一種高血壓病肝陽上亢證大鼠模型判別方法及其應用與流程
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術領域，本發(fā)明涉及一種高血壓病肝陽上亢證大鼠模型判別方法及其應用，該方法用于評價高血壓病肝陽上亢證大鼠模型。
背景技術：
病證結合動物模型，是指在中醫(yī)藥理論指導下，適當結合現代醫(yī)學理論與實驗動物科學知識，分別或同時采用傳統(tǒng)中醫(yī)學病因復制證候動物模型和現代醫(yī)學病因復制疾病動物模型，令動物模型既能體現疾病的病理特征，又能系統(tǒng)動態(tài)地反映此特定階段所出現的證候特征。高血壓病肝陽上亢證是高血壓病常見證候類型，具有特征性的發(fā)病機制和證候表征組合，因此在研究高血壓病肝陽上亢證時，選用既具有高血壓病的病理特點又能體現肝陽上亢證階段性特征的病證結合動物模型，將有助于深入探討高血壓病肝陽上亢證的特點與本質，同時也有助于對治療高血壓病肝陽上亢證相關中藥方劑的作用機制進行研究。
為復制高血壓病肝陽上亢證動物模型，鄢東紅[鄢東紅，等.湖南中醫(yī)學院學報，1999，19(4)：35-38.]等人采用自發(fā)性高血壓大鼠加灌附子湯的方法，一方面大鼠血壓穩(wěn)定升高，另一方面出現了近似人類肝陽上亢證的表現，如易激惹、飲水多、旋轉時間縮短及痛閾降低等。同時應用平肝潛陽的“潛陽方”進行反證，發(fā)現上述諸證均有改善。此方法利用附子的“久用必耗傷精血，致肝腎陰虛，陰不潛陽而肝陽偏亢”的藥性特點制造的肝陽上亢證，操作簡單，重復性好，在動物實驗中得到了廣泛應用。
目前，對高血壓病肝陽上亢證的判定多從以下幾個途徑進行：模型動物的宏觀體征、行為表現，與證候相關的理化指標，以及從中藥藥物的反證進行推測。目前采集模型動物的四診表征判定動物證候屬性，是較為常用的方法之一。依據高血壓病肝陽上亢證臨床表現與造模后動物的體征、行為一一對照，進行等效轉換，常以檢測旋轉時間的長短評價是否出現眩暈；檢測痛閾值的高低變化評價是否出現頭疼；觀察易激惹程度的變化評價是否存在煩躁易怒；觀察飲水量的多少變化評價是否出現口干的癥狀；檢測面部溫度的高低變化評價是否存在面部烘熱的表現。在高血壓病肝陽上亢證動物模型評價研究時，還常參照臨床報道的與高血壓病肝陽上亢證表現相關的生化指標進行評價，如兒茶酚胺一類可以反映體內外周交感-腎上腺髓質系統(tǒng)興奮性的指標。此外，在動物模型建立過程中常選用臨床上常用并且療效確切的治療該證型的經典復方，通過比較方藥對某些具有代表性指標的影響以確定建立的動物模型是否屬于該證型。因此，為證實高血壓病肝陽上亢證模型的成立，常常選用臨床應用上具有代表的方劑，觀察其對高血壓病肝陽上亢證有關的異常指標的影響，從而說明模型建立的正確性與可靠性。
但當前的評價方法存在諸多弊端。首先，高血壓病肝陽上亢證是體內系統(tǒng)病理變化的結果，盡管部分生理生化指標能夠一定程度反映證候的特點，但具有相當大的片面性，并且沒有特異性檢測指標。采用幾個理化指標簡單疊加以闡釋肝陽上亢證，這種對應層面的不一致性決定了難以對證候進行客觀化描述。其次，反證高血壓病肝陽上亢證動物模型時，應謹慎選取確有其效而又機理明確的方劑才能以此為依據來觀察方劑作用模型后的效應，判斷所建立的動物模型是否具有高血壓病肝陽上亢證的性質，而目前臨床上選用的反證方劑多是臨床上的經驗方，并未深入研究其藥理機制。另外，回顧以往應用“以方測證”的方法時，通常只設立了正常組、高血壓病肝陽上亢證組即模型組以及測證方劑組，往往缺乏對照組，然而沒有對照組就不能簡單的將方劑取得的功效判定為該證候的屬性。此外，在進行高血壓病肝陽上亢證動物模型評價時多關注動物宏觀體征與生化指標的改善，對于機體內物質的擾動卻關注較少，然而對高血壓病肝陽上亢證模型大鼠的內在變化進行整體層面的闡述，探明高血壓病肝陽上亢證發(fā)生發(fā)展過程中所產生的特殊物質群，對模型的評價具有重要意義。
技術實現要素：
為解決現有技術上的不足，本發(fā)明提供一種高血壓病肝陽上亢證大鼠模型判別方法。
本發(fā)明的目的是提供一種判別指標全面，并且包含高血壓病肝陽上亢證發(fā)生發(fā)展過程中所產生的特殊物質群的判別方法。
本發(fā)明的技術方案如下：
本發(fā)明提供了一種高血壓病肝陽上亢證大鼠模型判別方法，包括以下步驟：
（1）復制高血壓病肝陽上亢證大鼠模型作為病證組，同時選擇自發(fā)性高血壓大鼠作為模型組,選擇正常組作為對照；
（2）實驗動物干預，根據人與動物間體表面積折算的等效劑量，給予高血壓病肝陽上亢證治療藥物；
（3）檢測大鼠指標，包括大鼠血壓測量、大鼠痛閾測定、大鼠旋轉時間測定、大鼠面溫測量、大鼠飲水量測量；
（4）血清樣本的收集；
（5）大鼠血清angⅱ、da、ne、e、5-ht的檢測；
（6）大鼠血清代謝組學分析；
（7）選取數據，納入下述高血壓病肝陽上亢證大鼠pls回歸模型進行檢驗，pls二維得分圖中病證組和模型組分離，則建立的高血壓病肝陽上亢證大鼠模型成功，否則不成功；
y=-0.030x28-0.037x23-0.032x2+0.027x12-0.025x27-0.040x24+0.038x11+0.020x56+0.020x46+0.020x48+0.020x57+0.018x58+0.020x55+0.018x52+0.018x50+0.032x15+0.017x49+0.021x14-0.024x26+0.024x59+0.029x13+0.014x47+0.016x54-0.025x29-0.043x6+0.014x51-0.030x1-0.024x36-0.031x7+0.041x17+0.017x53+0.009x45+0.008x44
其中，x1是干預前收縮壓數據，x2是干預第1周收縮壓數據，x6是干預前舒張壓數據，x7是干預第1周舒張壓數據，x11是干預前痛閾數據，x12是干預第1周痛閾數據，x13是干預第2周痛閾數據，x14是干預第3周痛閾數據，x15是干預第4周痛閾數據，x17是干預第1周旋轉時間數據，x23是干預第2周面溫數據，x24是干預第3周面溫數據，x26是干預前飲水量數據，x27是干預第1周飲水量數據，x28是干預第2周飲水量數據，x29是干預第3周飲水量數據，x36是phenylethylamine峰強度，x44是tg(18:1(9z)/18:2(9z,12z)，/20:0)[iso6]峰強度，x45是ceramide(d18:1/12:0)峰強度，x46是testosterone峰強度，x47是androsterone峰強度，x48是dihydrotestosterone峰強度，x49是8(r)-hydroperoxylinoleicacid峰強度，x50是tetrahydrodeoxycorticosterone峰強度，x51是pe(16:0/15:0)峰強度，x52是sm(d18:0/16:1(9z))峰強度，x53是chenodeoxycholicacid峰強度，x54是pc(18:4(6z,9z,12z,15z)/，22:6(4z,7z,10z,13z,16z,19z))峰強度，x55是lactosylceramide(d18:1/18:0)峰強度，x56是glucosylceramide(d18:1/26:0)峰強度，x57是3-o-sulfogalactosylceramide，(d18:1/26:1(17z))峰強度，x58是ceramide(d18:1/25:0)峰強度，x59是9,10-dhome峰強度。
優(yōu)選的，步驟（1）所述的復制高血壓病肝陽上亢證大鼠模型方法為，采用每天灌服附子藥液方法復制高血壓病肝陽上亢證模型。
更優(yōu)選的，步驟（1）所述的復制高血壓病肝陽上亢證大鼠模型方法為，每天灌服附子藥液20ml·kg-1的方法復制高血壓病肝陽上亢證模型，連續(xù)給藥6周。
優(yōu)選的，步驟（2）所述的實驗動物干預是，根據人與動物間體表面積折算的等效劑量，計算給予鉤藤、天麻或石決明。
更優(yōu)選的，每日給予鉤藤2.29g·kg-1，給予天麻1.15g·kg-1，或每日給予石決明2.29g·kg-1。
優(yōu)選的，給予鉤藤、天麻或石決明每天定時給藥，每周給藥6d，連續(xù)給藥4周，根據體重調整給藥量。
該方法在高血壓病肝陽上亢證大鼠模型判別中的應用。
該方法在高血壓病肝陽上亢證中藥復方的方-證相關效應物質基礎和作用機理研究中的應用。
本發(fā)明的有益效果是：
首先，本方法選用生理生化指標全面，并且特異性。
其次，本方法設立高血壓病肝陽上亢證組即模型組和病證組，對照觀察指標。
再次，本方法不僅關注動物宏觀體征與生化指標的改善，還關注高血壓病肝陽上亢證發(fā)生發(fā)展過程中所產生的特殊物質群。
最后，本方法可應用于高血壓病肝陽上亢證中藥復方的方-證相關效應物質基礎和作用機理研究。
附圖說明
圖1是pca二維得分圖(a、b為n-m正負離子模式，c、d為n-ds正負離子模式，e、f為m-ds正負離子模式)。
圖2是pls-da二維得分圖(a、b為n-m正負離子模式，c、d為n-ds正負離子模式，e、f為m-ds正負離子模式)。
圖3是opls-da二維得分圖(a、b為n-m正負離子模式，c、d為n-ds正負離子模式，e、f為m-ds正負離子模式)。
圖4是n-m、n-ds以及m-ds數據矩陣韋恩圖。
圖5是各組高血壓潛在生物標志物的變化比較（注：與模型組比○p＜0.05，與病證組比●p＜0.05）。
圖6是各組肝陽上亢證潛在生物標志物的變化比較（注：與病證組比*p＜0.05。●pc為pc(18:4(6z,9z,12z,15z)/22:6(4z,7z,10z,13z,16z,19z))）。
圖7是潛在生物標志物對高血壓病肝陽上亢證大鼠roc分析結果。
圖8是svm分類評估圖。
圖9是高血壓病肝陽上亢證大鼠vip直方圖。
圖10是pls二維得分圖。
具體實施方式
實施例1判別方法的構建
一、實驗材料
（一）實驗動物
spf級8周齡雄性shr(自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneoushypertensiverat,shr))56只，體重186.35±8.15g，spf級8周齡雄性wky7只，體重190.15±6.37g，均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司（scxk（京）：2012-0001）。shr隨機分為病證組（dsgroup）、病證鉤藤組（dsgtgroup）、病證天麻組（dstmgroup）、病證石決明組（dssjmgroup）、模型組（mgroup）、模型鉤藤組（mgtgroup）、模型天麻組（mtmgroup）、模型石決明組（msjmgroup），wky作為正常組（normalgroup，ngroup）。每組7只。
（二）實驗藥物
附子、鉤藤、天麻、石決明藥材按照《中華人民共和國藥典》（2015年版）規(guī)格，一次性購自亳州市滬譙藥業(yè)有限公司，并鑒定為正品（由山東中醫(yī)藥大學藥學院徐凌川教授鑒定）。
①附子灌胃液的標準化制備：附子藥材加入8倍量水，浸泡30min，水浴加熱提取1h，過濾，殘渣加6倍量水再提取1h，先用四層紗布過濾后，再抽濾，合并兩次提取液，混合后濃縮為含生藥0.1g·ml-1的附子灌胃液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
②鉤藤灌胃液的標準化制備：鉤藤以75%乙醇8倍量回流提取2次，每次2h，合并提取液，60減壓回收，得濃縮為含生藥0.1g·ml-1的提取液，置于-20℃保存。
③天麻灌胃液的標準化制備：天麻浸泡0.5h，10倍量水回流提取2次，每次1h，合并提取液，60℃減壓回收，得濃縮為含生藥0.1g·ml-1的提取液，置于-20℃保存。
④石決明灌胃液的標準化制備：石決明浸泡0.5h，10倍量水回流提取2次，每次1h，60℃減壓回收，得濃縮為含生藥0.1g·ml-1的提取液，置于-20℃保存。
（三）實驗試劑
angⅱ試劑盒（批號：10614r）、da試劑盒（批號：10871r）、ne試劑盒（批號：10953r）、e試劑盒（批號：10105r）、5-ht試劑盒（批號：10801r），購自美國r&dsvstems公司；乙腈、甲醇（色譜級），購自美國merck公司；甲酸（色譜純），購自fisher公司；超純水，購于中國屈臣氏有限公司。
（四）實驗儀器
大小鼠無創(chuàng)血壓儀bp-98a（北京軟隆技術有限公司），zxc-a型大鼠壓痛儀（山東省醫(yī)學科學院設備站），手持式紅外測溫儀（gm550），bb5060uv型co2培養(yǎng)箱（德國heraeus公司），elx50型洗板機（美國biotek公司），multiskango全波長酶標儀（美國thermoscientific公司），ultimate3000超高效液相色譜儀（美國thermo公司），qexactive?hybridquadrupole-orbitrapmassspectrometer（美國thermoscientific公司），微量移液器（芬蘭dragon公司），高速臺式離心機（美國thermoscientific公司），vortex-genie2渦旋震蕩器（美國si公司）。
二、實驗方法
（一）高血壓病肝陽上亢證大鼠模型的復制方法
大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，參照文獻方法[鄢東紅，等.湖南中醫(yī)學院學報，1999，19(4)：35-38；熊新貴.長沙：湘雅醫(yī)院，2009.]，dsgroup、dsgtgroup、dstmgroup、dssjmgroup大鼠按照每天灌服附子藥液20ml·kg-1的方法復制高血壓病肝陽上亢證模型，連續(xù)給藥6周，同時正常組與模型組大鼠給予等量的蒸餾水。
（二）實驗動物干預方法
高血壓病肝陽上亢證大鼠模型復制后，根據人與動物間體表面積折算的等效劑量，計算各組給藥量。mgtgroup與dsgtgroup每日給予鉤藤2.29g·kg-1，mtmgroup與dstmgroup每日給予天麻1.15g·kg-1，msjmgroup與dssjmgroup每日給予石決明2.29g·kg-1，其余組給予等量蒸餾水。每天定時給藥，每周給藥6d，連續(xù)給藥4周，根據體重調整給藥量。
（三）大鼠指標檢測
①大鼠血壓測量：采用無創(chuàng)套尾法檢測大鼠安靜狀態(tài)下尾動脈血壓。每只大鼠連續(xù)測量3次，取平均值作為應測血壓值，每周檢測一次。
②大鼠痛閾測定：采用大鼠壓痛測量儀測定安靜狀態(tài)下大鼠疼痛閾值。每周進行一次測定。
③大鼠旋轉時間測定：采用自制旋轉測量儀器測定大鼠旋轉時間。每周進行一次測定。
④大鼠面溫測量：采用紅外測溫儀，測量安靜狀態(tài)下大鼠面部溫度。每周進行一次測量。
⑤大鼠飲水量測量：于早9點每籠供飲用水300ml，24h后測量剩余飲用水量，差值加灌胃量即為當日每籠總飲水量，除以每籠大鼠只數為當日每只大鼠飲水量。每周連續(xù)測量三天，取平均值作為當周每日飲水量。
（四）血清樣本的收集
末次給藥后，所有大鼠禁食不禁水12h，大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.3ml·100g-1麻醉，下腔靜脈取血，注入不抗凝試管中，靜置30min，3500r·min-1離心10min，取上清液。將血清分為兩部分，一部分用于elisa試劑盒檢測，另一部分用于代謝組學分析，分別置于-80℃冰箱保存。
（五）大鼠血清angⅱ、da、ne、e、5-ht的檢測
采用酶聯(lián)免疫吸附法對大鼠血清angⅱ、da、ne、e、5-ht的含量進行檢測，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。
（六）大鼠血清代謝組學分析
a、樣本制備
取備用血清室溫解凍，搖勻，精密吸取血清100μｌ，加入預冷甲醇300μｌ，渦旋1min后以12000r·min-1離心10min，吸取上清液，經0.22μm微孔濾膜過濾于液相小瓶中，-20℃保存?zhèn)溆?/p>
b、色譜條件
液相色譜為ultimate3000超高效液相色譜儀（uplc，thermoscientific），色譜柱規(guī)格為thalo-c18柱（2.1mm×100mm，2.7μm）。流速為0.30ml·min-1，柱溫保持在45℃，進樣器溫度為15℃，進樣量5μl。流動相a為水（含0.05%甲酸），b為乙腈（含0.05%甲酸），梯度洗脫：0~1min，2%~2%b；1~3min，2%~20%b；3~4min，20%~20%b；4~7min，20%~40%b；7~9min，40%~70%b；9~15min，70%~98%b。，每次進樣前以初始流動相平衡3min。
c、質譜條件
質譜為thermoscientific公司的四級桿-靜電場軌道阱超高分辨質譜儀（qexactive?hybridquadrupole-orbitrapmassspectrometer），采用正負離子模式進行檢測。正離子模式檢測條件為：hesi離子源，鞘氣45arb，輔助氣10arb，裂解電壓3.5kv，源內溫度300℃，s-lensrflevel為55，質譜采集范圍80-1000m/z，分辨率為70000。負離子模式檢測條件為：hesi離子源，鞘氣40arb，輔助氣10arb，裂解電壓2.8kv，源內溫度320℃，s-lensrflevel為55，質譜采集范圍80-1000m/z，分辨率為70000。在正負離子檢測模式分析后，對目標代謝物進行分析，獲得相關代謝物的ms/ms譜。碰撞能量分別為30ev、45ev、60ev或-30ev、-45ev、-60ev。
d、數據質量控制
同時將所有血清樣本各取10μl等量混合，制備成包含所有生物信息的qc。qc包含了所有樣品信息，因此最具有代表性，通過分析檢測序列中插入qc的主成分分析結果，可以檢測從樣品前處理到樣品檢測過程中方法的穩(wěn)定性和重復性。在大批量檢測序列運行之前連續(xù)運行5次qc，使系統(tǒng)穩(wěn)定，之后在樣品檢測序列中每間隔10針插入1次空白清洗和qc分析。
（七）數據處理
a、統(tǒng)計學處理
采用spss22.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料采用均數±標準差（
b、代謝組學數據處理
將正負離子的原始譜圖數據.raw格式文件，利用proteowizard軟件轉換為.mzxml格式，之后采用r語言進行峰識別、峰對齊、峰校正和rt校正，逐一考察優(yōu)化每個參數設置，最終獲得包括質荷比（m/z）、rt及其峰面積的二維數據矩陣。，之后將對齊后的數據導入metaboanalys3.0軟件進行多變量分析。采用pca、pls-da以及opls-da對數據進行分析，采用基于opls-da產生的s-plot結合vip值進行標志物的篩選，并通過vip-plot控制標志物的質量。通過foldchange分析以及t-test進一步篩選變量，保留表達差異2倍以上且p＜0.05的變量，回歸原始數據核對后將剩余變量作為顯著表達差異的變量，即潛在生物標志物。
由于大部分的內源性小分子代謝物的結構類型、元素組成等信息未知，因而對這些生物標志物的鑒定難度較大。本研究根據生物標志物的精確分子量在hmdb（http://www.hmdb.ca）、metlin（https://metlin.scripps.edu）、kegg（http://www.genome.jp/kegg/）等數據庫中進行檢索，并利用massfrontier7.0以及相關文獻對ms/ms譜進行解析。
三、實驗結果
（一）外觀性情觀察
干預期間，正常組大鼠被毛均勻細密，雙目靈活，紅亮有神，唇鼻色淡紅濕潤，籠內較安靜，抓取時無明顯反抗，反應較靈敏，正常飲食水，大便性狀正常。模型組大鼠與病證組大鼠毛色逐漸失去光澤，甚者出現被毛發(fā)黃干燥，頸部出現豎毛，尾巴出現中度角化現象，病證組大鼠同籠互相打斗現象明顯，抓取時反抗激烈攻擊觀察者，模型組大鼠在抓取時雖未攻擊觀察者但有尖叫、驚跳現象。經藥物干預后的各組大鼠則隨干預時間的延長，性情逐漸溫順，同籠打斗現象逐漸減少。
（二）干預前后血壓變化結果
a、收縮壓變化結果
各組大鼠干預前后收縮壓變化見表1。不同干預時間之間大鼠收縮壓存在顯著差異（f=296.04，p＜0.001），各藥物干預組不同時間點收縮壓具有顯著差異性（p＜0.001）。各組之間收縮壓也存在顯著性差異（f=3076.16，p＜0.001）。各組收縮壓與干預時間點之間存在交互作用（f=29.57，p＜0.001）。
進步一分析單獨效應，結果顯示，與模型組相比，給予鉤藤、天麻的shr在干預第1周即出現收縮壓下降（p＜0.05），隨著干預時間的延長各給藥組降壓效果逐漸加強，以模型鉤藤組干預效果最好。與病證組相比，給予鉤藤、天麻與石決明的高血壓病肝陽上亢證大鼠在第2周開始呈現降壓效應（p＜0.05），至干預第4周收縮壓降至最低，與病證組比較均具有顯著差異（p＜0.001），并以鉤藤干預效果最好。與干預前相比，各給藥組收縮壓均下降明顯（p＜0.001）。結果表明鉤藤、天麻、石決明均具有降低收縮壓的作用，以鉤藤最佳，天麻次之。
表1各組大鼠不同時間點收縮壓結果（
注：*主效應的f統(tǒng)計量和p值，#交互效應的f統(tǒng)計量和p值；與模型組比，◆p＜0.05，◇p＜0.001；與病證組比，○p＜0.001（單因素方差分析）；與干預前比較，▲p＜0.05，△p＜0.001（單因素重復測量方差分析）。
b、舒張壓變化結果
各組大鼠干預前后舒張壓變化見表2。不同干預時間之間大鼠舒張壓存在顯著差異（f=65.07，p＜0.001），各藥物干預組不同時間點舒張壓具有差異性（p＜0.05）。各組之間舒張壓也存在顯著性差異（f=380.79，p＜0.001）。各組舒張壓與干預時間點之間存在交互作用（f=5.20，p＜0.001）。
進步一分析單獨效應，結果顯示，與模型組相比，給予鉤藤、天麻與石決明的shr在干預第2周時舒張壓下降（p＜0.05），隨著干預時間的延長降壓效果逐漸加強，至干預第4周后與模型組相比具有顯著差異性（p＜0.001）。與病證組相比，給予鉤藤、天麻的高血壓病肝陽上亢證大鼠在干預第1周后舒張壓即出現降低（p＜0.05），至干預第4周后各干預組與病證組相比舒張壓顯著降低（p＜0.001）。與干預前相比，隨著干預時間的延長至干預第4周，各藥物干預組舒張壓持續(xù)下降，與干預前比較均具有顯著差異性（p＜0.001）。結果表明鉤藤、天麻、石決明均具有降低舒張壓的作用，以鉤藤最佳，石決明次之，但石決明在干預期間對舒張壓的調節(jié)作用有波動。
表2各組大鼠不同時間點舒張壓結果（
注：*主效應的f統(tǒng)計量和p值，#交互效應的f統(tǒng)計量和p值；與模型組比◆p＜0.05，◇p＜0.001；與病證組比，●p＜0.05，○p＜0.001（單因素方差分析）；與干預前比較，▲p＜0.05，△p＜0.001（單因素重復測量方差分析）。
（三）干預前后痛閾變化結果
各組大鼠干預前后痛閾變化見表3。不同干預時間之間大鼠痛閾存在顯著差異（f=18.50，p＜0.001），其中病證鉤藤組、病證天麻組與病證石決明組不同時間點痛閾具有差異性（p＜0.05）。各組之間痛閾也存在顯著性差異（f=156.28，p＜0.001）。各組痛閾與干預時間點之間存在交互作用（f=3.49，p＜0.001）。
進步一分析單獨效應，結果顯示，在整個干預期間除干預第4周模型鉤藤組痛閾值的升高較模型組具有顯著差異（p＜0.05），其余時間點給予鉤藤、天麻與石決明后shr的痛閾雖出現升高的趨勢但無統(tǒng)計學意義（p＞0.05）。與病證組相比，給予鉤藤、天麻與石決明3周后痛閾值出現升高（p＜0.05），至干預第4周后與病證組相比具有顯著差異性（p＜0.001）。與干預前相比，shr經干預后僅以模型鉤藤組在干預第4周痛閾升高較干預前比有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）；而病證鉤藤組、病證天麻組與病證石決明組痛閾值隨著干預時間的延長持續(xù)升高，至干預第4周與干預前比較均具有顯著差異性（p＜0.001）。結果表明鉤藤、天麻、石決明可以提高高血壓病肝陽上亢證大鼠的痛閾，鉤藤與石決明效果相當。
表3各組大鼠不同時間點痛閾結果（
注：*主效應的f統(tǒng)計量和p值，#交互效應的f統(tǒng)計量和p值；與模型組比，◆p＜0.05；與病證組比，●p＜0.05，○p＜0.001（單因素方差分析）；與干預前比較，▲p＜0.05，△p＜0.001（單因素重復測量方差分析）。
（四）干預前后旋轉時間變化結果
各組大鼠干預前后旋轉時間變化見表4。不同干預時間之間大鼠旋轉時間存在顯著差異（f=10.95，p＜0.001），各組之間旋轉時間的改善也存在顯著性差異（f=48.56，p＜0.001）。各組旋轉時間與不同干預時間點之間不存在交互作用（f=1.03，p=0.433）。
進步一分析單獨效應，結果顯示，與模型組相比，給予天麻、石決明干預4周后shr出現旋轉時間延長（p＜0.05），其余干預時間點與模型組相比旋轉時間的延長無統(tǒng)計學意義（p＞0.05）。與病證組相比，給予鉤藤、天麻、石決明2周后高血壓病肝陽上亢證大鼠的旋轉時間均出現延長（p＜0.05），至干預第4周后與病證組相比旋轉時間的延長具有顯著差異性（p＜0.001）。與干預前相比，干預4周后模型天麻組與模型石決明組旋轉時間的延長較干預前比較有統(tǒng)計學意義（p＜0.05），但模型鉤藤組在整個干預期間的旋轉時間變化與干預前均無明顯差異（p＞0.05）；病證鉤藤組、病證天麻組與病證石決明組經藥物干預后旋轉時間逐漸延長，至干預第4周，各組旋轉時間與干預前比較均具有顯著差異（p＜0.001）。結果表明鉤藤、天麻、石決明對高血壓病肝陽上亢證大鼠的旋轉時間的干預作用優(yōu)于shr，但三者之間效果無顯著差異。
表4各組大鼠不同時間點旋轉時間結果（
注：*主效應的f統(tǒng)計量和p值，#交互效應的f統(tǒng)計量和p值；與模型組比，◆p＜0.05，◇p＜0.001；與病證組比，●p＜0.05，○p＜0.001（單因素方差分析）；與干預前比較，▲p＜0.05，△p＜0.001（單因素重復測量方差分析）。
（五）干預前后面溫變化結果
各組大鼠干預前后面溫變化見表5。不同干預時間之間大鼠面溫存在顯著差異（f=25.29，p＜0.001），各組之間面溫也存在顯著性差異（f=23.91，p＜0.001）。各組痛閾與干預時間點之間存在交互作用（f=1.58，p=0.029）。
進步一分析單獨效應，結果顯示，與模型組相比，經鉤藤、天麻、石決明干預后，除鉤藤干預第3周與第4周以及石決明干預第3周出現明顯改善外（p＜0.05），其余時間點藥物干預后面溫的變化與模型組比較未見差異性（p＞0.05）。與病證組相比，給予鉤藤、天麻、石決明1周后高血壓病肝陽上亢證大鼠的面溫即出現降低（p＜0.05），至干預第4周后降至最低（p＜0.05）。與干預前相比，模型鉤藤組、模型天麻組以及模型石決明組在干預4周后面溫的下降較干預前比較具有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）。病證石決明組在干預1周后即出現面溫的降低（p＜0.05），病證鉤藤組與病證天麻組在干預2周后出現降低（p＜0.05），至干預第4周與干預前比較均具有顯著差異（p＜0.001）。結果表明鉤藤、天麻、石決明可降低高血壓病肝陽上亢證大鼠的面溫，三者效果相當。
表5各組大鼠不同時間面溫結果（
注：*主效應的f統(tǒng)計量和p值，#交互效應的f統(tǒng)計量和p值；與模型組比，◆p＜0.05；與病證組比，●p＜0.05，○p＜0.001（單因素方差分析）；與干預前比較，▲p＜0.05，△p＜0.001（單因素重復測量方差分析）。
（六）飲水量變化結果
各組大鼠干預前后飲水量變化見表6。不同干預時間之間大鼠飲水量存在顯著差異（f=4.73，p=0.007），各組之間的飲水量也存在顯著性差異（f=4.14，p=0.010）。各組飲水量變化與干預時間點之間不存在交互作用（f=1.22，p=0.26）。
進步一分析單獨效應，結果顯示，與模型組相比，經鉤藤、天麻、石決明干預4周后飲水量有所減少（p＜0.05）。與病證組相比，給予天麻、石決明2周后高血壓病肝陽上亢證大鼠的飲水量均有不同程度的減少（p＜0.05）。與干預前相比，模型鉤藤組、模型天麻組以及模型石決明組在干預各個時間點的飲水量變化未見明顯差異（p＞0.05）；而高血壓病肝陽上亢證大鼠經鉤藤、石決明干預4周后飲水量較干預前具有差異性（p＜0.05）。結果表明鉤藤、天麻、石決明對高血壓病肝陽上亢證大鼠的飲水量有改善作用，三者作用相當。
表6各組大鼠不同時間飲水量結果（
注：*主效應的f統(tǒng)計量和p值，#交互效應的f統(tǒng)計量和p值；與模型組比，◆p＜0.05；與病證組比，●p＜0.05（單因素方差分析）；與干預前比較，▲p＜0.05，△p＜0.001（單因素重復測量方差分析）。
（七）酶免結果
各組大鼠干預前后酶免變化見表7。與模型組相比，鉤藤干預后shr血清中angⅱ含量降低（p＜0.05）；天麻干預后降低了shr血清中da的含量（p＜0.05），但鉤藤、天麻、石決明對shr血清中e、ne、5-ht的調整與模型組無顯著差異性（p＞0.05）。與病證組比，經鉤藤與石決明干預后，除了對高血壓病肝陽上亢證大鼠血清中da水平有下調趨勢但無顯著差異外（p＞0.05），對angⅱ、e、ne以及5-ht均有改善作用（p＜0.05）；天麻則可以調整高血壓病肝陽上亢證大鼠血清中angⅱ、e、da、5-ht的含量（p＜0.05）。結果表明，鉤藤、天麻與石決明均可以回調高血壓病肝陽上亢證大鼠血清中angⅱ、e、5-ht的含量，三種藥物不同程度的減少了高血壓病肝陽上亢證大鼠體內ca類物質的含量，改善了交感-腎上腺髓質功能。
表7各組大鼠angⅱ、e、ne、da、5-ht結果（
注：與模型組比，◆p＜0.05，◇p＜0.001；與病證組比，●p＜0.05，○p＜0.001。
綜上，經鉤藤、天麻、石決明干預后，shr與高血壓病肝陽上亢證大鼠的血壓均出現降低，提示血壓指標可為高血壓與高血壓病肝陽上亢證共性指標。而經鉤藤、天麻、石決明對大鼠的痛閾、旋轉時間、面溫、飲水量以及易激惹程度等宏觀指標的改善情況分析，則以高血壓病肝陽上亢證大鼠的改善較為明顯，故將宏觀體征指標作為高血壓病肝陽上亢證的指標。因鉤藤、天麻、石決明干預后，shr與高血壓病肝陽上亢證大鼠在angⅱ、e、ne、da與5-ht生化指標的改善狀況上，一方面反映了三者降低血壓的藥效，另一方面又體現出其改善交感-腎上腺髓質功能的作用，因此將生化指標作為高血壓病肝陽上亢證的指標。
（八）高血壓病肝陽上亢證代謝標志物數據庫構建
由于原始數據分組較多，不同大鼠模型與不同干預藥物之間相互影響，難以篩選核心代謝標志物。因此，為分析正常大鼠與shr之間、正常大鼠與高血壓病肝陽上亢證大鼠之間以及shr與高血壓病肝陽上亢證大鼠之間的代謝產物的差異，區(qū)分高血壓代謝標志物與高血壓病肝陽上亢證代謝標志物，本研究對正負離子模式下原始的九組數據矩陣進行了拆分，分別對正負離子模式下的正常-模型（n-m）數據矩陣、正常-病證（n-ds）數據矩陣、模型-病證（m-ds）數據矩陣進行多變量統(tǒng)計分析以及差異代謝物的篩選，具體研究如下。
a、多變量統(tǒng)計分析
將正負離子模式下n-m、n-ds、m-ds數據矩陣分別導入metaboanalyst3.0中，經數據過濾、歸一化（normalizationbysum）和標準化（paretoscaling）處理后，對滿足正態(tài)性的數據進行分析。
首先應用pca對六個數據矩陣進行分析，結果如圖1所示，無論是正離子模式還是負離子模式下，正常組與模型組明顯分開，正常組與病證組明顯分開，說明兩種大鼠模型與正常大鼠代謝模式存在明顯差異；同時模型組與病證組分離良好，提示高血壓病肝陽上亢證大鼠與shr代謝輪廓不同。進一步采用有監(jiān)督的pls-da對六個數據矩陣進行分析，結果如圖2所示，六個數據矩陣在基于正負離子兩種模式下所建立的pls-da二維得分圖均實現了完全分離。vip的大小反映了變量對分類的重要程度，vip＞1的變量是潛在差異變量篩選的依據之一，因此本研究同時提取pls-da模型中vip＞1的變量。為獲得更大程度的區(qū)分內源性代謝產物的差異，我們采用opls-da方法繼續(xù)對各數據矩陣進行分析，如圖3所示，基于opls-da模式清晰的反應了正常大鼠與shr、正常大鼠與高血壓病肝陽上亢證大鼠以及shr與高血壓病肝陽上亢證大鼠的不同代謝輪廓。所建模式具有較好的解釋能力與預測能力，模式識別可靠有效。
b、差異代謝物篩選
通過上述對正常組、模型組、病證組的正確分類，表明大鼠血清中確實存在可以區(qū)分高血壓和高血壓病肝陽上亢證的潛在標志物，然而要確定潛在標志物需要對差異代謝進行仔細篩查提取。本研究首先使用基于opls-da產生的s-plot進行差異變量的篩選，具有較高的p和p(corr)值的變量是對opls-da模型貢獻最大的變量。之后對s-plot篩選出的變量的vip值進行篩查，由于vip>1的變量是對結合模型有貢獻的變量，因此排除vip<1的變量。同時通過vip-plot排除沒有可靠置信區(qū)間的變量。對剩余差異變量采用foldchange與t-test相結合的方法，篩選表達相差2倍以上并且p＜0.05的變量為顯著差異性變量。最后回歸原始數據進行驗證，提取篩選出的差異代謝物的正負離子模式下色譜峰來驗證結果的準確性，剔除不可靠的代謝物，最終剩余變量為存在明顯表達差異的變量，作為潛在標志物進行后續(xù)分析。
c、代謝物數據集構建
通過對數據矩陣中的變量進行上述篩選，納入的最終變量中，n-m數據矩陣差異變量代表了正常大鼠與shr之間的差異代謝物，與高血壓病密切相關；n-ds數據矩陣差異變量代表了正常大鼠與高血壓病肝陽上亢證大鼠之間的差異代謝物，與高血壓病肝陽上亢證密切相關；而m-ds數據矩陣差異變量代表了shr與高血壓病肝陽上亢證大鼠之間的差異代謝物，與肝陽上亢證密切相關。但各個差異代謝物之間存在交叉重疊（見圖4），因此需要對差異代謝物進行合并同類型。提取三個數據矩陣差異變量之間交叉的46個變量作為高血壓病肝陽上亢證代謝物數據集；對n-ds與m-ds數據矩陣中剩余的差異變量進行剔重合并，最終剩余53個差異變量作為肝陽上亢證代謝物數據集。
由前期對藥物干預后的大鼠代謝特征進行分析可知，shr與高血壓病肝陽上亢證大鼠經鉤藤、天麻、石決明干預后，體內的代謝輪廓均發(fā)生不同程度的變化，表明藥物對shr和高血壓病肝陽上亢證大鼠均有干預作用，在降血壓的同時調整肝陽上亢證的病理狀態(tài)。因此，我們通過對藥物干預后的高血壓病肝陽上亢證代謝數據集和肝陽上亢證代謝物數據集進行比對，篩查出經三種藥物干預后變化一致并趨于正常的代謝標志物，將高血壓病肝陽上亢證代謝數據集中鉤藤、天麻、石決明共同干預調整的標志物作為降血壓潛在生物標志物數據集；將肝陽上亢證代謝數據集中鉤藤、天麻、石決明共同干預調整的標志物作為平肝潛陽潛在生物標志物數據集。
（九）潛在生物標志物鑒定
本研究中我們對潛在代謝標記物標志物進行二級質譜（ms/ms）實驗，一部分代謝標志物是利用massfrontier7.0對獲得的二級質譜圖進行解析并與代謝組學數據庫中的結構進行比對來確定的，一部分代謝標志物過代謝組學數據庫信息、文獻報道和結構解析來確定。最終我們確定出了14個降血壓潛在生物標記物（表8）與23個平肝潛陽潛在生物標記物（表9），鉤藤、天麻、石決明對shr以及高血壓病肝陽上亢證大鼠降血壓潛在生物標志物數據集中的潛在代謝標記物干預情況見圖5，鉤藤、天麻、石決明對高血壓病肝陽上亢證大鼠平肝潛陽潛在生物標志物數據集中的潛在代謝標記物干預情況見圖6。
表8降血壓潛在標志物
表9平肝潛陽潛在標志物
至此，我們得到了能體現降血壓效應的潛在生物標志物與體現平肝潛陽效應的潛在生物標志物，這些標志物即為高血壓病肝陽上亢證與肝陽上亢證的潛在生物標志物。由于高血壓病肝陽上亢證潛在生物標志物中存在即能夠體現高血壓病的因子也存在能夠體現肝陽上亢證的因子，故將兩部分生物標志物合并為高血壓病肝陽上亢證潛在生物標志物數據集，共包含37個潛在生物標記物。
為進一步對37個潛在生物標志物判別高血壓病肝陽上亢證大鼠模型的能力進行評價，采用roc曲線進行評估,以曲線下面積（auc）的大小反映標志物診斷的準確度。一般而言，auc值越大，標志物臨床診斷準確性越高。表10展示了37個潛在生物標志物的auc值、靈敏度和特異度。發(fā)現其中有27個潛在生物標志物auc達到0.8以上，并且在最近臨界點處有較理想的靈敏度與特異度。
表10高血壓病肝陽上亢證潛在標志物roc曲線分析結果
在此基礎上，采用支持向量機（supportvectormachine，svm）對擬合的roc曲線進程評估，以進一步驗證潛在生物標志物對高血壓病肝陽上亢證大鼠模型的評價能力。由于若直接通過auc值選取標志物，則所納入的標志物是特定數據的最佳生物標志物，從而增加了過擬合的風險，導致評價結果過于樂觀，因此對標志物進行了篩選。根據文獻知識對27個標志物進行預判，選取pa(16:0/16:0)、tg(18:1(9z)/18:2(9z,12z)/20:0)[iso6]、ceramide(d18:1/12:0)、testosterone、androsterone、dihydrotestosterone、8(r)-hydroperoxylinoleicacid、tetrahydrodeoxycorticosterone、pe(16:0/15:0)、sm(d18:0/16:1(9z))、chenodeoxycholicacid、pc(18:4(6z,9z,12z,15z)/22:6(4z,7z,10z,13z,16z,19z))、lactosylceramide(d18:1/18:0)、glucosylceramide(d18:1/26:0)、3-o-sulfogalactosylceramide(d18:1/26:1(17z))、ceramide(d18:1/25:0)、9,10-dhome、7a-hydroxy-cholestene-3-one、calcidiol、7α-hydroxy-3-oxo-4-cholestenoate、calcitriol共21個生物標志物進行組合。由于本次研究納入的樣本量較少，為了產生平滑的roc曲線，進行100次交叉驗證，以結果的平均值產生roc曲線。結果如圖7所示，當21個生物標志組合在一起時，其auc為1.00。進一步通過svm用來進行分類評估，由圖8可知所選取的21個潛在生物標志物可準確將shr與高血壓病肝陽上亢證大鼠區(qū)分，兩者完全分離未出現交叉。
綜上，通過對高血壓病肝陽上亢證潛在生物標志物數據集進行roc曲線分析，最終確定27個潛在生物標志物作為評價高血壓肝陽上證大鼠模型的核心標志物。
（十）高血壓病肝陽上亢證大鼠模型判別系統(tǒng)構建
通過上述實驗，我們多層次的采集了高血壓病肝陽上亢證大鼠模型的宏觀表征、血液生化學以及代謝組學的特征數據，并從中提取了核心判別因子，在此基礎上以將所有數據導入simca-p軟件構建pls模型，以建立宏觀與微觀相結合的高血壓病肝陽上亢證大鼠模型的判別系統(tǒng)。
首先對變量進行標識，由于易激惹指標為計數資料，其他指標為計量資料，為避免對模型構建造成影響故未納入，其他所有指標變量標識見表11。
表11高血壓病肝陽上亢證模型指標變量標識表
采用vip＞1且具有95%置信區(qū)間的變量（見圖9）所對應的回歸系數建立高血壓病肝陽上亢證pls回歸模型（系數保留小數點后三位）：y=-0.030x28-0.037x23-0.032x2+0.027x12-0.025x27-0.040x24+0.038x11+0.020x56+0.020x46+0.020x48+0.020x57+0.018x58+0.020x55+0.018x52+0.018x50+0.032x15+0.017x49+0.021x14-0.024x26+0.024x59+0.029x13+0.014x47+0.016x54-0.025x29-0.043x6+0.014x51-0.030x1-0.024x36-0.031x7+0.041x17+0.017x53+0.009x45+0.008x44。
綜上，本課題組將中醫(yī)傳統(tǒng)四診診療觀念與現代科學技術相結合，多層次的采集大鼠的宏觀體征表現、血液生化指標，代謝組學數據，通過對數據的整合分析，得出高血壓病肝陽上亢證大鼠模型的判別系統(tǒng)，確定出高血壓病肝陽上亢證大鼠模型以血壓較高同時伴有痛閾、旋轉時間、飲水量與面溫指標的明顯變化為宏觀特征，以體內神經酰胺、睪酮、雄激素、二氫睪酮、四氫脫氧皮質酮、鵝去氧膽酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、鞘磷脂等在內的27個潛在生物標志物異常擾動為微觀特征，并借助pls分析方法初步構建了高血壓病肝陽上亢證大鼠模型的判別系統(tǒng)。該高血壓病肝陽上亢證大鼠模型的判別系統(tǒng)既具有高血壓病的病理特點又能體現肝陽上亢證的特征，借助該判別系統(tǒng)將有助于深入探討治療高血壓病肝陽上亢證中藥復方的方-證相關效應物質基礎和作用機理。
實施例2判別方法的驗證
為了檢驗所構建的模型對未知樣本的預測能力，本研究在建模時引入了7個獨立樣本作為測試集，分別為來自隨機選取的1個病證組樣本和6個藥物干預組樣本，從而保證了所構建模型預測能力的客觀性。結果見圖10，可見模型組與病證組明顯分開，表明shr與高血壓病肝陽上亢證大鼠的病理情況不同。pls模型r2y為99.0%，q2為97.9%，表明模型有較好的預測能力且預測準確率較高。同時可以觀察到，測試集的1個病證樣本準確的落在病證組區(qū)域，而6個藥物干預組與病證組相互分離，單獨分布，反應了所構建模型對未知樣本的準確預測。
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