，研究發(fā)現(xiàn)注射rank-fc后實(shí)驗(yàn)組小鼠骨密度相對(duì)于對(duì)照組呈劑量依賴性增加^[18]，微型ct顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠骨小梁數(shù)量的增加并伴有骨小梁厚度的降低^[19]。rank-fc蛋白在多發(fā)性骨髓瘤(mm)中可限制骨質(zhì)破壞，可明顯減少腫瘤負(fù)荷和血清m蛋白，而在opg-fc治療組中血清m蛋白平均降低僅為25％^[20]。schmiedelbj在mm及慢性淋巴細(xì)胞白血病(cll)的治療研究中發(fā)現(xiàn)相對(duì)于狄諾塞麥，rank-fc可高效激活nk細(xì)胞的抗腫瘤作用^[21]。另外，在人類骨肉瘤中使用rank-fc可以抑制erk信號(hào)，并同時(shí)激活caspase-3介導(dǎo)的失巢凋亡抑制腫瘤^[22]。研究表明，rank-fc可以顯著的抑制破骨細(xì)胞的活性和骨吸收，進(jìn)而阻斷骨肉瘤、多發(fā)性骨髓瘤、肺癌^[23]、乳腺癌^[24]、前列腺癌^[25]等造成的骨質(zhì)破壞。

denosumlab(狄諾塞麥)是首個(gè)被fda批準(zhǔn)的rankl抑制劑。它是一種人igg2單克隆抗體，通過(guò)阻斷rankl抑制破骨細(xì)胞的功能及阻止骨形成與骨吸收。在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥i期臨床實(shí)驗(yàn)中對(duì)49例健康的絕經(jīng)后婦女進(jìn)行狄諾塞麥單劑量、隨機(jī)、雙盲、劑量遞增的皮下注射實(shí)驗(yàn)研究，劑量依次為0.01，0.03，0.1，0.3，1.0或3.0毫克/kg。隨后觀察6個(gè)月，最高劑量的三組觀察長(zhǎng)達(dá)9個(gè)月。口服安慰劑、阿侖膦酸鈉作為對(duì)照，實(shí)驗(yàn)顯示與以前使用的阿侖膦酸鈉相比，骨密度可顯著增加。通過(guò)檢測(cè)尿ntx發(fā)現(xiàn)骨吸收被抑制，經(jīng)白蛋白校正后血鈣濃度有一個(gè)短暫降低及血清甲狀旁腺激素的瞬時(shí)升高^[78]。ii、iii期臨床試驗(yàn)階段證明其可以降低椎骨骨折、髖部骨折和非椎骨骨折的風(fēng)險(xiǎn)。在后續(xù)的ii、iii期臨床試驗(yàn)中狄諾塞麥的耐受性良好，沒(méi)有藥物相關(guān)的嚴(yán)重不良事件(saes)報(bào)告。用藥方式為：皮下注射，每4周120毫克用于預(yù)防sre；每6個(gè)月60毫克用于預(yù)防骨質(zhì)疏松癥和骨損失^[79]。最近的iii期臨床試驗(yàn)顯示，在非轉(zhuǎn)移性雄激素抗性的前列腺癌中使用狄諾塞麥可以顯著增加骨轉(zhuǎn)移的生存和延遲首次骨轉(zhuǎn)移時(shí)間^[80]。此外，相關(guān)研究指出狄諾塞麥在骨巨細(xì)胞瘤(gctb)中已應(yīng)用于ii期臨床，在無(wú)法手術(shù)和嚴(yán)重手術(shù)并發(fā)癥組中結(jié)果令人振奮，顯著減少了gctb患者手術(shù)的需要^[81]。目前，狄諾塞麥用于早期乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的iii期臨床預(yù)防工作正在進(jìn)行中(d-care，nct01077154)^[82]。狄諾塞麥的平均半衰期為28天，潛在不良反應(yīng)有低鈣血癥、感染、顎骨壞死及骨代謝抑制等。長(zhǎng)期使用狄諾塞麥對(duì)感染及免疫抑制等方面的安全性尚有待于進(jìn)一步觀察^[82]。

綜上所述，抗rankl治療為探索骨疾病、癌癥病人的骨轉(zhuǎn)移、溶骨性骨腫瘤等骨破壞性疾病的生物治療方法提供了新思路，為臨床疾病的治療和預(yù)防帶來(lái)了新的希望。

在現(xiàn)有技術(shù)中，主要還存在以下幾個(gè)方面的缺陷：1)基因重組蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)量低及及大腸桿菌中的純化困難；2)雖然已經(jīng)有人使用rank-fc融合蛋白阻斷該信號(hào)通路，但是其表達(dá)量和蛋白活性都不是很高；3)鼠源rank-fc融合蛋白已被證明既能與鼠rankl結(jié)合也能與人rankl結(jié)合，卻不能與腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)因子(trail)結(jié)合^[15,16]。鑒于鼠源性單克隆抗體的多次給藥易出現(xiàn)人抗鼠抗體的情況，目前人源單克隆抗體是進(jìn)行臨床治療的主要發(fā)展趨勢(shì)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

2.1本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題

(1)本研究首次構(gòu)建新型rankl阻斷劑(rank胞外段蛋白)的巴斯德畢赤酵母(pichiapastoris)，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，編號(hào)為cgmccno.12500，于2016年05月26日保藏)表達(dá)系統(tǒng)，獲得多拷貝陽(yáng)性酵母轉(zhuǎn)化菌株，建立超濾—sephadexg-50—qsepharoseff的純化方案，并獲得大量高純度目的蛋白。表達(dá)量超過(guò)30mg/l，為以后的實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

(2)成功建立人源化結(jié)直腸癌小鼠模型，發(fā)現(xiàn)了rank-n具有抑制結(jié)直腸癌體外生長(zhǎng)中的功能，為rank蛋白的成藥性打下了良好基礎(chǔ)，對(duì)探索癌癥新的生物治療方法提供了新的思路。

(3)通過(guò)等離子共振(spr)技術(shù)分析rank與rankl蛋白相互作用，測(cè)定兩者的親和解離常數(shù)kd為2.624e-6m。kd越小表明親和力越強(qiáng)，進(jìn)而實(shí)時(shí)觀察了兩種蛋白之間結(jié)合的過(guò)程，所得參數(shù)將作為性能比較的重要依據(jù)。

本發(fā)明提供了一種人源rank胞外段蛋白的表達(dá)方法，包括：rank胞外段蛋白的cdna序列的全基因合成；將所述rank胞外段蛋白的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，并且將優(yōu)化后的基因序列構(gòu)建到ppic9k上，形成ppic9k-rank-n(連接了rank胞外段蛋白的目的基因的p-pic9k)，其中，所述優(yōu)化后的基因序列為：

cgcctcgagaaaagacagattgctcctccatgtaccagtgagaagcattatgagcatctgggaagatgctgtaacaaatgtgaaccaggaaagtacatgtcttctaaatgcactactacctctgacagtgtatgtctgccctgtggccctgatgaatacttggattcatggaatgaagaagataaatgcttgctacataaagtttgtgatacaggcaaggccttggtggccgtggtcgccggtaactcaacgacccccaggcgttgcgcttgcacggctgggtaccactggtcacaggactgcgagtgctgtcgtcgaaacactgagtgtgctcctggtttaggtgcacaacaccctttgcaactaaacaaggacacagtttgtaaaccttgtcttgcaggttatttctctgatgcattttcctccactgacaaatgtagaccctggactaattgtacttttcttggaaagagagtcgaacatcacggtacagagaagtccgatgctgtttgtagttcttccttaccagctagaaagccaccaaatgaacctcacgtttatttgccataagcggccgcattattaa；將所述ppic9k-rank-n電轉(zhuǎn)化至巴斯德畢赤酵母gs115進(jìn)行蛋白表達(dá)。

在上述表達(dá)方法中，其中，所述優(yōu)化后的基因序列是全基因合成的。

本發(fā)明還提供了一種人源rank胞外段蛋白的純化方法，包括：對(duì)包含所述人源rank胞外段蛋白的發(fā)酵液上清進(jìn)行超濾，并用截留3kd的膜得到超濾濃縮液；對(duì)所述超濾濃縮液進(jìn)行sephadexg-50凝膠過(guò)濾層析，紫外280nm監(jiān)測(cè)收集各個(gè)吸收峰的蛋白樣品；對(duì)所述蛋白樣品進(jìn)行電泳，確定并收集含有目的條帶的蛋白樣品；對(duì)所述含有目的條帶的蛋白樣品進(jìn)行q-sepharose-ff離子交換層析，紫外280nm監(jiān)測(cè)收集各個(gè)吸收峰的蛋白組分；對(duì)所述蛋白組分進(jìn)行免疫蛋白印跡，確定含有目的蛋白的蛋白組分，并且收集所述含有目的蛋白的蛋白組分。

在上述純化方法中，其中，通過(guò)millipore超濾系統(tǒng)進(jìn)行所述超濾。

在上述純化方法中，其中，在對(duì)所述超濾濃縮液進(jìn)行sephadexg-50凝膠過(guò)濾層析之前，對(duì)sephadexg-50層析柱進(jìn)行清洗和平衡。

在上述純化方法中，還包括：用bca法測(cè)定所述含有目的蛋白的蛋白組分的蛋白濃度。

在上述純化方法中，其中，在對(duì)所述含有目的條帶的蛋白樣品進(jìn)行q-sepharose-ff離子交換層析之前，對(duì)q-sepharose-ff層析柱進(jìn)行清洗和平衡。

在上述純化方法中，其中，用0.1m的naoh清洗所述sephadexg-50層析柱和所述q-sepharose-ff層析柱。

在上述純化方法中，其中，用ph為9.0的tris-hcl平衡所述sephadexg-50層析柱和所述q-sepharose-ff層析柱。

本發(fā)明還提供了人源rank胞外段蛋白在制備治療骨相關(guān)疾病和結(jié)直腸癌的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明對(duì)rank胞外段蛋白全序列進(jìn)行了優(yōu)化，成功表達(dá)了rank-n蛋白，并且表達(dá)量高，且表達(dá)出的蛋白具有相關(guān)的蛋白活性。

附圖說(shuō)明

圖1示出了rank信號(hào)通路。

圖1a至圖1d示出了rank胞外端基因克隆和鑒定：(圖1a)人rank胞外段基因生工合成后序列瓊脂糖凝膠檢測(cè)：從左到右側(cè)條帶依次為rank-n基因條帶，ppic9k基因條帶、dnamarker：dl2000，每孔上樣均為5μl；(圖1b)ppic9k-rank-n構(gòu)建后經(jīng)xhoi和noti雙酶切鑒定；(圖1c)rank-n構(gòu)建到ppic9k后上測(cè)序比對(duì)：已經(jīng)成功克隆的ppic9k-rank-n使用通用引物進(jìn)行測(cè)序，其測(cè)序結(jié)果中的552bp與genebank序列一致；(圖1d)ppic9k-rank-n的構(gòu)建表達(dá)圖。

圖2a至圖2f示出了酵母菌株表達(dá)rank-n和westernblot鑒定：(圖2a、圖2b)酵母菌株甲醇誘導(dǎo)表達(dá)sds-page電泳后考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果，泳道1為蛋白分子量marker，左側(cè)為分子量大小對(duì)照，0，12……96小時(shí)分別為不同時(shí)間樣品，單位kd，樣品20μl/孔，sds-page濃縮膠5％，分離膠12％；圖2a從左到右分別為每24小時(shí)加1％甲醇、每12小時(shí)加0.5％甲醇，圖2b從左到右分別為每12小時(shí)加1％甲醇每12小時(shí)加1.5％甲醇。最終選定1％/12小時(shí)的甲醇補(bǔ)加量；(圖2c-2e)：(圖2c)0號(hào)菌株的甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，(圖2d)7號(hào)菌株的甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，(圖2e)將在2mg/ml(0號(hào)),4mg/ml(1-6號(hào))，6mg/ml(7-8號(hào))g418平板上生長(zhǎng)菌株分別進(jìn)行誘導(dǎo)96小時(shí)；取菌液上清考染后發(fā)現(xiàn)1-8中蛋白表達(dá)量沒(méi)有明顯差異；(圖2f)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣品的westernblot檢測(cè)，其中，至少進(jìn)行三次實(shí)驗(yàn)重復(fù)。

圖3a至圖3g顯示蛋白搖瓶表達(dá)、純化和糖基化分析：(圖3a)巴斯德畢赤醉母轉(zhuǎn)化子甲醇利用表型md板，mm板鑒定；(圖3b)飽和度30％～60％硫酸銨沉淀的上清液和沉淀：左邊泳道為蛋白分子量marker，泳道1-9分別依次為飽和度，30％，40％，50％沉淀后的上清，30％，40％，50％硫酸銨沉淀后的沉淀，鹽析前誘導(dǎo)96h的菌液上清，60％，70％硫酸銨沉淀后的沉淀；(圖3c)凝膠過(guò)濾層析圖，y軸為od280nm吸收值，x軸為流過(guò)層析柱的體積，藍(lán)色線(左邊峰更高的線)為樣品od280nm吸收值值，紅色為od254nm吸收值；(圖3d)離子交換層析圖，xy軸與圖3e相同，垂直線為標(biāo)記，標(biāo)記線后開始開始0-1.0mnacl線性洗脫；(圖3e)sds-page考馬斯亮藍(lán)染色圖，各泳道名稱見上面標(biāo)注，m表示蛋白分子量marker，1-5分別為96小時(shí)菌液上清、超濾濾出液、超濾濃縮液、分子篩樣品、陰離子交換柱流穿液，6-9分別表示第一個(gè)吸收峰收集的四管，左側(cè)為分子量大小，單位kd；(圖3f)bca的蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖3c(rank-n)為644μg/ml；(圖3g)糖肽酶f(pngasef)處理樣品后sds-page考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果，m表示蛋白分子量marker，con為對(duì)照組，pngasef為糖肽酶f處理組，pngasef組中35kda處為糖肽酶f。sds-page中樣品上樣量為蛋白分子量marker5μl/孔，樣品20μl/孔，sds-page濃縮膠5％，分離膠12％。

圖4顯示示出了rank-n可以阻斷rank-rankl信號(hào)通路：不同濃度的rank-n可以阻斷rank-l激活的非經(jīng)典nf-κb信號(hào)通路，1、10分別表示1、10uμg/ml，rank-l為1μg/ml。

圖5顯示鼠源骨髓單核巨噬細(xì)胞分化破骨細(xì)胞阻斷實(shí)驗(yàn)：鼠源骨髓單核巨噬細(xì)胞經(jīng)rankl誘導(dǎo)5天后trap染色觀察，紅色箭頭示破骨細(xì)胞(倒置相差顯微鏡×40)。從左向右，第一張圖為陰性對(duì)照，沒(méi)有加入rankl，鼠源骨髓單核巨噬細(xì)胞沒(méi)有分化為破骨細(xì)胞，第二張圖為1μg/mlrankl蛋白，鼠源骨髓單核巨噬細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞，圖片中的紫紅色部分均為破骨細(xì)胞，第三張圖中加入rankl及1μg/mlrank-n，結(jié)果顯示加入1μg/mlrank-n即可明顯阻止rankl引起的巨噬細(xì)胞的分化。

圖6a顯示rank-n與人rankl的結(jié)合解離曲線：將rankl與芯片耦合，通過(guò)加不同濃度的rank-n蛋白(31.25nm、62.5nm、125nm、250nm、500nm、1000nm)去結(jié)合有rankl的芯片，然后減去背景值，可得到兩者的親和解離曲線，rankon為rank與rankl結(jié)合變化，rankoff為兩者解離變化。

圖6b顯示通過(guò)t100軟件進(jìn)行擬合曲線算出平衡解離常數(shù)kd：2.62e-6m。

圖7a至圖7d示出了rank-n抑制結(jié)直腸癌組織塊體內(nèi)生長(zhǎng)：(圖7a)病人來(lái)源的結(jié)直腸癌組織移植到裸鼠皮下，經(jīng)過(guò)5次傳代穩(wěn)定。取一只裸鼠體內(nèi)結(jié)直腸癌組織塊移植到8只裸鼠皮下，1周后將帶瘤小鼠分為兩組，一組腹腔注射pbs，一組注射rank-n，2個(gè)月腫瘤塊如圖；(圖7b)腫瘤重量比較；(圖7c)腫瘤體積大小比較(*p<0.05，**p<0.01)；(圖7d)wb檢測(cè)結(jié)果。

圖8a為病人來(lái)源的dlbcl細(xì)胞(pdc)體外不加入和加入骨髓來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞(bmsc)以及加入和不加入rank-n后培養(yǎng)，進(jìn)行流式檢測(cè)dlbcl細(xì)胞死亡(7aad+annexinv雙染色)的結(jié)果。

圖8b是圖8a的量化結(jié)果。

本發(fā)明使用的酵母為巴斯德畢赤酵母(pichiapastoris)，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(cgmcc，北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào))，編號(hào)為cgmccno.12500，于2016年05月26日保藏。

具體實(shí)施方式

下面的實(shí)施例可以使本領(lǐng)域技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。

本發(fā)明中使用的縮略詞如下所示：

2.2.1材料和方法

2.2.1.1實(shí)驗(yàn)材料：巴斯德畢赤酵母gs115(復(fù)旦大學(xué)分子醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，也可從thermofisherscientific公司購(gòu)買得到)，大腸桿菌dh-5α菌株(tiangen公司)。

2.2.1.2實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備

2.2.1.3主要試劑

2.2.1.4相關(guān)載體

ppic9k載體(復(fù)旦大學(xué)于敏實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng))。

2.2.1.5試劑盒

瓊脂糖凝膠dna回收試劑盒(axygen)、pcr產(chǎn)物純化回收試劑盒(axygen)、普通質(zhì)粒小提試劑盒(axygen)、pcr產(chǎn)物純化回收試劑盒(transgenebiotech)、質(zhì)粒大量抽提試劑盒(macherey-nagel)、kod-plus(toyobo)、甘油檢測(cè)試劑盒。

2.2.1.6分子量標(biāo)記

dna分子量標(biāo)記：dl2000(takara)trans2kplus(transgenebiotech)

蛋白分子量標(biāo)記：pagerulerplusprestainedproteinladder(26617)

2.2.1.7主要溶液配制

10×d(20％葡萄糖)：溶解200gd-葡萄糖于l000ml水中，121℃高壓滅菌20分鐘。

生物素(500×)：即0.02％生物素，稱取0.01g生物素加入50ml去離子水中0.22μm濾器過(guò)濾除菌。

10×ynb(有或無(wú)氨基酸)：溶解134gynb于l000ml去離子水中，磁力攪拌溶解，0.22μm濾器過(guò)濾除菌。存于4℃保存使用。

ypd培養(yǎng)基：溶解10g酵母提取物，20g胰蛋白胨于去離子水中定容至900ml(如制ypd平板加入15g瓊脂粉)，121℃高壓滅菌15分鐘，冷卻后加入20％葡萄糖溶液100ml。

md平板：瓊脂1.5g去離子水定容至100ml，121℃高壓滅菌15分鐘后，待溫度降至50℃左右加入10ml10×ynb，200μl生物素(500×)，10ml20％葡萄糖，混勻倒平板。

mm平板：瓊脂1.5g去離子水定容至100ml，121℃高壓滅菌15分鐘后，待溫度降至50℃左右加入10ml10×ynb溶液，生物素(500×)200μl，10％(v/v)甲醇10ml，混勻倒平板。

bmgy培養(yǎng)基(1l)：10g酵母提取物，20g胰蛋白胨，溶于700ml去離子水中，121℃高壓滅菌15分鐘，冷卻至室溫，加入1m磷酸鉀緩沖液(ph6.0)100ml，10×ynb溶液100ml，生物素(500×)2ml，10％(v/v)甘油100ml。

bmmy培養(yǎng)基：10g酵母提取物，20g胰蛋白胨，溶于700ml去離子水中，121℃高壓滅菌15分鐘，冷卻至室溫，加入1m磷酸鉀緩沖液(ph6.0)100ml，10×ynb溶液100ml，生物素(500×)2ml，在隨后使用時(shí)加入甲醇。(根據(jù)實(shí)際甲醇終濃度)

發(fā)酵無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(bsm)：sodiumcitrate·2h20-1.5g，caso4·2h20-1.01g

k2so4-18g，mgso4-7.32g，koh-4.13g，85％h3po4-27ml，甘油-32ml，補(bǔ)去離子水至1l，121℃1.5kg/cm²高壓滅菌20分鐘

微量元素ptm1：cuso4·5h2o-6g，mnso4·h2o-3g，h3bo4-0.02g，zncl2-20g

ki-0.8g，namoo4·2h2o-0.2g，cocl2·6h2o-0.49g，feso4·7h2o-65.06g，h2so4-10ml，caso4·2h2o-0.5g，mgso4-1.71g，生物素-0.2g，0.22μm濾器過(guò)濾除菌，存于4℃保存使用，用量為每1lbsm中加2mlptm1。

pbs：在800ml蒸餾水中溶解nacl-8g，kcl-0.2g，na2hpo4·12h2o-3.6g

kh2po4-0.24g，定容至1l，121℃高壓滅菌20分鐘后，室溫保存。

10xruningbuffer(1l)：trisbase-30.2g，glycine-188g，溶于1l去離子水中

5xloadingbuffer(裂解蛋白)：1mtris-hcl(ph6.8)-12.5ml，sds-5g，溴酚藍(lán)-0.25g，甘油-25ml，dtt-3.855g。

50×平衡緩沖液tris-hcl(ph9.0)1l：取121.14gtris，加入800ml去離子水溶解，室溫下用濃鹽酸調(diào)ph至9.0，加水定容到1l。純化中使用濃度為0.02m。

洗脫緩沖液：取58.5gnacl，用1x平衡緩沖液tris-hcl(ph9.0)溶解。

考馬斯亮藍(lán)染液1l：r-250-2.5g，95％乙醇-500ml，蒸餾水-450ml，冰醋酸-50ml。

脫色液1l：乙醇-500ml，冰醋酸-100ml，蒸餾水400ml。

sds-page配方

濃縮膠：

濃縮膠(5％acrylamide)

分離膠：

(4)12％gel

2.2方法

2.2.1.目標(biāo)基因全基因合成：

從genebank基因庫(kù)中搜索目標(biāo)蛋白rank胞外段的cdna序列，并對(duì)cdna序列進(jìn)行巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的密碼子優(yōu)化，送于上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行rank胞外段的基因序列合成。

2.2.2rank-n密碼子優(yōu)化，并構(gòu)建到p-pic9k上

2.2.2.1rank-n巴斯德畢赤酵母密碼子優(yōu)化

優(yōu)化前：

cgcctcgagaaaagacagatcgctcctccatgtaccagtgagaagcattatgagcatctgggacggtgctgtaacaaatgtgaaccaggaaagtacatgtcttctaaatgcactactacctctgacagtgtatgtctgccctgtggcccggatgaatacttggatagctggaatgaagaagataaatgcttgctgcataaagtttgtgatacaggcaaggccctggtggccgtggtcgccggcaacagcacgaccccccggcgctgcgcgtgcacggctgggtaccactggagccaggactgcgagtgctgccgccgcaacaccgagtgcgcgccgggcctgggcgcccagcacccgttgcagctcaacaaggacacagtgtgcaaaccttgccttgcaggctacttctctgatgccttttcctccacggacaaatgcagaccctggaccaactgtaccttccttggaaagagagtagaacatcatgggacagagaaatccgatgcggtttgcagttcttctctgccagctagaaaaccaccaaatgaaccccatgtttacttgccctaagcggccgcattattaa

優(yōu)化后：

cgcctcgagaaaagacagattgctcctccatgtaccagtgagaagcattatgagcatctgggaagatgctgtaacaaatgtgaaccaggaaagtacatgtcttctaaatgcactactacctctgacagtgtatgtctgccctgtggccctgatgaatacttggattcatggaatgaagaagataaatgcttgctacataaagtttgtgatacaggcaaggccttggtggccgtggtcgccggtaactcaacgacccccaggcgttgcgcttgcacggctgggtaccactggtcacaggactgcgagtgctgtcgtcgaaacactgagtgtgctcctggtttaggtgcacaacaccctttgcaactaaacaaggacacagtttgtaaaccttgtcttgcaggttatttctctgatgcattttcctccactgacaaatgtagaccctggactaattgtacttttcttggaaagagagtcgaacatcacggtacagagaagtccgatgctgtttgtagttcttccttaccagctagaaagccaccaaatgaacctcacgtttatttgccataagcggccgcattattaa

優(yōu)化后的序列送公司(生工)全基因合成。

2.2.2.2ppic9k-rank-n大量抽提(mnxtramaxiplus)

(1)過(guò)夜搖菌，將ppic9k-rank-n陽(yáng)性克隆菌株菌液10μl加入200mllb培養(yǎng)基(加200μl氨芐青霉素)中，250rpm37℃過(guò)夜培養(yǎng)，該菌株需培養(yǎng)22小時(shí)左右。

(2)離心管收集菌體，用4個(gè)50ml離心管收集菌液離心4000rpm,15分鐘，棄上清，盡量棄凈。

(3)重懸，用bufferres10ml震蕩重懸所有菌體。

(4)細(xì)胞裂解，加入10mlbufferlys(確保用之前sds沒(méi)有析出)，輕輕上下顛倒5次，室溫靜置5分鐘。

(5)平衡柱子，在柱子上沿璧旋轉(zhuǎn)加入12mlbufferequ，讓其重力作用自然流出。

(6)中和，4中液體中加入10mlbufferneu，上下輕輕顛倒離心管10到15次。

(7)混勻和上柱，將離心管中液體混勻后直接倒入平衡好的柱子上，讓液體隨重力自然流出。

(8)洗滌，待柱子快流盡時(shí)，旋轉(zhuǎn)加入10mlbufferequ洗一遍。

(9)去掉柱子里的濾紙。

(10)洗滌，柱子里居中垂直加入16mlwashbuffer讓液體隨重力自然流出。

(11)洗脫，待其快流盡，加入5mlelutionbuffer(使用前在50℃水中孵育10分鐘)，用15ml離心管收集洗脫液。

(12)沉淀，洗脫液中加入3.5ml異丙醇，混勻。

(13)分裝到6個(gè)ep管中，離心12000rpm4℃30分鐘。

(14)棄上清，每個(gè)ep管中加入70％乙醇再洗滌一遍離心15000g5分鐘4℃，棄上清，室溫靜置10分鐘。

(15)每管加20-30μl去離子水震蕩混勻后合并在一起，用nanodrop測(cè)定濃度，-30℃保存。

2.2.2.3將合成的序列、載體ppic9k用xhoi和noti雙酶切

反應(yīng)體系40μl：

37℃水浴箱1小時(shí)到2小時(shí)。

2.2.2.4雙酶切產(chǎn)物切膠回收,連接，轉(zhuǎn)化，搖菌，小抽鑒定

雙酶切產(chǎn)物切膠回收

將酶切產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳(六孔梳1％瓊脂糖30分鐘)，用手術(shù)刀片切取含目的片段的瓊脂糖凝膠塊，rank-n(550bp左右)、ppic9k(9000bp左右)，凝膠回收試劑盒(axygen公司)回收獲取目的條帶，步驟如下：

(1)切膠樣品用天平稱重后加3倍體積的buffera。

(2)將樣品放在75℃水浴鍋溶解，6到8分鐘，期間間隔2分鐘，顛倒ep管。

(3)加入0.5倍體積buffera的bufferb。

(4)柱子放到收集管上，將樣品冷卻后加入柱子，室溫放置1分鐘。

(5)離心12000rpm1分鐘，棄收集管中廢液。

(6)沿柱子內(nèi)壁加入500μlbufferw1。

(7)離心12000rpm1分鐘，棄收集管中廢液，重復(fù)步驟4，5。

(8)沿柱子內(nèi)壁加入700μlbufferw2，離心12000rpm1分鐘，棄收集管中廢液，重復(fù)步驟8。

(9)將柱子放在空的收集管中，離心12000rpm2分鐘。

(10)取一個(gè)新的ep管，將柱子放在上面，室溫靜置1分鐘。

(11)柱子上加入25μl去離子水，室溫靜置1分鐘離心12000rpm1分鐘。

(12)此時(shí)ep管中即為純化的dna，用nanodrop測(cè)定濃度后，-30℃保存待用。

2.2.2.5膠回收連接

連接反應(yīng)體系(10μl)：

16℃連接過(guò)夜。

2.2.2.6連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化e.colidh-5α

(1)從-80℃冰箱中取出dh5α感受態(tài)，冰上融化。

(2)5μl連接產(chǎn)物放入50μl的dh5α中，冰上放置30分鐘。

(3)42℃水浴箱孵育90秒。

(4)迅速冰浴5分鐘。

(5)超凈臺(tái)內(nèi)加入800μl無(wú)抗生素的lb培養(yǎng)基，37℃180rpm1小時(shí)。

(6)離心5000rpm3-4分鐘，吸去上清800μl。

(8)將剩余200μl菌液吹勻涂布在含氨芐抗生素的lb平板上。37℃倒置過(guò)夜培養(yǎng)。

(9)14-18小時(shí)后檢查是否有單克隆菌落長(zhǎng)出。

2.2.2.7質(zhì)粒抽提

質(zhì)粒抽提試劑盒(axygen公司)過(guò)程如下：

(1)挑單克隆過(guò)夜搖菌：將lb板上長(zhǎng)的菌株挑取到4ml帶氨芐抗生素培養(yǎng)基中(15ml無(wú)菌離心管或者試管)，250rpm37℃過(guò)夜培養(yǎng)，一般12-16小時(shí)。

(2)用ep管收集菌液：在超凈臺(tái)中將離心管中菌液倒入ep管中(一般一次只能倒入1.5ml)，離心12000rpm1分鐘，棄上清。再在相同的ep中倒入同編號(hào)菌液1.5ml，離心12000rpm1分鐘，棄上清。

(3)加入250μlbuffers1，震蕩混勻。

(4)加入250μlbuffers2，輕輕顛倒混勻5-10下，達(dá)到澄清。

(5)加入350μlbuffers3，顛倒混勻5-10下，可出現(xiàn)白色絮狀物質(zhì)。

(6)離心12000rpm10分鐘。

(7)柱子放到收集管上，小心吸取上清加入柱子，室溫放置1分鐘。

(8)離心12000rpm1分鐘，棄收集管中廢液。

(9)沿柱子內(nèi)壁加入500μlbufferw1，離心12000rpm1分鐘，棄收集管中廢液。

(10)沿柱子內(nèi)壁加入700μlbufferw2，離心12000rpm1分鐘，棄收集管中廢液，重復(fù)步驟10。

(11)將柱子放在空的收集管中，離心12000rpm2分鐘。

(12)取一個(gè)新的ep管，將柱子放在上面，室溫靜置1分鐘。

(13)柱子上加入60μl去離子水，室溫靜置1分鐘，離心12000rpm1分鐘。

(14)此時(shí)ep管中即為純化的dna，用nanodrop測(cè)定濃度后，-30℃保存待用。

2.2.2.8抽提質(zhì)粒用xhoi和noti進(jìn)行雙酶切鑒定

反應(yīng)體系10μl：

37℃水浴1小時(shí)到2小時(shí)后，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳(15孔梳1％瓊脂糖30分鐘)出現(xiàn)9k+0.5k條帶即為陽(yáng)性克隆，取條帶匹配樣本2-3個(gè)送公司測(cè)序(由上海桑尼生物公司完成)，同時(shí)取陽(yáng)性克隆菌株菌液等體積加入50％無(wú)菌甘油-80℃保存。

2.2.3.ppic9k-rank-n電轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母gs115并篩選獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)株

2.2.3.1取測(cè)序正確的ppic9k-rank-n大量抽提(mnxtramaxiplus)方法同2.2.2.2。

2.2.3.2ppic9k-rank-n線性化

單酶切反應(yīng)體系100μl：

37℃水浴過(guò)夜酶切，酶切的質(zhì)粒用pcr回收試劑盒(transgenebiotech)回收，步驟如下：

(1)樣品加5倍體積的溶液bb，震蕩混勻。

(2)柱子放到收集管上，將樣品加入柱子，室溫放置1分鐘。

(3)離心12000rpm1分鐘，棄收集管中廢液。

(4)沿柱子內(nèi)壁加入650μlwb。

(5)離心12000rpm1分鐘，棄收集管中廢液，重復(fù)步驟4，5。

(6)將柱子放在空的收集管中，離心12000rpm2分鐘。

(7)取一個(gè)新的ep管，將柱子放在上面，室溫靜置1分鐘。

(8)柱子上加入30-50μl去離子水(提前65℃水浴10分鐘)，室溫靜置1分鐘，離心12000rpm1分鐘。(可再重復(fù)一次)

(9)用nanodrop測(cè)定濃度后，-30℃保存待用。

2.2.3.3巴斯德畢赤酵母gs115菌種感受態(tài)制備

(1)挑gs115單克隆菌落于5mlypd培養(yǎng)基，30℃，250rpm，培養(yǎng)12-15小時(shí)。

(2)取培養(yǎng)液200μl，接于200mlypd培養(yǎng)基的1l搖瓶中，30℃，250rpm，培養(yǎng)至od600＝0.6-0.8。

(3)冰浴15分鐘，4℃，無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)至50ml離心管中，3000rpm，離心5分鐘。

(4)棄上清，無(wú)菌條件下加入50ml預(yù)冷的無(wú)菌水重懸菌體,冰浴15分鐘，4℃，3000rpm，離心5分鐘。

(5)重復(fù)步驟4。

(6)棄上清，無(wú)菌條件下加入40ml預(yù)冷的山梨醇重懸菌體，冰浴15分鐘，4℃，

3000rpm離心5分鐘。

(7)重復(fù)步驟6。

(8)棄上清，無(wú)菌條件下加入1ml預(yù)冷的山梨醇重懸菌體，分裝，120μl/支，冰浴備用。

2.2.3.4ppic9k-rank-n電轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母gs115：

(1)取線性化的ppic9k-rank-n質(zhì)粒30μg，加入120μlgs115菌種感受態(tài)。

(2)混勻后轉(zhuǎn)入無(wú)菌已遇冷的電轉(zhuǎn)化杯中。

(3)電轉(zhuǎn)儀設(shè)置成真菌模式，將電轉(zhuǎn)化杯放入電轉(zhuǎn)儀固定鐵片間，按pμlse鍵進(jìn)行電轉(zhuǎn)。

(4)待脈沖聲音響過(guò)之后，立即加入1ml預(yù)冷1m山梨醇。

(5)30℃培養(yǎng)1小時(shí)，分500μl涂布于15cmmd板上，48小時(shí)后觀察平板上是否有單克隆菌落生長(zhǎng)。

2.2.3.5篩選多拷貝酵母轉(zhuǎn)化子

(1)72小時(shí)后his-md板上長(zhǎng)出his⁺轉(zhuǎn)化子，用滅菌牙簽點(diǎn)取單克隆菌株4x96個(gè)，于96孔板中30℃培養(yǎng)(含ypd200μl/孔)。

(2)1天后將96孔板中菌取10μl轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的96孔板中30℃培養(yǎng)(含ypd200μl/孔)。

(3)1天后，取5μl菌液接種于2mg/mlypd-g418(遺傳霉素)平板上，30℃培養(yǎng)3天后選取長(zhǎng)出菌株依次接種于4mg/ml板子上進(jìn)行，重復(fù)上述過(guò)程取長(zhǎng)出菌株依次接種6mg/ml、8mg/ml.......，g418可以篩選到直到?jīng)]有菌生長(zhǎng)為止(必須保證g418的抗菌活性)。保留僅在各濃度梯度下生長(zhǎng)菌株2-3株。本次試驗(yàn)于6mg/mlypd-g418平板上篩選出兩株多拷貝陽(yáng)性酵母轉(zhuǎn)化菌株。

2.2.3.6巴斯德畢赤酵母轉(zhuǎn)化子甲醇利用表型md板、mm板鑒定

(1)準(zhǔn)備md，mm平板。

(2)將待鑒定的菌落在mm、md板上四區(qū)劃線并做好標(biāo)記。

(3)30℃培養(yǎng)3天待克隆長(zhǎng)出后比較菌落大小。md板大，mm板小，為甲醇利用慢型，md板和mm板上菌落一樣大，為甲醇利用快型。

2.2.3.7菌株甲醇誘導(dǎo)表達(dá)

(1)將2mg/ml、4mg/ml、6mg/mlypd-g418平板上篩選的菌株四區(qū)劃線于ypd平板上，待出現(xiàn)單克隆菌落。

(2)挑單克隆菌落接種于5mlbmgy培養(yǎng)基中，30℃250rpm過(guò)夜培養(yǎng)。

(3)菌液1:100接種到100mlbmgy中，30℃250rpm培養(yǎng)，檢測(cè)od600數(shù)值。

(4)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(od達(dá)到2-6之間，約17小時(shí))時(shí)，留樣200μl，留樣樣品離心4000rpm，5分鐘，取上清160μl，-20度存放。同時(shí)換bmmy培養(yǎng)基并加入甲醇至終濃度1％開始誘導(dǎo)。(上清若渾濁，多為大腸桿菌污染)。

(5)每12小時(shí)后補(bǔ)加100％甲醇至終濃度1％開始誘導(dǎo)表達(dá)，留樣200μl，留樣樣品離心4000rpm，5分鐘，取上清160μl，-20度存放。

(6)誘導(dǎo)96小時(shí)后，收集搖瓶培養(yǎng)液，4℃離心4000rpm，20分鐘，收集上清備用。

(7)檢測(cè)表達(dá)將0-96h樣品加5xloading40μl，100℃煮沸10分鐘，12％分離膠sds-page，150v，約65分鐘。加考馬斯亮藍(lán)染色液于搖床上過(guò)夜染色，脫色處理后觀察結(jié)果。

2.2.3.7gs115菌凍存

(1)將gs115菌株四區(qū)劃線于ypd平板。

(2)2至3天后，挑單克隆菌株于5mlypd培養(yǎng)基中30℃250rpm過(guò)夜培養(yǎng)。

(3)將過(guò)夜培養(yǎng)菌按1:100接種到含100mlypd的搖瓶中30℃250rpm培養(yǎng)。

(4)待od600長(zhǎng)到5左右，3000rpm4℃離心5分鐘收集菌體。

(5)用含50％甘油ypd培養(yǎng)基10ml重懸菌體，每ep管100μl凍存于-80℃。

2.2.4免疫蛋白印跡westernblot

將蛋白樣品加入5×loadingbuffer100℃加熱10分鐘變性，進(jìn)行westernblot檢測(cè)或儲(chǔ)存于-20℃。

(1)上樣：將20ug-40ug蛋白樣品加入配好的12％sds-page膠中；

(2)電泳：濃縮膠恒壓80v40分鐘，分離膠恒壓120v60分鐘；

(3)轉(zhuǎn)膜：將pvdf膜(4.5cmx8cm)泡在甲醇中5分鐘，轉(zhuǎn)膜液冰上預(yù)冷30分鐘；采用夾心法轉(zhuǎn)膜，順序?yàn)椋汉谏芰习?負(fù)極)-海綿-濾紙-膠-pvdf膜-濾紙-海綿-白色塑料板(正極)，再將轉(zhuǎn)膜夾按照正確電極方向放入轉(zhuǎn)膜槽中，加入轉(zhuǎn)膜液，冰塊，恒壓100v冰浴中轉(zhuǎn)1小時(shí)；

(4)封閉:5％脫脂牛奶放在搖床上1-2個(gè)小時(shí)。

(5)一抗：按適宜一抗?jié)舛认♂尶贵w(按抗體說(shuō)明書上要求)，4℃孵育過(guò)夜。

(6)洗膜：pbs-0.05％tween20洗膜三次，每次8分鐘。

(7)二抗：加入適當(dāng)濃度的hrp標(biāo)記二抗(按抗體說(shuō)明書上要求)，室溫孵育1-2小時(shí)。

(8)洗膜：pbs-0.05％tween20洗膜三次，每次5分鐘。

(9)顯影：用piercewestpico底物或者millipore顯影，fujifilmlas4000掃膜成像。

2.2.5ppic9k-rank-n菌株高密度發(fā)酵

接種：

(1)-80℃低溫冰箱中取出菌株，劃ypd平板。

(2)2至3天后，待平板長(zhǎng)出單克隆，挑單克隆菌株于5mlypd培養(yǎng)基中30℃250rpm過(guò)夜培養(yǎng)，此為一級(jí)種子液。

(3)將一級(jí)種子液1:500放大到200mlypd搖瓶中，30℃250rpm培養(yǎng)約12小時(shí)，達(dá)到od6006-8，作為二級(jí)種子液。

發(fā)酵：

(1)在5l發(fā)酵罐中裝入3lbsm無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，121℃高壓滅菌20分鐘，冷卻至室溫，加入ptm16ml，用氨水調(diào)節(jié)ph至5.0。

(2)接入二級(jí)種子液200ml，溶氧(do)控制為35％，攪拌速度為500rpm，溫度設(shè)置為30℃，開始發(fā)酵，每隔4小時(shí)測(cè)定一次od600。od600超過(guò)100后攪拌速度改為650rpm。待發(fā)酵罐中甘油被耗盡后，加入甲醇開始誘導(dǎo)，添加甲醇量在4小時(shí)內(nèi)從0.4ml/分鐘到4ml/分鐘，以后一直維持此速度。每隔4小時(shí)測(cè)定發(fā)酵液od，并離心收上清液。誘導(dǎo)24小時(shí)后進(jìn)行還原型sds-page蛋白電泳、考染檢測(cè)以確定是否有目的蛋白表達(dá)。誘導(dǎo)36小時(shí)后下罐，收集發(fā)酵液上清4℃保存，隨后進(jìn)行蛋白質(zhì)的純化工作。

2.2.6蛋白純化

2.2.6.1硫酸銨分級(jí)沉淀

首先配制1l硫酸銨飽和溶液。取50ml酵母菌上清液于500ml離心管中，以此為基準(zhǔn)體積計(jì)算不同飽和度硫酸銨溶液的加入體積(參照硫酸銨沉淀法純化蛋白配比用表)。實(shí)驗(yàn)硫酸銨飽和度每10％為一間隔，范圍從30％到70％。實(shí)驗(yàn)在4℃條件下進(jìn)行，用1cm攪拌子攪拌，加完硫酸銨后持續(xù)攪拌4小時(shí)，再置離心管于4℃高速離心機(jī)上以每分鐘10000轉(zhuǎn)離心40分鐘。取上層清液樣于一干凈容器內(nèi)，下層沉淀用q-sepharose-ff陰離子交換柱平衡緩沖液重懸-20℃保存，備還原型sds-page蛋白電泳、考染鑒定。接下來(lái)以前次上層清液樣體積為基數(shù)計(jì)算下一步飽和硫酸銨溶液的體積，應(yīng)扣除前次實(shí)際加入體積，然后重復(fù)前面的操作至70％硫酸銨飽和度。

sds-page鑒定：10孔12％sds-page膠，每孔加20μl蛋白樣品?？捡R斯亮藍(lán)染色4小時(shí)，脫色2h至目的蛋白條帶清晰為止。

2.2.6.2超濾—sephadexg-50—q-sepharose-ff法純化：

(1)超濾，發(fā)酵液上清通過(guò)millipore超濾系統(tǒng)用截留3kd的膜濃縮到500ml。

(2)sephadexg-50凝膠過(guò)濾層析，使用前先用0.1mnaoh清洗sephadexg-50層析柱1-2柱體積(cv)，接著用tris-hcl(ph9.0)平衡2個(gè)cv以上。將超濾濃縮液約500ml以5ml/分鐘過(guò)柱，0.02mtris-hcl(ph9.0)緩沖液洗脫，流速8ml/分鐘。紫外280nm監(jiān)測(cè)收集各個(gè)吸收峰下蛋白。

(3)電泳檢測(cè)目的蛋白峰，凝膠過(guò)濾層析后收集樣品進(jìn)行電泳，考馬斯亮藍(lán)染色脫色后，確定是否含有目的條帶的組分。

(4)q-sepharose-ff離子交換層析，使用前用0.1mnaoh清洗q-sepharose-ff1個(gè)柱體積，100％b將b通道充滿洗脫緩沖液(1mnacltris-hcl)過(guò)柱1個(gè)cv，0.02mph9.0的tris-hcl平衡10個(gè)柱體積后以5ml/分鐘開始上樣[(3)中收集的目的蛋白組分]。樣品上樣結(jié)束后，速度調(diào)為8ml/分鐘平衡緩沖液清洗柱子4個(gè)柱體積，接下來(lái)將b通道調(diào)為20％100分鐘，8ml/分鐘進(jìn)行連續(xù)梯度洗脫，紫外280nm監(jiān)測(cè)各個(gè)蛋白吸收峰并收集各組份蛋白(留意觀察，若吸收峰出現(xiàn)拐點(diǎn)應(yīng)及時(shí)換新管收集蛋白)，各組份蛋白使用考馬斯亮藍(lán)染色脫色和免疫蛋白印跡確定含有目的蛋白的組份。bca法測(cè)定蛋白濃度。純化后的目的蛋白分裝，冷凍抽干。

2.2.7rank-n功能驗(yàn)證

(1)raw264.7細(xì)胞鋪12孔板，10⁶細(xì)胞/孔，共12孔。

(2)實(shí)驗(yàn)設(shè)4個(gè)組，分別為陰性對(duì)照組，rankl(50ng/ml)組,rank-n(1μg/ml)、rankl(50ng/ml)組和rank-n(10μg/ml)、rankl(50ng/ml)組。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

(3)24小時(shí)后，收樣，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到ep管中，500g4分鐘離心去上清。

(8)用1mlpbs重懸細(xì)胞，500g，4分鐘離心去上清。

(9)用80μl1xloading重懸細(xì)胞，100℃10分鐘，樣品凍存于-30℃冰箱。

(10)westernblot檢測(cè)，方法同2.2.4。

2.2.8阻斷rank介導(dǎo)的非經(jīng)典nf-κb信號(hào)通路

2.2.8.1rank-n阻斷鼠源骨髓單核巨噬細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)

小鼠bmm(骨髓單核巨噬細(xì)胞)提取及誘導(dǎo)成破骨細(xì)胞：

準(zhǔn)備器材及試劑：75％乙醇,1xpbs(無(wú)菌)，1ml注射器,剪刀、鑷子、滅菌草紙等手術(shù)器械,dmem培養(yǎng)液、fbs、雙抗,紅細(xì)胞裂解液(rbclysisbuffer)：nh4cl4.1425g，khco30.5006g，edta-na20.018612g，500mlddh2o配置，調(diào)ph至7.2-7.4,m-csf(r&d)，rankl(r&d)。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：

5周齡c57的雄性小鼠,體重25-30g,購(gòu)于上海上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,喂養(yǎng)于上海中科院健康所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，環(huán)境溫度保持在22±2℃，并保證12小時(shí)晝夜節(jié)律,普通鼠食喂養(yǎng)。

破骨細(xì)胞的誘導(dǎo)及培養(yǎng):

1.取5周齡c57小鼠4只,腹腔注射1.2％的三溴乙醇溶液，小鼠的劑量為0.2ml/10克。麻醉后處死,置于75％的酒精中浸泡10分鐘。

2.剪斷股骨和脛骨兩端，在6cm培養(yǎng)皿中用1ml注射器吸取加1％雙抗和10％fbs的dmem沖洗骨頭至泛白，移液器將細(xì)胞團(tuán)吹散，70μm尼龍膜過(guò)濾去大塊，1000rpm離心5分鐘。

3.去上清，紅細(xì)胞裂解液裂紅后，1000rpm離心5分鐘后，去上清，用含1％雙抗10％fbs的dmem重懸細(xì)胞。(可以忽略不做)

4.將細(xì)胞接種于10cm培養(yǎng)皿中，加入含1％雙抗10％fbs的dmem，并加入m-csf(終濃度為20ng/ml，r&d)，37℃，5％co2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)2天，貼壁細(xì)胞視為bmm。

5.胰酶消化掉貼壁細(xì)胞30分鐘，然后細(xì)胞刮刮下細(xì)胞并計(jì)數(shù)，1x10⁵細(xì)胞/孔l接種于6孔板中誘導(dǎo)成破骨細(xì)胞，加入含1％雙抗10％fbs的dmem，并加入m-csf(終濃度為20ng/ml)，貼壁2天，換液，加入m-csf，rankl(終濃度為50-100ng/ml)37℃，5％co2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，至第5-7天檢測(cè)破骨細(xì)胞形成情況，為后續(xù)做破骨細(xì)胞分化檢測(cè)試驗(yàn)做準(zhǔn)備。(24孔板，5x10³細(xì)胞/孔，做破骨細(xì)胞分化檢測(cè))。

2.2.8.2破骨細(xì)胞(trap)染色觀察：

取3ml鼠源骨髓單核巨噬細(xì)胞的于24孔板中，每孔1ml，細(xì)胞數(shù)約為5x10³細(xì)胞/孔,共3孔。待細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)細(xì)胞分為3組，其中一孔加入1μg/mlrankl蛋白，一孔同時(shí)加入1μg/mlrank-n，另外一孔做陰性對(duì)照。37℃，5％co2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，至第5-7天檢測(cè)破骨細(xì)胞形成情況，用細(xì)胞抗酒石酸酸性磷酸酶(trap)活性染色試劑盒染色，再用倒置相差顯微鏡觀察拍照。

2.2.9biacoret100實(shí)驗(yàn)檢測(cè)rankl和rank的親和平衡常數(shù)

bia技術(shù)是基于一種表面等離子共振(spr)的物理光學(xué)現(xiàn)象的生物傳感分析技術(shù)。不必使用熒光標(biāo)記和同位素標(biāo)記，從而保持了生物分子的天然活性。傳感器芯片是實(shí)時(shí)信號(hào)傳導(dǎo)的載體。本次試驗(yàn)我們選用了用途最廣的cm5芯片，傳感片cm5表面覆蓋了一層葡聚糖。帶有化學(xué)基團(tuán)如－nh2，－sh，－cho，－oh，－cooh的生物分子(ligand)可通過(guò)化學(xué)反應(yīng)，以共價(jià)鍵耦聯(lián)的方式與葡聚糖上的羧基耦聯(lián)。從而使生物分子耦聯(lián)到傳感片表面。

1、緩沖液準(zhǔn)備：對(duì)1xpbs緩沖液進(jìn)行高壓滅菌和超聲脫氣處理。

2、預(yù)結(jié)合實(shí)驗(yàn)：將樣品溶解在不同ph值的緩沖液中，使其帶上不同量的電荷。然后，將樣品流過(guò)芯片表面，觀察它與芯片的結(jié)合曲線，判斷出合適的條件。

3、測(cè)試：最終選定用ph5.5的醋酸鈉低速流過(guò)cm5，使芯片與葡聚糖上的羧基結(jié)合。

4、用100μlrankl蛋白溶液(280nm)通過(guò)cm5芯片表面，與芯片耦合。

5、用100μlrank蛋白溶液(1000nm)上樣，使其通過(guò)結(jié)合有rankl的芯片，并用buffer解離5分鐘。

6、將rank濃度用1xpbs緩沖液稀釋成合適的濃度依次為1000nm、500nm、250nm、125nm、62.5nm、31.25nm，使其通過(guò)結(jié)合有rankl的芯片并解離。

6、通過(guò)t100中分析軟件得到rank與rankl的親和解離常數(shù)。

2.2.10病人來(lái)源的異種移植(patientderivedxenograft，pdx)模型

裸小鼠：babl/c遺傳背景，t細(xì)胞免疫缺陷小鼠，購(gòu)買于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于中科院上海生命科學(xué)研究院健康科學(xué)研究所spf級(jí)動(dòng)物房；

使用人結(jié)直腸癌標(biāo)本建立裸鼠腫瘤模型：從上海中山醫(yī)院采集新鮮腫瘤標(biāo)本，將新鮮的腫瘤標(biāo)本先用生理鹽水反復(fù)沖洗后剪去非腫瘤組織及壞死部分，然后浸泡于加入雙抗的dmem培養(yǎng)基的無(wú)菌離心管中，放在冰盒里返回實(shí)驗(yàn)室。

皮下移植：在無(wú)菌超凈臺(tái)中取出離心管倒入平皿中，先用三溴乙醇腹腔麻醉小鼠(4周齡)，后用眼科剪將組織剪成3*3*3mm³的小塊。小鼠取左或右側(cè)臥位，常規(guī)消毒后分別在左右腋中線處縱向剪一小切口，用彎眼科鑷從切口處在皮下(不要戳破)鈍性分離出適度腔隙，用直眼科鑷將結(jié)直腸癌組織塊塞入腔隙內(nèi)，皮釘固定切口。(若塞入兩個(gè)以上腫瘤塊應(yīng)讓其在腔隙內(nèi)排成條狀便于血供)

腎囊膜移植：在培養(yǎng)皿中,用眼科剪將組織剪成1*1*1mm³小塊，然后三溴乙醇腹腔麻醉小鼠(4周齡)。小鼠取右側(cè)臥位，常規(guī)消毒后從左側(cè)腎臟部位垂直脊椎切開一約8mm的皮膚切口后平行切開7mm的肌肉切口，打開腹腔托出腎臟。用血管鉗將6塊淋巴瘤組織小塊(約1*1*1mm³)接種于腎囊膜下，還納腎臟于腹腔，分層縫合肌層及皮膚層。

待第一代荷瘤鼠瘤塊長(zhǎng)至800mm³時(shí)(約2個(gè)月)，取出瘤塊長(zhǎng)至800mm³一部分進(jìn)行傳代接種；一部分標(biāo)本浸泡于4％的多聚甲醛中固定送于中山醫(yī)院進(jìn)行病理學(xué)檢測(cè)；另一部分瘤塊修剪成體積2*2*2mm³大小放入裝有凍存液的速凍管中于超低溫冰箱中(-80℃)過(guò)夜，次日取出放入-196℃的液氮罐中,以備日后復(fù)蘇使用。如此連續(xù)傳代至第五代，觀察每一代的瘤體生長(zhǎng)情況及移植瘤組織病理學(xué)變化。五代后腫瘤組織性狀穩(wěn)定，后續(xù)rank-n的成藥性實(shí)驗(yàn)均使用五代后荷瘤裸鼠作為實(shí)驗(yàn)鼠。將穩(wěn)定的結(jié)直腸癌腫瘤組織塊(3*1*1mm³)移植到裸鼠腎囊膜或皮下一周后，腹腔注射rank-n(10mg/kg)或者等體積pbs，兩天一次，1-2個(gè)月后取出腫瘤塊分析。

2.2.11病人來(lái)源的彌漫型大b細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞(dlbclpdc)和小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bmsc)共培養(yǎng)

首先將c57野生型小鼠體內(nèi)骨髓細(xì)胞取出鋪到24孔板中(約5到6只一個(gè)24孔板)，在dmem10％fbs血清中培養(yǎng)5天后細(xì)胞長(zhǎng)滿。接下來(lái)將裸鼠腎囊膜下dlbcl腫瘤塊取出、剪碎、消化成單細(xì)胞，使用ficoll分選出單核細(xì)胞2*10⁵/ml接種于長(zhǎng)滿bmsc中24孔中。共同培養(yǎng)4天后檢測(cè)。

2.2.12facs染色分析

(1)細(xì)胞4℃離心500g4分鐘，棄掉上清。

(2)加入1ml遇冷的pbs(含0.5％fbs)重懸細(xì)胞，500g，4分鐘4℃離心，棄掉上清。

(3)用100μlpbs(含0.5％fbs)重懸細(xì)胞,加入annexinv、7-aad分別5μl。同時(shí)做只加入annexinv或者7-aad以及不加染料對(duì)照組。4℃避光染色30分鐘。

(4)染色結(jié)束后加入1mlpbs(含0.5％fbs)，輕輕吹打細(xì)胞，500g4分鐘4℃離心，棄掉上清。

(5)重復(fù)步驟4。

(6)用300μlpbs(含0.5％fbs)重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。

3.結(jié)果

3.1克隆獲得rank胞外段基因

成熟rank的胞外蛋白片段為全長(zhǎng)蛋白的，在pubmed-gene查出人rank全長(zhǎng)序列選擇胞外段(n端)29-213aa，相應(yīng)mrna長(zhǎng)度為552bp。對(duì)胞外段進(jìn)行巴斯德畢赤酵母密碼子優(yōu)化后的序列送公司(生工)全基因合成。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示此條帶略大于500bp(見圖1a)ppic9k-rank-n構(gòu)建后xhoi和noti雙酶切鑒定(見圖1b)。酶切產(chǎn)物使用膠回收試劑盒回收，使用t4連接酶連接1小時(shí)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化dh5α細(xì)菌。搖菌質(zhì)粒小抽后，將獲得的質(zhì)粒再次用xhoi和noti雙酶切鑒定，雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果呈現(xiàn)兩條帶(9000bp+500bp)為陽(yáng)性克隆，鑒定為陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒送公司測(cè)序。在pubmed網(wǎng)站上用blast進(jìn)行比對(duì)，測(cè)序結(jié)果插入片段序列與genebank網(wǎng)站中rank胞外段序列完全一致(圖1c)。

3.2篩選獲得rank-n較高表達(dá)巴斯德畢赤酵母菌株

線性化ppic9k-rank-n并電轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母gs115，通過(guò)組氨酸缺陷和g418遺傳霉素兩輪篩選，8株g418較高抗性菌株被篩選得到，在此將其編號(hào)為1-8，其中1-6在4mg/mlg418平板上生長(zhǎng)菌株，7、8在6mg/mlg418上生長(zhǎng)(圖2e)。分別將這些菌株進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)：具體方法見方法2.2.3.5，保持甲醇誘導(dǎo)濃度為1％/12小時(shí)。96小時(shí)后停止誘導(dǎo)，將收集的樣品進(jìn)行sds-page電泳，考馬斯亮藍(lán)染色脫色后(具體見方法)。發(fā)現(xiàn)在目的蛋白大小區(qū)域(27kd)有一個(gè)明顯的逐漸增加的蛋白帶(圖2d)。接下來(lái)用rank抗體對(duì)2號(hào)菌株誘導(dǎo)表達(dá)的上清進(jìn)行免疫蛋白印記分析。該條帶被人rank抗體特異性識(shí)別，證明該條帶為rank-n蛋白(圖2f)。

3.3rank-n表達(dá)菌株蛋白搖瓶表達(dá)、純化和糖基化鑒定

在rank-n表達(dá)菌株蛋白搖瓶表達(dá)純化工作中我們首先在實(shí)驗(yàn)室小體系搖瓶中進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過(guò)搖瓶表達(dá)發(fā)酵的60％硫酸銨沉淀(3b)-3k半透膜透析-qsepharoseff離子交換層析三個(gè)步驟純化重組蛋白。優(yōu)化條件并得出有效的純化數(shù)據(jù)。

在2.2l實(shí)驗(yàn)室搖瓶誘導(dǎo)表達(dá)96h后離心收集酵母培養(yǎng)上清，2l菌液上清被收集后使用截留3kd超濾膜進(jìn)行超濾，收集超濾后截留的組分體積約為500ml。接下來(lái)樣品用akta儀器進(jìn)行sephadexg-50凝膠層析。收集od280紫外吸收峰下的樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page),考馬斯亮藍(lán)染色顯示含目的蛋白組分出現(xiàn)在第一個(gè)紫外吸收峰中(圖3c)。收集到樣品約650ml，這時(shí)候鹽分和部分色素已經(jīng)被去除。將含有目的蛋白組分用q-sepharose-ff陰離子交換柱繼續(xù)純化，0-1.0mnacl線性洗脫，目的蛋白組分在0.03molnacl通道處被收集獲得(第一個(gè)紫外吸收峰1500ml處，見圖3d箭頭處)，共收集到3管，分別45ml。分子篩收集到樣品和離子交換純化后獲得的樣品進(jìn)行sds-page考馬斯亮藍(lán)染色后結(jié)果(見圖3e)。并進(jìn)行bca的蛋白質(zhì)定量(圖3f)，梯度稀釋樣品，并測(cè)定od570，繪制曲線，得到方程y＝1618.2x+3.6356,r2＝0.9995。為了證實(shí)表達(dá)純化的蛋白大小(約28kd)與理論大小(21kd)是不是由于糖基化導(dǎo)致的，我們將純化的蛋白用去除n-糖基化的糖肽酶f(pngasef)處理，發(fā)現(xiàn)處理后蛋白大小變小為21kda，與理論一致(圖3g)，因此該蛋白發(fā)生了n-糖基化。

3.4rank-n的體外功能

3.4.1功能性rank-n可以體外阻斷rank-rankl信號(hào)介導(dǎo)的非經(jīng)典nf-κb信號(hào)通路

為了探索rank-n是否具有阻斷rank介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。raw264.7細(xì)胞在rankl作用24小時(shí)后p100剪切成p52明顯增加，在僅僅加入1μg/ml人rank-n后，p52的增加相對(duì)于對(duì)照組減少，且這種減少隨著rank-n濃度增加而更加明顯。而在rank-n加入后traf3的降解沒(méi)有對(duì)照組明顯同時(shí)relb的增加相對(duì)于對(duì)照組減少(圖4)。p100剪切成p52也沒(méi)有對(duì)照組多這些實(shí)驗(yàn)證明rank-n可以體外阻斷rank介導(dǎo)的非經(jīng)典nf-κb信號(hào)通路激活。

3.4.2人rankl蛋白促進(jìn)鼠源骨髓單核巨噬細(xì)胞分化和rank-n阻斷破骨細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)

取3ml鼠源骨髓單核巨噬細(xì)胞的于24孔板中3個(gè)孔，每孔1ml，細(xì)胞數(shù)約為5x10³細(xì)胞/孔，其中一孔加入1μg/mlrankl蛋白，另一孔加入50ng/mlrankl及1ug/mlrank-n，還有一孔做為空白對(duì)照。培養(yǎng)五天后，可以觀察到鼠源骨髓單核巨噬細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞：多個(gè)單核細(xì)胞融合、體積增大的巨細(xì)胞，用trap試劑染色可清楚觀察(圖5)。

3.4.3biacoret100實(shí)驗(yàn)測(cè)定人rank和rankl蛋白之間的相互作用

我們通過(guò)biacoret100進(jìn)一步驗(yàn)證rank和rankl的相互作用，通過(guò)軟件測(cè)定平衡解離常數(shù)kd值，直觀反映出兩者的親和力。本次試驗(yàn)選用cm5芯片，使rankl以共價(jià)鍵耦聯(lián)的方式與葡聚糖上的羧基耦聯(lián)。首先將rankl與芯片耦合，將rank濃度用1xpbs緩沖液稀釋成合適的濃度依次為1000nm、500nm、250nm、125nm、62.5nm、31.25nm，使其通過(guò)結(jié)合有rankl的芯片。當(dāng)兩者結(jié)合時(shí)cm5芯片表面物質(zhì)的質(zhì)量會(huì)發(fā)生一個(gè)動(dòng)態(tài)變化，這時(shí)t100會(huì)記錄下對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值(response)。通過(guò)軟件處理數(shù)據(jù)后，計(jì)算得出兩者的平衡解離常數(shù)(kd)，結(jié)果如圖6a和圖6b所示。

3.5rank-n的體內(nèi)功能

功能性rank-n可以減弱病人來(lái)源結(jié)直腸癌的體內(nèi)生長(zhǎng)，抑制彌漫型大b細(xì)胞淋巴瘤的體外生長(zhǎng)和存活

利用已經(jīng)建成的穩(wěn)定的病人來(lái)源的結(jié)腸腫瘤塊移植模型(pdx)系統(tǒng)，用rank-n進(jìn)行處理(腹腔注射，兩天一次，10mg/kg)，2個(gè)月后觀察結(jié)直腸癌的體內(nèi)生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)rank-n處理組腫瘤無(wú)論是質(zhì)量和體積都顯著小于對(duì)照組(圖7a-c)。因此rank-n是可以阻斷腸癌腫瘤體內(nèi)生長(zhǎng)。

為了探索rank-n抑制結(jié)直腸癌pdx腫瘤體內(nèi)生長(zhǎng)的機(jī)制，我們檢測(cè)了兩組腫瘤中與腫瘤生長(zhǎng)密切相關(guān)的分子表達(dá)情況。首先，我們檢測(cè)發(fā)現(xiàn)p52在rank-n作用后是減少的，同時(shí)traf3的降解被抑制，共同證明了rank蛋白在體能阻斷rank激活的非經(jīng)典信號(hào)。接下來(lái)我們檢測(cè)了cmyc、stat3、p-stat3，發(fā)現(xiàn)p-stat3、stat3、cmyc在rank-n處理后均比對(duì)照組減少，說(shuō)明rank-n可能是通過(guò)對(duì)p-stat3、cmyc的下調(diào)，抑制結(jié)直腸癌的體內(nèi)生長(zhǎng)(圖7d)。

參見圖8a和圖8b，示出了rank-n可以抑制彌漫型大b細(xì)胞淋巴瘤(dlbcl)腫瘤細(xì)胞存活：圖8a為病人來(lái)源的dlbcl細(xì)胞(pdc)體外不加入和加入骨髓來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞(bmsc)以及加入和不加入cd40-n后培養(yǎng)后，進(jìn)行流式檢測(cè)細(xì)胞死亡(7aad+annexinv雙染色)的結(jié)果(左上角圖為不加入bmsc和cd40-n，左下角圖加入bmsc，右上角圖加入cd40-n,右下角圖加入bmsc和cd40-n)；圖8b是圖8a的量化結(jié)果，cd40-n為1，10μg/ml。(至少三次實(shí)驗(yàn)重復(fù)，**p<0.01。)結(jié)果顯示rank-n能抑制dlbcl腫瘤細(xì)胞的存活。

4.討論和結(jié)論

rankl/rank/opg系統(tǒng)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的在破骨細(xì)胞分化過(guò)程中具有非常重要作用的信號(hào)傳導(dǎo)通路。成骨細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞及活化的t淋巴細(xì)胞表達(dá)rankl與破骨細(xì)胞表面的rank結(jié)合后促使破骨細(xì)胞分化增殖。研究發(fā)現(xiàn)，rankl–rank–opg通過(guò)作用于dc影響免疫，也可以通過(guò)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞影響骨生成穩(wěn)態(tài)。研究表明rankl–rank–opg系統(tǒng)在骨疾病、自身免疫性疾病、器官形成、以及癌癥和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病環(huán)境中發(fā)揮重要作用。在生理狀態(tài)下t細(xì)胞分泌的rankl在調(diào)節(jié)性t細(xì)胞調(diào)控的免疫耐受中發(fā)揮著重要作用，研究發(fā)現(xiàn)rank可促使胸腺髓質(zhì)上皮細(xì)胞分化和增殖，參與中樞免疫耐受的建立^[87]。同時(shí)，高水平的rankl與一些自身免疫性疾病中如2型糖尿病(t2dm)及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的疾病風(fēng)險(xiǎn)正相關(guān)。此外，某些腫瘤細(xì)胞可直接產(chǎn)生的rankl或rank，rankl/rank也可以通過(guò)激活休眠狀態(tài)的腫瘤微小病灶，進(jìn)而直接促進(jìn)骨腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活及轉(zhuǎn)移^[88]。rankl/rank系統(tǒng)已成為骨科學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)、風(fēng)濕病學(xué)、免疫學(xué)等眾多領(lǐng)域中的最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。針對(duì)rankl作為治療靶點(diǎn)已成為藥物研究的主要方向。

rankl阻斷劑主要有fc-opg、opg-fc、rank-fc、抗人rankl抗體，現(xiàn)均已很好的應(yīng)用于前期臨床及iii期臨床研究。其中opg可以結(jié)合trail起到活化腫瘤的作用，現(xiàn)已被舍棄。鑒于鼠源性單克隆抗體的多次給藥易出現(xiàn)人抗鼠抗體的情況，人源單克隆抗體是進(jìn)行臨床治療的主要發(fā)展趨勢(shì)。目前，抗人rankl抗體(denosumlab)已應(yīng)用于iii期臨床，它被美國(guó)fda批準(zhǔn)主要用于治療和預(yù)防絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥及乳腺癌和前列腺癌等實(shí)體瘤的骨轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的骨相關(guān)疾病。通過(guò)阻斷rankl，denosumlab抑制破骨細(xì)胞的功能以及同時(shí)阻止骨形成與骨吸收，有效的降低了骨折發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。

本次研究中采用了rank的胞外端部分(rank-n)結(jié)合rankl而不向下游傳遞信號(hào)這樣一個(gè)新的策略阻斷rankl-rank信號(hào)通路。本次研究構(gòu)建了rank-n巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，選擇巴斯德畢赤酵母這樣一個(gè)表達(dá)系統(tǒng)是因?yàn)樗染哂性讼到y(tǒng)易于操作，可以以較低成本獲得大量蛋白，又具有真核表達(dá)系統(tǒng)的翻譯后修飾更有可能獲得功能活性的蛋白。研究中首先對(duì)密碼子進(jìn)行巴斯德畢赤酵母優(yōu)化，隨后進(jìn)行rank-ppic9k-gs115工程菌的篩選，獲得了在6mg/lg418的板子上生長(zhǎng)的菌株。有些研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)增加篩選抗生素濃度及對(duì)密碼子進(jìn)行巴斯德畢赤酵母優(yōu)化可有效的增加外源蛋白的表達(dá)量^[8]。但在我們實(shí)驗(yàn)中當(dāng)遺傳霉素g418濃度增加到4mg/l、6mg/l時(shí)，兩者的外源蛋白表達(dá)水平并沒(méi)有明顯差異(圖2e)。這可能與蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和折疊效率低有關(guān)^[83]，也可能是因?yàn)間418篩選濃度和蛋白表達(dá)不一定完全線性相關(guān)。

rank-ppic9k-gs115工程菌(mus⁺strain，甲醇利用慢型)在實(shí)驗(yàn)室搖瓶中采用1/5搖瓶體積的培養(yǎng)體系，每12小時(shí)1％甲醇添加量的誘導(dǎo)表達(dá)條件實(shí)現(xiàn)了高效與穩(wěn)定的表達(dá)，蛋白表達(dá)量>30mg/l，為下一步大規(guī)模表達(dá)純化工作奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

在建立5l大規(guī)模發(fā)酵中試研究中，并沒(méi)有獲得高表達(dá)目的蛋白的菌液上清。通過(guò)mm與md平板鑒定發(fā)現(xiàn)表達(dá)菌株為甲醇利用慢型酵母菌(圖3a)。在發(fā)酵實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)od值增加不明顯，目的蛋白表達(dá)不高的問(wèn)題。嘗試了改變ph、降低誘導(dǎo)溫度、延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間、增加溶氧量、調(diào)整初始誘導(dǎo)時(shí)的甲醇速率等方法均收效甚微。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)雖然甲醇利用慢型菌株可以獲得更高的外源蛋白表達(dá)量，但過(guò)渡轉(zhuǎn)換過(guò)程中饑餓培養(yǎng)造成的菌體死亡也會(huì)更加影響菌株靶蛋白的表達(dá)^[84,85]。另外，鑒于在搖瓶中目的蛋白高表達(dá)而在高密度發(fā)酵中低表達(dá)的現(xiàn)象，首先應(yīng)考慮小分子蛋白的穩(wěn)定性不高易于降解的問(wèn)題。特別是在高密度發(fā)酵中菌體密度較大，蛋白酶分泌會(huì)增加，極易造成對(duì)目的蛋白的降解。而出現(xiàn)搖瓶中目的蛋白高表達(dá)的原因可能為搖瓶表達(dá)時(shí)菌密度不高，進(jìn)而分泌的蛋白酶累積量也不高；其次，搖瓶培養(yǎng)基中含有氮源可部分消除蛋白酶對(duì)自身蛋白的氮降解。相應(yīng)的優(yōu)化策略有：首先考慮在誘導(dǎo)過(guò)程中加入絲氨酸和天冬氨酸型蛋白酶抑制劑pmsf、edta、使用富含氨基酸和抗氧化劑的培養(yǎng)基、與rshpi-1a蛋白酶抑制劑的共表達(dá)抑制蛋白酶降解的方法；或者使用smd1163、smd1165、smd1168蛋白酶缺陷菌株、對(duì)目的蛋白本身的蛋白酶降解位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變^[38-40]。這些都是在將來(lái)發(fā)酵研究中需要優(yōu)化的地方。

與許多tnfrsf成員類似，rank是一個(gè)糖基化蛋白，rank胞外段有3個(gè)n-糖基化位點(diǎn)(asn、ser、thr)^[3]，而酵母中糖基化修飾與人不同，rank胞外段糖基化位點(diǎn)是否影響其在酵母中表達(dá)和功能還需進(jìn)一步研究。

超濾-sephadexg-50凝膠過(guò)濾層析-qsepharoseff陰離子交換層析三步法純化是一個(gè)簡(jiǎn)單可線性化放大高效的純化方案。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中還需要進(jìn)一步提高蛋白純度，如改換新的純化緩沖體系、利用陰陽(yáng)離子交換純化等；同時(shí)應(yīng)增強(qiáng)目的蛋白與陰離子交換柱的結(jié)合力以減少純化中的蛋白損失提高得率。

我們?cè)诩?xì)胞水平證明了我們純化獲得的rank-n是具有阻斷人rankl結(jié)合rank的活性，并且我們利用biacore-t100系統(tǒng)對(duì)rank-n與人rankl進(jìn)行了蛋白質(zhì)相互作用分析，測(cè)定兩者的親和解離常數(shù)kd為2.624e-6m，進(jìn)一步證明了rank-n是可以高親和力結(jié)合人rankl的。我們利用pdx結(jié)直腸癌小鼠移植瘤模型驗(yàn)證了rank-n能夠抑制結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)，進(jìn)一步說(shuō)明我們純化的rank-n蛋白在體內(nèi)也是有功能的。這些實(shí)驗(yàn)提示阻斷rank信號(hào)不僅可以治療骨相關(guān)疾病，還可能直接抑制結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，這是之前沒(méi)有報(bào)道過(guò)的。實(shí)驗(yàn)表明我們的rank-n蛋白具有很廣的臨床應(yīng)用前景。目前實(shí)驗(yàn)還需要進(jìn)一步的完善：1.rank-n治療體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。2.建立大規(guī)模發(fā)酵中試研究的方法，摸索最適發(fā)酵條件實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。3.利用pdxdlbcl小鼠移植瘤模型及急性腸炎模型驗(yàn)證體內(nèi)功能并進(jìn)行機(jī)制研究。

在本發(fā)明中，采用巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)出人源rank-n胞外段蛋白。本發(fā)明建立簡(jiǎn)單而有效的純化方案，獲得純度>95％的人源rank胞外段蛋白，并對(duì)其生物活性進(jìn)行一系列體外體內(nèi)實(shí)驗(yàn)評(píng)估，發(fā)現(xiàn)了rank-n可以在體外抑制破骨細(xì)胞的分化，從而抑制骨質(zhì)疏松；體外抑制彌漫型大b細(xì)胞淋巴瘤的存活和生長(zhǎng)；體內(nèi)抑制結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)。人源rank-n胞外段蛋白經(jīng)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明，具有直接抑制破骨細(xì)胞分化，抗腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，可能用于骨質(zhì)疏松治療，各種腫瘤生物治療，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，以上實(shí)施例僅是示例性實(shí)施例，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以進(jìn)行多種變化、替換以及改變。

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核苷酸序列表

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