本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物有機合成和結(jié)構修飾技術領域，具體涉及一種瑪咖素a衍生物(i和ii)的合成制備方法和應用。

背景技術：

瑪咖(lepidiummeyeniiwalp)，為十字花科獨行菜屬1~2年生草本植物，原產(chǎn)海拔3500~4500m的南美安第斯山區(qū)，為當?shù)爻Ｓ玫乃幱弥参镆约笆秤貌牧希赜小懊佤斎藚ⅰ钡拿雷u；我國于1990年初引種，其中云南麗江香格里拉地區(qū)為主要種植地區(qū)，種植規(guī)模不斷擴大，針對該植物的化學成分和生物活性研究發(fā)現(xiàn)，該植物中含有一種具有新穎的六氫咪唑[1,5-c]噻唑類生物堿(+)-瑪咖素a，且該化合物表現(xiàn)了一定的細胞毒活性，提示該成分可能是瑪咖作為藥食兩用植物的主要活性成分之一；為了進一步挖掘該分子的化學和生物空間，本專利對(+)-瑪咖素a及其衍生物進行了有機合成研究，首次完成了(+)-瑪咖素a的全合成及其結(jié)構修飾研究。

本發(fā)明通過醛與氨（巰）基的縮合反應和edman降解反應而得到各種不同側(cè)鏈取代的瑪咖素a的合成類衍生物(i和ii)，并發(fā)現(xiàn)部分化合物表現(xiàn)了較好的細胞毒作用；由于本發(fā)明的先導化合物瑪咖素a來源于安全健康的藥食兩用植物，其活性衍生物可作為抗癌藥物的先導性化合物，具有一定的研究價值和應用前景。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的是闡述和提供一種瑪咖素a的合成類衍生物(i和ii)；第二目的在于提供所述的瑪咖素a的合成類衍生物(i和ii)的制備方法；第三目的在于提供所述的瑪咖素a的合成類衍生物(i和ii)在制備抗癌藥物中的應用。

本發(fā)明的第一目的是這樣實現(xiàn)的，所述的瑪咖素a的合成類衍生物(i和ii)，英文名為meyeniinaderivatives，該類化合物是以從藥用植物瑪咖中分離得到的新穎天然生物堿meyeniina為模板，以前體半胱氨酸為起始原料，通過兩步化學反應合成得到的一系列人工類似物，其基本結(jié)構特點是由一個六氫咪唑[1,5-c]噻唑母核和一個不同取代基的芐基取代基組成，其側(cè)鏈取代基上不同取代基決定了這類化合物的多樣性;部分化合物i-1~ii-12的結(jié)構式為：

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本發(fā)明的第二目的是這樣實現(xiàn)的，所述的瑪咖素a衍生物的制備方法，其特點是：所述制備方法是以前體半胱氨酸為起始原料，通過醛與氨（巰）基的縮合反應生成噻唑中間體(a)，進一步與各種異硫氰酸酯發(fā)生edman降解反應(b)而得到各種不同側(cè)鏈取代的瑪咖素a的合成類衍生物(i和ii)。具體為：

（a）醛與氨（巰）基的縮合反應生成噻唑中間體(a)：l或d型半胱氨酸(0.12~12g,1.0~100.0mmol)溶解在4~400ml的1:1的甲醇水溶液中，充分攪拌溶解后，加入醋酸鉀(0.118~11.8g,1.2~120.0mmol)，攪拌10分鐘后，再加入甲醛(0.066~6.6g,1.50~150.0mmol)，用氮氣保護，室溫反應2~10小時。反應液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至1/5溶劑，減壓抽濾后用5~500ml甲醇洗滌3次，真空干燥箱中干燥1~12小時，得白色不容物(0.135~13.5g,70~95%)，一維和二維核磁共振鑒定化合物為中間體a。

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（b）edman降解反應(b)制備不同側(cè)鏈取代的瑪咖素a的合成類衍生物(i和ii)：a步驟所得的中間體a(14.7~1470mg,0.1~10.0mmol)和不同的異硫氰酸酯(0.12~12mmol)溶解在1~100ml吡啶中，用氮氣保護，室溫反應12小時，點板檢測原料消失，用1m稀酸溶液調(diào)節(jié)ph小于3，用等體積有機溶劑萃取3~5次，合并濾液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮樣品，真空干燥箱中干燥1~12小時，各種純化手段得到白色或者黃色油狀物(0.082~8.2mmol)，一維和二維核磁共振鑒定化合物為不同側(cè)鏈取代的瑪咖素a的合成類衍生物(i和ii)。

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本發(fā)明的第三目的是這樣實現(xiàn)的，所述的瑪咖素a的合成類衍生物(i和ii)在制備抗腫瘤藥物中的應用。其代表性化合物如下所示：

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以瑪咖素a的合成類衍生物(i和ii)為原料，進行五株細胞株體外抗腫瘤活性評價，分別為早幼細胞(hl-60)、肺癌細胞(a549)、人神經(jīng)母細胞瘤細胞(shsy5y)、前列腺癌細胞(pc3)和乳腺癌細胞(mcf7)，部分化合物對不同細胞株具有較好的細胞毒活性，ic50值分別的范圍從2.5~35.5μm。以上結(jié)果揭示了本發(fā)明的化合物在制備抗癌藥物、功能食品、保健品中有良好的潛力。

附圖說明

圖1i-1的dept譜。

圖2ii-1的dept譜。

圖3i-2的dept譜。

圖4ii-2的dept譜。

圖5i-3的dept譜。

圖6ii-3的dept譜。

圖7i-1的cd譜。

圖8ii-1的cd譜。

圖9i-2的cd譜。

圖10ii-2的cd譜。

圖11i-3的cd譜。

圖12ii-3的cd譜。

圖13瑪咖素a的¹h和¹³cnmr數(shù)據(jù)以及hmbc相關（溶劑cdcl3）(100and400mhz)。

圖14i-2和ii-2的¹h和¹³cnmr數(shù)據(jù)以及hmbc相關（溶劑cdcl3）(100and400mhz)。

圖15i-3和ii-3的¹h和¹³cnmr數(shù)據(jù)以及hmbc相關（溶劑cdcl3）(100and400mhz)。

圖16瑪咖素a的合成類衍生物(i和ii)的細胞毒活性。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的說明，但不以任何方式對本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明教導所作的任何變換或改進，均落入本發(fā)明的保護范圍。

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的說明，但不以任何方式對本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明教導所作的任何變換或改進，均落入本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明所述的瑪咖素a的合成類衍生物(i和ii)，英文名為meyeniinaderivatives，該類化合物是以從藥用植物瑪咖中分離得到的新穎天然生物堿meyeniina為模板，以前體半胱氨酸為起始原料，通過兩步化學反應合成得到的一系列人工類似物，其基本結(jié)構特點是由一個六氫咪唑[1,5-c]噻唑母核和一個不同取代基的芐基取代基組成，其側(cè)鏈取代基上不同取代基決定了這類化合物的多樣性。部分化合物i-1~ii-12的結(jié)構式為：

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本發(fā)明所述的瑪咖素a衍生物的制備方法，其特點是：所述制備方法是以前體半胱氨酸為起始原料，通過醛與氨（巰）基的縮合反應生成噻唑中間體(a)，進一步與各種異硫氰酸酯發(fā)生edman降解反應(b)而得到各種不同側(cè)鏈取代的瑪咖素a的合成類衍生物(i和ii)。具體為：

（a）醛與氨（巰）基的縮合反應生成噻唑中間體(a)：l或d型半胱氨酸(0.12~12g,1.0~100.0mmol)溶解在4~400ml的1:1的甲醇水溶液中，充分攪拌溶解后，加入醋酸鉀(0.118~11.8g,1.2~120.0mmol)，攪拌10分鐘后，再加入甲醛(0.066~6.6g,1.50~150.0mmol)，用氮氣保護，室溫反應2~10小時。反應液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至1/5溶劑，減壓抽濾后用5~500ml甲醇洗滌3次，真空干燥箱中干燥1~12小時，得白色不容物(0.135~13.5g,70~95%)，一維和二維核磁共振鑒定化合物為中間體a。

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（b）edman降解反應(b)制備不同側(cè)鏈取代的瑪咖素a的合成類衍生物(i和ii)：a步驟所得的中間體a(14.7~1470mg,0.1~10.0mmol)和不同的異硫氰酸酯(0.12~12mmol)溶解在1~100ml吡啶中，用氮氣保護，室溫反應12小時，點板檢測原料消失，用1m稀酸溶液調(diào)節(jié)ph小于3，用等體積有機溶劑萃取3~5次，合并濾液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮樣品，真空干燥箱中干燥1~12小時，各種純化手段得到白色或者黃色油狀物(0.082~8.2mmol)，一維和二維核磁共振鑒定化合物為不同側(cè)鏈取代的瑪咖素a的合成類衍生物(i和ii)。

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本發(fā)明所述的瑪咖素a的合成類衍生物(i和ii)在制備抗腫瘤藥物中的應用。其代表性化合物如下所示：

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以瑪咖素a的合成類衍生物(i和ii)為原料，進行五株細胞株體外抗腫瘤活性評價，分別為早幼細胞(hl-60)、肺癌細胞(a549)、人神經(jīng)母細胞瘤細胞(shsy5y)、前列腺癌細胞(pc3)和乳腺癌細胞(mcf7)，部分化合物對不同細胞株具有較好的細胞毒活性，ic50值分別的范圍從2.5~35.5μm。以上結(jié)果揭示了本發(fā)明的化合物在制備抗癌藥物、功能食品、保健品中有良好的潛力。

實施例1

以前體半胱氨酸為起始原料，通過醛與氨（巰）基的縮合反應生成噻唑中間體(a)，進一步與異硫氰酸酯發(fā)生edman降解反應(b)而得到瑪咖素a(i-1和ii-1)。

（a）醛與氨（巰）基的縮合反應生成噻唑中間體(a)：l或d型半胱氨酸(1.21g,10.0mmol)溶解在40ml的1:1的甲醇水溶液中，充分攪拌溶解后，加入醋酸鉀(1.18g,12.0mmol)，攪拌10分鐘后，再加入甲醛(0.66g,15.0mmol)，用氮氣保護，室溫反應3小時。反應液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至1/5溶劑，減壓抽濾后用50ml甲醇洗滌3次，真空干燥箱中干燥1~12小時，得白色不容物(1.35g,9.2mmol,92%)，一維和二維核磁共振鑒定化合物為中間體a。

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（b）edman降解反應(b)制備瑪咖素a(i-1和ii-1)：a步驟所得的中間體a(147mg,1.0mmol)和3,4-(methylenedioxy)-異硫氰酸酯(1.2mmol)溶解在10ml吡啶中，用氮氣保護，室溫反應12小時，點板檢測原料消失，用1m稀酸溶液調(diào)節(jié)ph小于3，用等體積有機溶劑萃取3~5次，合并濾液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮樣品，真空干燥箱中干燥1~12小時，各種純化手段得到白色或者黃色油狀物(264mg,0.82mmol,82%)，一維和二維核磁共振鑒定化合物為瑪咖素a(i-1和ii-1)。

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實施例2

以前體半胱氨酸為起始原料，通過醛與氨（巰）基的縮合反應生成噻唑中間體(a)，進一步與異硫氰酸酯發(fā)生edman降解反應(b)而得到i-2和ii-2。

（a）醛與氨（巰）基的縮合反應生成噻唑中間體(a)：l或d型半胱氨酸(0.121g,1.0mmol)溶解在5ml的1:1的甲醇水溶液中，充分攪拌溶解后，加入醋酸鉀(0.118g,1.2mmol)，攪拌10分鐘后，再加入甲醛(0.066g,1.5mmol)，用氮氣保護，室溫反應5小時。反應液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至1/5溶劑，減壓抽濾后用10ml甲醇洗滌3次，真空干燥箱中干燥1~12小時，得白色不容物(0.135g,0.8mmol,80%)，一維和二維核磁共振鑒定化合物為中間體a。

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（b）edman降解反應(b)制備i-2和ii-2：a步驟所得的中間體a(147mg,1.0mmol)和異硫氰酸酯(1.2mmol)溶解在10ml吡啶中，用氮氣保護，室溫反應12小時，點板檢測原料消失，用1m稀酸溶液調(diào)節(jié)ph小于3，用等體積有機溶劑萃取3~5次，合并濾液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮樣品，真空干燥箱中干燥1~12小時，各種純化手段得到白色或者黃色油狀物(227mg,0.82mmol,82%)，一維和二維核磁共振鑒定化合物為i-2和ii-2。

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實施例3

以前體半胱氨酸為起始原料，通過醛與氨（巰）基的縮合反應生成噻唑中間體(a)，進一步與異硫氰酸酯發(fā)生edman降解反應(b)而得到i-3和ii-3。

（a）醛與氨（巰）基的縮合反應生成噻唑中間體(a)：l或d型半胱氨酸(0.121g,1.0mmol)溶解在5ml的1:1的甲醇水溶液中，充分攪拌溶解后，加入醋酸鉀(0.118g,1.2mmol)，攪拌10分鐘后，再加入甲醛(0.066g,1.5mmol)，用氮氣保護，室溫反應5小時。反應液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至1/5溶劑，減壓抽濾后用10ml甲醇洗滌3次，真空干燥箱中干燥1~12小時，得白色不容物(0.135g,0.8mmol,80%)，一維和二維核磁共振鑒定化合物為中間體a。

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（b）edman降解反應(b)制備i-3和ii-3：a步驟所得的中間體a(147mg,1.0mmol)和3-甲氧基-異硫氰酸酯(1.2mmol)溶解在10ml吡啶中，用氮氣保護，室溫反應12小時，點板檢測原料消失，用1m稀酸溶液調(diào)節(jié)ph小于3，用等體積有機溶劑萃取3~5次，合并濾液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮樣品，真空干燥箱中干燥1~12小時，各種純化手段得到白色或者黃色油狀物(246mg,0.8mmol,80%)，一維和二維核磁共振鑒定化合物為i-3和ii-3。

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實例4

取實施例1制備的瑪咖素a(i-1和ii-1)，為無色粉末；測定方法為：用核磁共振，結(jié)合其它波譜技術鑒定結(jié)構：

（1）紫外光譜（溶劑為甲醇）：276(0.246),241(0.190),203(0.548)nm;

（2）紅外光譜（溴化鉀壓片）：3682,3430,3068,2969,2924,2855,2779,2046,1852,1748,1444,1037cm^-1；

（3）hresims顯示本發(fā)明化合物準分子離子峰m/z323.0520[m+h]⁺（計算值為323.0519forc14h15n2o3s2），結(jié)合¹³c和¹hnmr譜（圖1和圖2，碳譜氫譜數(shù)據(jù)歸屬見圖13）給出其分子式為c14h14n2o3s2；¹hnmr（cdcl3，400mhz）和¹³cnmr（cdcl3，100mhz）數(shù)據(jù)，見圖13。

實例5

取實施例2制備的i-2和ii-2，為無色粉末或者油狀物；測定方法為：用核磁共振，結(jié)合其它波譜技術鑒定結(jié)構：

（1）紫外光譜（溶劑為甲醇）：274(0.451),246(0.315),204(0.458)nm；

（2）紅外光譜（溴化鉀壓片）：3427,3108,3062,2974,2926,2582,1956,1856,1751,1425,938,701cm^-1；

（3）hresims顯示本發(fā)明化合物準分子離子峰m/z279.0627[m+h]⁺（計算值為279.0620forc13h14n2os2），結(jié)合¹³c和¹hnmr譜（圖1和圖2，碳譜氫譜數(shù)據(jù)歸屬見圖14）給出其分子式為c13h14n2os2；¹hnmr（cdcl3，400mhz）和¹³cnmr（cdcl3，100mhz）數(shù)據(jù)，見圖14。

實例6

取實施例3制備的i-3和ii-3，為無色粉末或者油狀物；測定方法為：用核磁共振，結(jié)合其它波譜技術鑒定結(jié)構：

（1）紫外光譜（溶劑為甲醇）：201(0.319),216(0.186),245(0.128)nm;

（2）紅外光譜（溴化鉀壓片）：3679,3427,3054,2925,2854,1749,1604,1424,1341,1267,1158,1042cm^-1；

（3）hresims顯示本發(fā)明化合物準分子離子峰m/z309.0729[m+h]⁺（計算值為309.0726forc14h16n2o2s2），結(jié)合¹³c和¹hnmr譜（圖1和圖2，碳譜氫譜數(shù)據(jù)歸屬見圖15）給出其分子式為c14h16n2o2s2；¹hnmr（cdcl3，400mhz）和¹³cnmr（cdcl3，100mhz）數(shù)據(jù)，見圖15。

實施例7

取實施例1制備的瑪咖生物堿(+)-瑪咖素a，分別按實施例4中的方法進行結(jié)構測定，所得的(+)-瑪咖素a進行體外抗腫瘤活性測試，試驗情況如下：

五株細胞株分別為早幼細胞(hl-60)、肺癌細胞(a549)、人神經(jīng)母細胞瘤細胞(shsy5y)、前列腺癌細胞(pc3)和乳腺癌細胞(mcf7)，均由中國科學院上海藥物研究所提供；

以上細胞與不同濃度化合物溫育72小時，每株細胞的實驗均重復一次，用兩次實驗的結(jié)果進行數(shù)據(jù)處理，采用改良mtt法評價化合物對細胞增殖的抑制程度，計算抑制率，根據(jù)抑制率采用logit方法計算ic50，比較化合物的體外抗腫瘤活性；

細胞的增殖抑制率=(空白對照od值-加藥孔的od值)/空白對照od值×100%；

方法為改良mtt法，具體方法為：

取對數(shù)生長期的懸浮細胞，將細胞濃度調(diào)整為4×10⁴/ml，加入96孔培養(yǎng)板，90μl/孔；陽性對照為順鉑，用生理鹽水溶解；每孔分別加入10μl不同濃度的樣品(1號試液-5號試液)；加樣組及對照組均設4個復孔，加樣組、陽性對照組的高濃度組還設培養(yǎng)基的加藥平行孔，每塊板均設有4個空白對照孔(僅加培養(yǎng)基)；樣品的終濃度分別為10^-2、10^-1、1、10及10²μg/ml，相應dmso的終濃度分別為0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%、0.00001%；樣品在終濃度10²μg/ml時，用0.1%dmso作為溶劑對照，其余濃度均用生理鹽水作陰性對照；陽性對照藥順鉑的終濃度為10^-1、1、10μg/ml。細胞在37攝氏度，5%co2培養(yǎng)箱中分別孵育48小時后，加入mtt(5mg/ml,sigma)，10μl/孔；繼續(xù)培養(yǎng)4小時后，加入三聯(lián)液[10%sds-5%異丁醇-0.012mol/lhcl(w/v/v)]，100μl/孔，放置過夜后用酶標儀在570nm、630nm雙波長下測定各孔的od值；

實驗結(jié)果表明：經(jīng)對早幼hl-60細胞、肺腺癌a549細胞、人骨髓神經(jīng)母細胞瘤shsy5y細胞、人前列腺癌pc3細胞、人乳腺癌mcf7細胞的細胞毒活性實驗，其對hl-60、a549和mcf7細胞株具有較好的細胞毒活性，ic50值分別達14.41、32.22和33.14μm，對其它兩株細胞活性較弱。

實施例8

類似實例1~3的方法制備所得的不同側(cè)鏈取代的瑪咖素a的合成類衍生物(i和ii)進行體外抗腫瘤活性測試，試驗情況如下：

五株細胞株分別為早幼細胞(hl-60)、肺癌細胞(a549)、人神經(jīng)母細胞瘤細胞(shsy5y)、前列腺癌細胞(pc3)和乳腺癌細胞(mcf7)，均由中國科學院上海藥物研究所提供；

以上細胞與不同濃度化合物溫育72小時，每株細胞的實驗均重復一次，用兩次實驗的結(jié)果進行數(shù)據(jù)處理，采用改良mtt法評價化合物對細胞增殖的抑制程度，計算抑制率，根據(jù)抑制率采用logit方法計算ic50，比較化合物的體外抗腫瘤活性；

細胞的增殖抑制率=(空白對照od值-加藥孔的od值)/空白對照od值×100%；

方法為改良mtt法，具體方法為：

取對數(shù)生長期的懸浮細胞，將細胞濃度調(diào)整為4×10⁴/ml，加入96孔培養(yǎng)板，90μl/孔；陽性對照為順鉑，用生理鹽水溶解；每孔分別加入10μl不同濃度的樣品(1號試液-5號試液)；加樣組及對照組均設4個復孔，加樣組、陽性對照組的高濃度組還設培養(yǎng)基的加藥平行孔，每塊板均設有4個空白對照孔(僅加培養(yǎng)基)；樣品的終濃度分別為10^-2、10^-1、1、10及10²μg/ml，相應dmso的終濃度分別為0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%、0.00001%；樣品在終濃度10²μg/ml時，用0.1%dmso作為溶劑對照，其余濃度均用生理鹽水作陰性對照；陽性對照藥順鉑的終濃度為10^-1、1、10μg/ml；細胞在37攝氏度，5%co2培養(yǎng)箱中分別孵育48小時后，加入mtt(5mg/ml,sigma)，10μl/孔；繼續(xù)培養(yǎng)4小時后，加入三聯(lián)液[10%sds-5%異丁醇-0.012mol/lhcl(w/v/v)]，100μl/孔，放置過夜后用酶標儀在570nm、630nm雙波長下測定各孔的od值；結(jié)果圖16所示。