本發(fā)明屬于大鼠模型構(gòu)建領(lǐng)域，具體涉及一種免疫缺陷大鼠模型的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

動(dòng)物模型主要用于實(shí)驗(yàn)生理學(xué)、實(shí)驗(yàn)病理學(xué)和實(shí)驗(yàn)治療學(xué)(包括新藥篩選)研究。人類疾病的發(fā)展十分復(fù)雜，以人本身作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象來(lái)深入探討疾病發(fā)生機(jī)制，推動(dòng)醫(yī)藥學(xué)的發(fā)展來(lái)之緩慢，臨床積累的經(jīng)驗(yàn)不僅在時(shí)間和空間上都存在局限性，而且許多實(shí)驗(yàn)在道義上和方法上也受到限制。而借助于動(dòng)物模型的間接研究，可以有意識(shí)地改變那些在自然條件下不可能或不易排除的因素，以便更準(zhǔn)確地觀察模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并與人類疾病進(jìn)行比較研究，有助于更方便、更有效地研究人類疾病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律，研究防治措施。免疫缺陷動(dòng)物模型可用于藥物開(kāi)發(fā)、移植研究以及人類疾病的治療機(jī)理研究。目前，常用的免疫缺陷動(dòng)物模型多為小鼠，而大鼠與人類的同源性更接近，所以使用大鼠模型比小鼠模型研究人類相關(guān)疾病具有明顯的優(yōu)勢(shì)。衡量機(jī)體免疫缺陷的程度，主要測(cè)量機(jī)體內(nèi)T、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞所占的比例。日本學(xué)者Tomoji等人(Mashimo T,Takizawa A,et al:Generation and characterization of severe combined immunodeficiency rats.Cell reports 2012,2:685-694.、Mashimo T,Takizawa A,et al:Generation of knockout rats with X-linked severe combined immunodeficiency(X-SCID)using zinc-finger nucleases.PloS one 2010,5:e8870.)用Zinc-Finger技術(shù)得到IL2Rγ和Prkdc基因敲除的大鼠，并證實(shí)IL2Rγ純合敲除大鼠外周血、骨髓和脾臟中T細(xì)胞明顯減少，B細(xì)胞和NK細(xì)胞在外周血和骨髓中消失，僅在脾臟中有一些殘留； Prkdc基因敲除的大鼠CD4^-CD8⁺、CD4⁺CD8^-和CD4⁺CD8⁺T細(xì)胞全部消失，B細(xì)胞也明顯消失，而NK細(xì)胞數(shù)量增加；兩個(gè)基因同時(shí)敲除的大鼠，T、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞全部消失。但是，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)中的免疫缺陷大鼠模型至少存在如下的問(wèn)題：在Prkdc和IL2Rγ同時(shí)敲除的大鼠模型上移植人的CD34+造血干細(xì)胞，卻并沒(méi)有產(chǎn)生人的免疫系統(tǒng)細(xì)胞。

因此，現(xiàn)有的免疫缺陷動(dòng)物模型還不能滿足藥物試驗(yàn)和異種細(xì)胞移植研究等的需求，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種新的免疫缺陷大鼠模型，填補(bǔ)了免疫缺陷大鼠模型品系空缺，能夠符合試驗(yàn)需求。

第一方面，提供了一種免疫缺陷大鼠模型的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

(1)將針對(duì)大鼠DNA的Prkdc和IL2Rγ基因敲除的gRNA分別進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，再分別與體外轉(zhuǎn)錄的CAS9蛋白mRNA混合，凍存于無(wú)RNA酶的超純水中，得到相應(yīng)的注射液A及注射液B；

(2)將人SIRPa基因組DNA擴(kuò)增，純化，凍存于無(wú)RNA酶的超純水中，得到注射液C；

(3)采用顯微注射法將注射液A和注射液B分別注射進(jìn)不同的大鼠受精卵的胞質(zhì)中，然后將大鼠受精卵分別移植入不同假孕雌鼠體內(nèi)，培育得到第二代大鼠A和第二代大鼠B；

(4)采用顯微注射法將注射液C注射進(jìn)大鼠受精卵的原核中，然后將大鼠受精卵移植入假孕雌鼠體內(nèi)，培育得到第二代大鼠C；

(5)將第二代大鼠A、第二代大鼠B和第二代大鼠C進(jìn)行雜交，繁殖F1代；再將F1代進(jìn)行雜交，得到敲除了IL2Rγ和Prkdc基因并轉(zhuǎn)入了人SIRPa基因的免疫缺陷大鼠模型。

結(jié)合第一方面，在第一方面的一種可能的實(shí)現(xiàn)方式中，步驟(1)中的敲除大鼠Prkdc基因采用兩條gRNA序列，分別為：第一外顯子gRNA序 列1：TTCCGGCACTATGGCGGACC；第一外顯子gRNA序列2：GCCAGTTACCAGCTGATCCG。

結(jié)合第一方面或上述某些可能的實(shí)施方式，在第一方面的一種可能的實(shí)現(xiàn)方式中，步驟(1)中的敲除大鼠IL2Rγ基因采用兩條gRNA序列，分別為：第二外顯子gRNA序列1：CAGCCGACCAACCTCACTAT；第四外顯子gRNA序列2：GAGTGAATCTCAGGTAGAAC。

結(jié)合第一方面或上述某些可能的實(shí)施方式，在第一方面的一種可能的實(shí)現(xiàn)方式中，敲除大鼠IL2Rγ基因還采用另外兩條gRNA序列，分別為：第二外顯子gRNA序列1：CAGCCGACCAACCTCACTAT；第四外顯子gRNA序列3：GAGCAACCGAGATCGAAGCT。

結(jié)合第一方面或上述某些可能的實(shí)施方式，在第一方面的一種可能的實(shí)現(xiàn)方式中，體外轉(zhuǎn)錄CAS9蛋白mRNA采用T7轉(zhuǎn)錄試劑盒、T3轉(zhuǎn)錄試劑盒或SP6轉(zhuǎn)錄試劑盒。

結(jié)合第一方面或上述某些可能的實(shí)施方式，在第一方面的一種可能的實(shí)現(xiàn)方式中，體外轉(zhuǎn)錄CAS9蛋白mRNA采用T7轉(zhuǎn)錄試劑盒、T3轉(zhuǎn)錄試劑盒或SP6轉(zhuǎn)錄試劑盒。

結(jié)合第一方面或上述某些可能的實(shí)施方式，在第一方面的一種可能的實(shí)現(xiàn)方式中，步驟(3)中的假孕雌鼠在SPF級(jí)別條件下飼養(yǎng)。

結(jié)合第一方面或上述某些可能的實(shí)施方式，在第一方面的一種可能的實(shí)現(xiàn)方式中，步驟(3)中的大鼠受精卵取自在SPF級(jí)別條件下飼養(yǎng)的受孕雌鼠。

第二方面，提供了一種免疫缺陷大鼠模型，所述大鼠模型敲除了IL2Rγ和Prkdc基因并轉(zhuǎn)入了人SIRPa基因。

結(jié)合第二方面，在第二方面的一種可能的實(shí)現(xiàn)方式中，所述免疫缺陷大鼠模型由第一方面的任一種方法構(gòu)建而成。

上述技術(shù)方案中，在Prkdc和IL2Rγ敲除的大鼠中過(guò)表達(dá)人的SIRPa(hSIRPa)基因，構(gòu)建免疫功能喪失和過(guò)表達(dá)人的SIRPa基因的大鼠，從而得到了完全對(duì)異體移植無(wú)免疫作用的大鼠模型，使得這種大鼠模型在用于進(jìn) 行異種移植時(shí)除T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞以外的免疫細(xì)胞也不攻擊人源性的異種移植物，滿足藥物試驗(yàn)和異種細(xì)胞移植研究等的需求。該方法得到的免疫缺陷大鼠模型不但填補(bǔ)了免疫缺陷大鼠模型品系空缺，符合試驗(yàn)指標(biāo)，可以讓人類細(xì)胞高效植入，而且品系背景純正。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明提供的免疫缺陷大鼠模型構(gòu)建方法的其中一個(gè)具體實(shí)施方式中敲除Prkdc基因所使用的gRNA在大鼠DNA中的位置示意圖。

圖2為本發(fā)明提供的免疫缺陷大鼠模型構(gòu)建方法的其中一個(gè)具體實(shí)施方式中敲除IL2Rγ基因所使用的gRNA在大鼠DNA中的位置示意圖。

圖3為正常野生大鼠(WT)和本發(fā)明一個(gè)具體實(shí)施方式中過(guò)表達(dá)人SIRPa(hSIRPa)大鼠的外周血中人的hSIRPa和大鼠的rSIRPa表達(dá)情況的流式細(xì)胞測(cè)量圖譜。

圖4為正常野生大鼠(WT)、一個(gè)具體實(shí)施方式中Prkdc單敲(Prkdc^+/-)和雙敲(Prkdc^-/-)大鼠的外周血中NK細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的流式細(xì)胞測(cè)量圖譜。

圖5為正常野生大鼠(WT)、一個(gè)具體實(shí)施方式中IL2Rγ單敲(IL2Rγ^+/-)和雙敲(IL2Rγ^-/-)大鼠的外周血中NK細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的流式細(xì)胞測(cè)量圖譜。

圖6為正常野生大鼠(WT)、本發(fā)明一個(gè)具體實(shí)施方式中SG(IL2Rγ^-/-，Prkdc^-/-)大鼠和NSG(hSIRPa，IL2Rγ^-/-，Prkdc^-/-)大鼠模型的外周血中NK細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的流式細(xì)胞測(cè)量圖譜，以及hSIRPa和rSIRPa表達(dá)情況的流式細(xì)胞測(cè)量圖譜。

圖7為人造血干細(xì)胞尾靜脈注射本發(fā)明其中一個(gè)實(shí)施方式所構(gòu)建出的免疫缺陷大鼠模型5周后人的免疫細(xì)胞在外周血和骨髓中的表達(dá)情況檢測(cè)結(jié)果。

圖8為腫瘤細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞在SG(IL2Rγ^-/-，Prkdc^-/-)大鼠和NSG(hSIRPa，IL2Rγ^-/-，Prkdc^-/-)大鼠模型皮下移植后的成瘤情況。

具體實(shí)施方式

為更清楚的對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案予以闡述，下面將結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行進(jìn)一步闡述：

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)中的免疫缺陷大鼠模型至少存在如下的問(wèn)題：在Prkdc和IL2Rγ同時(shí)敲除的大鼠模型上移植人的CD34+造血干細(xì)胞，卻并沒(méi)有產(chǎn)生人的免疫系統(tǒng)細(xì)胞。發(fā)明人經(jīng)過(guò)分析認(rèn)為，主要可能原因是該大鼠模型內(nèi)的巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞的異體排斥作用導(dǎo)致的移植失敗。

為此，在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，提供了一種免疫缺陷大鼠模型的構(gòu)建方法，包括以下步驟：(1)將針對(duì)大鼠DNA的Prkdc和IL2Rγ基因敲除的gRNA分別進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，再分別與體外轉(zhuǎn)錄的CAS9蛋白mRNA混合，凍存于無(wú)RNA酶的超純水中，得到相應(yīng)的注射液A及注射液B；

(2)將人SIRPa基因組DNA擴(kuò)增，純化，凍存于無(wú)RNA酶的超純水中，得到注射液C；

(3)采用顯微注射法將注射液A和注射液B分別注射進(jìn)不同的大鼠受精卵的胞質(zhì)中，然后將大鼠受精卵分別移植入不同假孕雌鼠體內(nèi)，培育得到第二代大鼠A和第二代大鼠B；

(4)采用顯微注射法將注射液C注射進(jìn)大鼠受精卵的原核中，然后將大鼠受精卵移植入假孕雌鼠體內(nèi)，培育得到第二代大鼠C；

(5)將第二代大鼠A、第二代大鼠B和第二代大鼠C進(jìn)行雜交，繁殖F1代；再將F1代進(jìn)行雜交，得到敲除了IL2Rγ和Prkdc基因并轉(zhuǎn)入了人SIRPa基因的免疫缺陷大鼠模型。

上述的顯微注射法是利用管尖極細(xì)(0.1至0.5μm)的玻璃微量注射針，將外源基因片段直接注射到原核期胚或培養(yǎng)的細(xì)胞中，然后藉由宿主基因組序列可能發(fā)生的重組、缺失、復(fù)制或易位等現(xiàn)象而使外源基因嵌入宿主的染色體內(nèi)。

上述人SIRPa基因組DNA，即Signal Regulatory Protein Alpha基因組DNA，可通過(guò)商業(yè)途徑直接采購(gòu)。例如，上述方案中使用的人SIRPa基因組DNA采購(gòu)自life technologies(BAC,RP11-993C19)。初始購(gòu)買(mǎi)的人SIRPa 基因組DNA先進(jìn)行擴(kuò)增純化。受精卵顯微注射需要足夠純，否則容易導(dǎo)致受精卵發(fā)育不下去，從而得不到陽(yáng)性結(jié)果。

上述技術(shù)方案中，SIRPa主要表達(dá)于單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表面，與CD47配體結(jié)合后介導(dǎo)負(fù)性調(diào)節(jié)信號(hào)，是一個(gè)“別吃我”的基因。發(fā)明人經(jīng)過(guò)創(chuàng)造性勞動(dòng)和大量實(shí)驗(yàn)，將針對(duì)大鼠DNA的Prkdc和IL2Rγ基因敲除的gRNA分別進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，再分別與體外轉(zhuǎn)錄制備好的CAS9蛋白mRNA按比例混合，再各自通過(guò)顯微注射法注射進(jìn)入受孕雌鼠的不同的受精卵的胞質(zhì)中，在受精卵中依賴真核翻譯系統(tǒng)將Cas9的mRNA翻譯成蛋白質(zhì)，即Cas9蛋白；Cas9蛋白與gRNA結(jié)合，在gRNA的介導(dǎo)下結(jié)合到作用靶點(diǎn)，Cas9蛋白對(duì)所結(jié)合靶點(diǎn)進(jìn)行切割，破壞免疫相關(guān)基因序列，從而使免疫相關(guān)基因的功能喪失，將受精卵移植入假孕雌鼠后培育得到敲除了Prkdc的第二代大鼠A和敲除了IL2Rγ基因的第二代大鼠B。再將人SIRPa基因組DNA通過(guò)顯微注射法注射進(jìn)入另一大鼠受精卵的原核中，SIRPa基因組DNA在受精卵分裂期間隨機(jī)插入基因組中，從而使培育得到的第二代大鼠C表達(dá)人的SIRPa。最后通過(guò)將第二代大鼠A、第二代大鼠B和第二代大鼠C進(jìn)行雜交，繁殖F1代，再將F1代進(jìn)行雜交，建立穩(wěn)定純合的Prkdc和IL2Rγ基因敲除和人SIRPa(hSIRPa)基因穩(wěn)定表達(dá)的免疫缺陷大鼠品系，從而構(gòu)建出免疫功能喪失和過(guò)表達(dá)人的SIRPa基因的大鼠模型。

通過(guò)上述方法培育得到的大鼠模型對(duì)異體移植完全無(wú)免疫作用，使得這種大鼠模型在用于進(jìn)行異種移植時(shí)除T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞以外的免疫細(xì)胞也不攻擊人源性的異種移植物，從而滿足藥物試驗(yàn)和異種細(xì)胞移植研究等的需求。該免疫缺陷大鼠模型是一種良好的人源化大鼠的載體，通過(guò)大鼠體內(nèi)移植人的ES細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞，結(jié)果均呈現(xiàn)出很好的異種移植能力，并且在移植了人CD34⁺造血干細(xì)胞后，可以建立造血系統(tǒng)人源化大鼠模型。此外還可以應(yīng)用于干細(xì)胞移植、腫瘤生物學(xué)、人源化免疫系統(tǒng)重建、人類抗體制造、HIV研究等研究領(lǐng)域。

上述技術(shù)方案得到的免疫缺陷大鼠模型不但填補(bǔ)了免疫缺陷大鼠模型品系空缺，符合試驗(yàn)指標(biāo)，而且品系背景純正。

上述敲除了Prkdc基因的第二代大鼠A和敲除了IL2Rγ基因的第二代大鼠B都是采用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建的。CRISPR/Cas9技術(shù)與之前的Zine-Finger和TALEN技術(shù)都可以實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的敲除，但因?yàn)槊總€(gè)技術(shù)對(duì)基因編輯位點(diǎn)都有一定的要求，所以最終都到大鼠DNA敲除序列(位點(diǎn))不一樣，此外CRISPR/Cas9技術(shù)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，操作方便，效率更高。

上述的gRNA又稱引導(dǎo)RNA，是CRISPR/Cas9技術(shù)的核心組成部分之一。

進(jìn)一步地，步驟(1)中的敲除大鼠Prkdc基因采用兩條gRNA序列，分別為：第一外顯子gRNA序列1：TTCCGGCACTATGGCGGACC；第一外顯子gRNA序列2：GCCAGTTACCAGCTGATCCG。

請(qǐng)結(jié)合圖1，圖1中示意了大鼠DNA第一外顯子中要敲除Prkdc基因所使用的gRNA引導(dǎo)的大概位置。

野生大鼠的Prkdc基因序列為：

SD-Prkdc-WT#1:

通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)基因進(jìn)行編輯，CRISPR/Cas9在gRNA的介導(dǎo)下結(jié)合到靶向序列的DNA，Cas9蛋白在PAM(protospacer adjacent motif)序列的第三個(gè)堿基處進(jìn)行切割，斷開(kāi)的DNA會(huì)進(jìn)行末端連接修復(fù)，此過(guò)程有可能插入一些堿基。在本方案中，通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)敲除后得到兩個(gè)Prkdc敲除序列。

第一Prkdc敲除序列缺失第20-114個(gè)共95個(gè)堿基，突變1個(gè)堿基，突變的為第115個(gè)，由A突變?yōu)镚。其序列具體如下：

Deletion#1:

第二Prkdc敲除序列缺失第16-115個(gè)共100個(gè)堿基，突變1個(gè)堿基，突變的為第116個(gè)，由T突變?yōu)镃。其序列具體如下：

Deletion#2:

進(jìn)一步地，步驟(1)中敲除大鼠IL2Rγ基因采用兩條gRNA序列，分別為：第二外顯子gRNA序列1：CAGCCGACCAACCTCACTAT；第四外顯子gRNA序列2：GAGTGAATCTCAGGTAGAAC。

進(jìn)一步地，步驟(1)中敲除大鼠IL2Rγ基因還采用另外兩條gRNA序列，分別為：第二外顯子gRNA序列1：CAGCCGACCAACCTCACTAT；第四外顯子gRNA序列3：GAGCAACCGAGATCGAAGCT。

請(qǐng)結(jié)合圖2，圖2中示意了大鼠DNA中要敲除IL2Rγ基因可使用的3條不同gRNA引導(dǎo)的大概位置。

野生大鼠的IL2rg基因序列1為：

SD-IL2rg-WT#2:

CAGTTCTGAGCCTCAGCCGACCAACCTCACTATGCACTATAGGTATGAGAAGGGGGAGGGGTAGTACAGGAAGAAGAGAAGGTGGGTTAGCTGAGAGAGACGGGGGAGCAAAAAAGTGGGTAGCCAGCTCCTCAGGTACCATACCAGTTTCTCATGGGATAAGTTATCAGTTCAGACCAGATGAAGCTAGGCTATGGGCAGATGTGGTACCTACCTATGTTTGGCCCATCATTCTTTTGCCTTGTAACCCTTCTCTAGGTACAAGGGATCTGATAATAATACATTCCAGG AGTGCAGCCACTATCTGTTCTCAAAAGAGATTACTTCTGGCTGTCAGATACAAAAAGAAGATATCCAGCTCTACCAGACATTTGTTGTCCAGCTTCAGGACCCCCAGAAACCCCAGAGGCGAGCCGAACAGAAGCTAAACCTACAGAATCTTGGTAATCGGGAAAGAAGTGGCCAAGAGGCCAGGGAGCTTAAAGGCACTGGAGTTTATAGATTGTTCTTTTCTCATTGTTGGTCATGGGCAGAAAGGCGAAGATGGGGGGGGGGCGGGGAGGGATGAAGGGAATTACCTCCAAGATCCTGACTTGTCTAGGCCAGGGCAATGACCACGCACACACATATTCCAGTGATCCCATGGGCTCCAGAGAATCTAACACTTTATAACCTGAGTGAATCTCAGGTAGAAC

采用CRISPR/Cas9技術(shù)，第二外顯子gRNA序列1和第四外顯子gRNA序列2為引導(dǎo)RNA，獲得第一IL2Rγ敲除序列，缺失第17-678個(gè)共662個(gè)堿基。其序列具體如下：

Deletion#3:

野生大鼠的IL2rg基因序列2為：

SD-IL2rg-WT#3:

采用CRISPR/Cas9技術(shù)，第二外顯子gRNA序列1和第四外顯子gRNA序列3為引導(dǎo)RNA，獲得第二IL2Rγ敲除序列，缺失第17-767個(gè)共751個(gè)堿基，并在第16個(gè)堿基后插入第17-27個(gè)共8個(gè)堿基。其序列具體如下：

Deletion#4:

進(jìn)一步地，步驟(1)中，體外轉(zhuǎn)錄CAS9蛋白mRNA采用T7轉(zhuǎn)錄試劑盒、T3轉(zhuǎn)錄試劑盒或SP6轉(zhuǎn)錄試劑盒。轉(zhuǎn)錄試劑盒的選取由啟動(dòng)gRNA和Cas9蛋白的啟動(dòng)子決定。

進(jìn)一步地，步驟(3)和步驟(4)中的假孕雌鼠在SPF級(jí)別條件下飼養(yǎng)。

SPF(Specefic pathogen Free)級(jí)別是指無(wú)特定病原體級(jí)別。本方案中要構(gòu)建的是免疫缺陷大鼠，CRISPR/Cas9技術(shù)敲除可能在第一代就產(chǎn)生純合的 免疫缺陷大鼠，所以假孕雌鼠需要在SPF條件下。

本發(fā)明的技術(shù)方案中步驟(1)、(2)、(3)、(4)、(5)等標(biāo)號(hào)不用于限定制備方法中各個(gè)步驟的順序，方法中的各個(gè)步驟，只要邏輯上合理，各步驟的順序可以變化。例如，上述的步驟(1)可以與步驟(2)同時(shí)獨(dú)立進(jìn)行；又例如，步驟(2)可以放在步驟(1)之前進(jìn)行。

下面通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明上述具體實(shí)施方式，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說(shuō)明書(shū)選擇。其他未做特別說(shuō)明的試劑、原料和儀器設(shè)備均可通過(guò)商業(yè)途徑直接購(gòu)得。

實(shí)施例一

(1)將針對(duì)大鼠DNA的Prkdc和IL2Rγ基因敲除的gRNA分別進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，再分別與體外轉(zhuǎn)錄的CAS9蛋白mRNA混合，凍存于無(wú)RNA酶的超純水中，得到相應(yīng)的注射液A、注射液B備用。

敲除大鼠Prkdc基因采用兩條gRNA序列，分別為：第一外顯子gRNA序列1：TTCCGGCACTATGGCGGACC；第一外顯子gRNA序列2：GCCAGTTACCAGCTGATCCG。

敲除大鼠IL2Rγ基因采用兩條gRNA序列，分別為：第二外顯子gRNA序列1：CAGCCGACCAACCTCACTAT；第四外顯子gRNA序列2：GAGTGAATCTCAGGTAGAAC。

體外轉(zhuǎn)錄CAS9蛋白mRNA采用T7轉(zhuǎn)錄試劑盒。

(2)將人SIRPa DNA擴(kuò)增，純化，凍存于無(wú)RNA酶的超純水中，得到注射液C，備用。

(3)在SPF級(jí)別條件下飼養(yǎng)的受孕雌鼠腹腔中獲取輸卵管，用濃度為0.9％的生理鹽水清洗后，顯微鏡下觀察、挑取并收集受精卵。

(4)采用顯微注射法將注射液A和注射液B分別注射進(jìn)步驟(3)獲取的不同的受精卵的胞質(zhì)中，將大鼠受精卵分別移植入SPF級(jí)別條件下飼養(yǎng)的不同的假孕雌鼠體內(nèi)，培育得到第二代大鼠A和第二代大鼠B。

(5)將注射液C注射進(jìn)步驟(3)獲取的另一受精卵的原核中，將大鼠受精卵移植入另一SPF級(jí)別條件下飼養(yǎng)的假孕雌鼠體內(nèi)，培育得到第二代大鼠C；

(6)將第二代大鼠A，第二代大鼠B，第二代大鼠C進(jìn)行雜交，繁殖F1代；再將F1代進(jìn)行雜交，得到敲除了IL2Rγ和Prkdc基因并轉(zhuǎn)入了人SIRPa基因的免疫缺陷大鼠模型。

實(shí)施例二

(1)將針對(duì)大鼠DNA的Prkdc和IL2Rγ基因敲除的gRNA分別進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，再分別與體外轉(zhuǎn)錄的CAS9蛋白mRNA混合，凍存于無(wú)RNA酶的超純水中，得到相應(yīng)的注射液A和B，備用。

敲除大鼠Prkdc基因采用兩條gRNA序列，分別為：第一外顯子gRNA序列1：TTCCGGCACTATGGCGGACC；第一外顯子gRNA序列2：GCCAGTTACCAGCTGATCCG。

敲除大鼠IL2Rγ基因采用兩條gRNA序列，分別為：第二外顯子gRNA序列1：CAGCCGACCAACCTCACTAT；第四外顯子gRNA序列2：GAGTGAATCTCAGGTAGAAC。

敲除大鼠IL2Rγ基因還采用另外兩條gRNA序列，分別為：第二外顯子gRNA序列1：CAGCCGACCAACCTCACTAT；第四外顯子gRNA序列3：GAGCAACCGAGATCGAAGCT。

體外轉(zhuǎn)錄CAS9蛋白mRNA采用T7轉(zhuǎn)錄試劑盒。

(2)將人SIRPa DNA擴(kuò)增，純化，凍存于無(wú)RNA酶的超純水中，得到注射液C，備用。

(3)在SPF級(jí)別條件下飼養(yǎng)的受孕雌鼠腹腔中獲取輸卵管，用濃度為0.9％的生理鹽水清洗后，顯微鏡下觀察、挑取并收集受精卵。

(4)采用顯微注射法將注射液A和注射液B分別注射進(jìn)步驟(3)獲取的不同的受精卵的胞質(zhì)中，將大鼠受精卵分別移植入SPF級(jí)別條件下飼養(yǎng)的假孕雌鼠體內(nèi)，培育得到第二代大鼠A和第二代大鼠B。

(5)將注射液C注射進(jìn)步驟(3)獲取的另一受精卵的原核中，將大鼠受精卵移植入另一SPF級(jí)別條件下飼養(yǎng)的假孕雌鼠體內(nèi)，培育得到第二代大鼠C；

(6)將第二代大鼠A，第二代大鼠B，第二代大鼠C進(jìn)行雜交，繁殖F1代；再將F1代進(jìn)行雜交，得到敲除了IL2Rγ和Prkdc基因并轉(zhuǎn)入了人SIRPa基因的免疫缺陷大鼠模型。

圖3為正常野生大鼠(WT)和本發(fā)明一個(gè)具體實(shí)施方式中過(guò)表達(dá)人SIRPa(hSIRPa)大鼠(即第二代大鼠C)的外周血中hSIRPa和rSIRPa表達(dá)情況的流式細(xì)胞測(cè)量圖譜。

圖4為正常野生大鼠(WT)、Prkdc單敲(Prkdc^+/-)和雙敲(Prkdc^-/-)大鼠的外周血中NK細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的流式細(xì)胞測(cè)量圖譜。

圖5為正常野生大鼠(WT)、IL2Rγ單敲(IL2Rγ^+/-)和雙敲(IL2Rγ^-/-)大鼠的外周血中NK細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的流式細(xì)胞測(cè)量圖譜。

圖6為正常野生大鼠(WT)、SG(IL2Rγ^-/-，Prkdc^-/-)大鼠和NSG(hSIRPa，IL2Rγ^-/-，Prkdc^-/-)大鼠模型的外周血中NK細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的流式細(xì)胞測(cè)量圖譜，以及hSIRPa和rSIRPa表達(dá)情況的流式細(xì)胞測(cè)量圖譜。

圖4中的Prkdc單敲(Prkdc^+/-)和雙敲(Prkdc^-/-)大鼠即第二代大鼠A可能的兩種敲除情況。圖5中IL2Rγ單敲(IL2Rγ^+/-)和雙敲(IL2Rγ^-/-)大鼠即第二代大鼠B可能的兩種敲除情況。圖6中的NSG大鼠即本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例所構(gòu)建的免疫缺陷大鼠模型。

比較例一

采用NSG大鼠進(jìn)行人的造血干細(xì)胞CD34尾靜脈注射移植，移植1*10⁶個(gè)人的CD34+細(xì)胞。5周后，外周血和骨髓中均檢測(cè)到了人的免疫細(xì)胞，并且在未移植人的胸腺情況下，主要是以人的B細(xì)胞(hCD19陽(yáng)性)為主，占65％以上，而T細(xì)胞(hCD3陽(yáng)性)和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞(hCD14陽(yáng)性)占很少比例。這充分表明NSG大鼠可以用于建立人源化大鼠。

圖7為人的造血干細(xì)胞CD34尾靜脈注射移植本發(fā)明其中一個(gè)實(shí)施方式 所構(gòu)建出的免疫缺陷大鼠模型5周后發(fā)育成人外周血細(xì)胞的情況。

比較例二

用肺癌腫瘤細(xì)胞H460和人胚胎干細(xì)胞H9分別在SG和NSG大鼠模型皮下注射1*10⁵個(gè)細(xì)胞。

圖8A-8C為H460肺癌細(xì)胞在SG和NSG大鼠皮下的成瘤情況(大小、體積、生長(zhǎng)情況)。

圖8D-8F為人胚胎干細(xì)胞H9在SG和NSG大鼠皮下的成瘤情況(大小、體積、生長(zhǎng)情況)。

最后應(yīng)說(shuō)明的是：以上各實(shí)施例僅用以幫助理解本發(fā)明的技術(shù)方案及核心思想，而非對(duì)其限制；盡管參照前述各實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換，而這些修改或者替換也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 南方醫(yī)科大學(xué)；廣東圣賽生物科技有限公司

<120> 一種免疫缺陷大鼠模型的構(gòu)建方法

<130> EKP160641-DD-1-SQ

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 133

<212> DNA

<213> 野生大鼠

<400> 1

ggttccggca ctatggcgga cccgggggcc ggcttgcggt gctggctact acagctgcag 60

gagttcgtgt ccgcagcaga ccgctacaat gctgccgggg ccagttacca gctgatccgt 120

ggcctggggc aag 133

<210> 2

<211> 38

<212> DNA

<213> 大鼠

<400> 2

ggttccggca ctatggcggg tccgtggcct ggggcaag 38

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 大鼠

<400> 3

ggttccggca ctatgcccgt ggcctggggc aag 33

<210> 4

<211> 695

<212> DNA

<213> 野生大鼠

<400> 4

cagttctgag cctcagccga ccaacctcac tatgcactat aggtatgaga agggggaggg 60

gtagtacagg aagaagagaa ggtgggttag ctgagagaga cgggggagca aaaaagtggg 120

tagccagctc ctcaggtacc ataccagttt ctcatgggat aagttatcag ttcagaccag 180

atgaagctag gctatgggca gatgtggtac ctacctatgt ttggcccatc attcttttgc 240

cttgtaaccc ttctctaggt acaagggatc tgataataat acattccagg agtgcagcca 300

ctatctgttc tcaaaagaga ttacttctgg ctgtcagata caaaaagaag atatccagct 360

ctaccagaca tttgttgtcc agcttcagga cccccagaaa ccccagaggc gagccgaaca 420

gaagctaaac ctacagaatc ttggtaatcg ggaaagaagt ggccaagagg ccagggagct 480

taaaggcact ggagtttata gattgttctt ttctcattgt tggtcatggg cagaaaggcg 540

aagatggggg gggggcgggg agggatgaag ggaattacct ccaagatcct gacttgtcta 600

ggccagggca atgaccacgc acacacatat tccagtgatc ccatgggctc cagagaatct 660

aacactttat aacctgagtg aatctcaggt agaac 695

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 大鼠

<400> 5

cagttctgag cctcagtgaa tctcaggtag aac 33

<210> 6

<211> 783

<212> DNA

<213> 野生大鼠

<400> 6

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agaaggggga ggggtagtac aggaagaaga gaaggtgggt tagctgagag agacggggga 120

gcaaaaaagt gggtagccag ctcctcaggt accataccag tttctcatgg gataagttat 180

cagttcagac cagatgaagc taggctatgg gcagatgtgg tacctaccta tgtttggccc 240

atcattcttt tgccttgtaa cccttctcta ggtacaaggg atctgataat aatacattcc 300

aggagtgcag ccactatctg ttctcaaaag agattacttc tggctgtcag atacaaaaag 360

aagatatcca gctctaccag acatttgttg tccagcttca ggacccccag aaaccccaga 420

ggcgagccga acagaagcta aacctacaga atcttggtaa tcgggaaaga agtggccaag 480

aggccaggga gcttaaaggc actggagttt atagattgtt cttttctcat tgttggtcat 540

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gct 783

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 大鼠

<400> 7

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<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ttccggcact atggcggacc 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gccagttacc agctgatccg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

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<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

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<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gagcaaccga gatcgaagct 20