重組人源細(xì)胞珠蛋白在制備治療高血脂癥及動(dòng)脈粥樣硬化藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了重組人源細(xì)胞珠蛋白在制備治療高血脂癥及動(dòng)脈粥樣硬化藥物中的應(yīng)用。發(fā)明人分別建立高血脂大鼠模型和動(dòng)脈粥樣硬化大鼠模型，通過皮下注射rhCYGB進(jìn)行治療。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，rhCYGB藥物無毒性，與模型對(duì)照組相比，rhCYGB治療組有顯著的改善，其血脂四項(xiàng)較模型組明顯減少，而藻雙酯鈉治療組血脂四項(xiàng)明顯高于正常，故rhCYGB治療高脂飲食引起的高血脂比藻酸雙酯鈉藥效更好。動(dòng)脈粥樣硬化大鼠模型中，治療組與模型對(duì)照組相比較，其血脂四項(xiàng)也有明顯減少，并且動(dòng)脈粥樣斑塊也有明顯減少。因而采用重組人源細(xì)胞珠蛋白治療高血脂癥及動(dòng)脈粥樣硬化具有低毒、安全、有效的優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及重組人源細(xì)胞珠蛋白的新用途，特別涉及重組人源細(xì)胞珠蛋白在制備 治療高血脂癥及動(dòng)脈粥樣硬化藥物中的應(yīng)用。 重組人源細(xì)胞珠蛋白在制備治療高血脂癥及動(dòng)脈粥樣硬化 藥物中的應(yīng)用

【背景技術(shù)】
[0002] 據(jù)有關(guān)報(bào)道，高脂血癥與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。高血脂癥的主要 危害是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化，進(jìn)而導(dǎo)致眾多的相關(guān)疾病，其中最常見的一種致命性疾病就是 冠心病。動(dòng)脈粥樣硬化并發(fā)的心絞痛、心肌梗死、腦中風(fēng)、腎功能不全、偏癱等常為中老年患 者的主要死亡原因。很多醫(yī)生認(rèn)為有效治療高血脂非常有利于預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。
[0003] 高脂血癥表現(xiàn)為脂肪代謝或運(yùn)轉(zhuǎn)異常使血漿中的一種或多種脂質(zhì)含量高于正常 值。關(guān)于高脂血癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)，目前國內(nèi)和國際尚無統(tǒng)一的方法。既往認(rèn)為血漿總膽固醇濃 度>5. 17mmol/L (200mg/dl)可定為高膽固醇血癥，血楽甘油三酯濃度>2. 3mmol/L (200mg/ dl)為商甘油二醋血癥。大量進(jìn)食商脂飲食、抽煙、缺少運(yùn)動(dòng)、精神壓力、遺傳因素等會(huì)造成 高血脂癥，其中大量進(jìn)食高脂食物是高血脂的一個(gè)重要因素。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國血脂異?；颊咭?高達(dá)1. 6億，35歲以上的人群中有2500萬人同時(shí)患有高血壓和高脂血癥。因此，正確認(rèn)識(shí) 高血脂癥，及時(shí)診斷和治療，具有重要意義。
[0004] 正常人的血脂主要包括膽固醇（或稱總膽固醇TC)和甘油三酯，在血循環(huán)中以非 游離狀態(tài)存在，和蛋白結(jié)合成脂蛋白這樣的大分子運(yùn)輸。主要的脂蛋白分為乳糜微粒、極低 密度（前-β)脂蛋白（VLDL)、低密度（β_)脂蛋白（LDL)和高密度（a_)脂蛋白（HDL)，這 些蛋白是緊密相聯(lián)的。高脂血癥常為高脂蛋白血癥（hyperlipoproteinemia),表現(xiàn)為高膽 固醇血癥、高甘油三酯血癥或兩者兼有，臨床上分為兩類：①原發(fā)性，罕見，屬遺傳性脂代謝 紊亂疾??；②繼發(fā)性，常見于高脂飲食、抽煙、飲酒、控制不良糖尿病、甲狀腺功能減退癥、腎 病綜合征、膽道阻塞等。其發(fā)病機(jī)理存在多種假說：有人認(rèn)為是LDL受體功能下降，LDL排 除障礙；有人認(rèn)為由VLDL產(chǎn)生過多或清除障礙以及VLDL轉(zhuǎn)變成LDL過多所致LDL受體清 除不力。由于高脂血癥是一種慢性病，而現(xiàn)有的高脂血癥動(dòng)物模型普遍采用高脂的乳糜灌 胃，對(duì)動(dòng)物體的刺激大，同時(shí)，灌胃對(duì)動(dòng)物的刺激大，導(dǎo)致動(dòng)物精神緊張，動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)及 內(nèi)分泌系統(tǒng)受到一定影響，得到的動(dòng)物模型與真實(shí)發(fā)展而成的飲食性高脂血癥存在較大的 區(qū)別，這也給飲食性高脂血癥的藥物篩選帶來了一定程度的影響。
[0005] 動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis, AS)是動(dòng)脈硬化的血管病中常見的最重要的一 種，其特點(diǎn)是受累動(dòng)脈病變從內(nèi)膜開始，一般先有脂質(zhì)和復(fù)合糖類積聚、出血及血栓形成， 纖維組織增生及鈣質(zhì)沉著，并有動(dòng)脈中層的逐漸蛻變和鈣化，病變常累及彈性及大中等肌 性動(dòng)脈，一旦發(fā)展到足以阻塞動(dòng)脈腔，則該動(dòng)脈所供應(yīng)的組織或器官將缺血或壞死。由于在 動(dòng)脈內(nèi)膜積聚的脂質(zhì)外觀呈黃色粥樣，因此稱為動(dòng)脈粥樣硬化。動(dòng)脈粥樣硬化在西方發(fā)達(dá) 國家為高發(fā)疾病。隨著中國人民生活水平提高和飲食習(xí)慣的改變，該病也成為中國的高發(fā) 疾病。臨床上選擇性地做心電圖，放射性核素心、腦、腎等臟器掃描，多普勒超聲檢查，以及 選擇性血管造影等，便可作出初步診斷。目前動(dòng)脈粥樣硬化的常規(guī)治療就是：合理飲食、適 當(dāng)運(yùn)動(dòng)加以藥物治療。
[0006] 根據(jù)WHO的調(diào)查，因?yàn)樾詣e、遺傳、年齡的差異，目前高血脂癥和動(dòng)脈粥樣硬化都 并未有非?？煽坑行У闹委煼桨浮ｈb于中藥成分復(fù)雜，制備工藝不夠成熟穩(wěn)定，西藥的副作 用明顯，開發(fā)出真正安全無毒有效防治高血脂癥和動(dòng)脈粥樣硬化的藥物，是一個(gè)非常有現(xiàn) 實(shí)意義和使用價(jià)值的研究。
[0007] 細(xì)胞珠蛋白（cytoglobin)是人體固有的保護(hù)性蛋白，對(duì)機(jī)體無毒副作用。細(xì) 胞珠蛋白最初由Kawada等在大鼠 HSC中發(fā)現(xiàn)，其在硫代乙酰胺脅迫誘導(dǎo)的纖維化肝臟星 狀細(xì)胞（HSC)中表達(dá)明顯增加，因而起初被命名為HSC激活相關(guān)蛋白（Stellate cell activation-associated protein, STAP)。蛋白測序表明它屬于新的一類含血紅素的六配 位蛋白（Hexacoordinate globin super-family)，是哺乳動(dòng)物中四種球蛋白（Globin)之 一。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)STAP不僅存在于HSC中，還普遍存在于人類多種器官組織以及腎臟 和胰臟的類成纖維細(xì)胞中，因而將其統(tǒng)一稱為細(xì)胞珠蛋白（Cytoglobin，Cygb)。細(xì)胞珠蛋 白由190個(gè)氨基酸殘基組成，分子量是21. 4kD，定位于染色體17q25。目前的研究表明Cygb 具有過氧化酶的作用、活性氧清除劑的作用及一氧化氮加雙氧酶功能，基因上具有保守的 組織缺氧反應(yīng)元件（HRE)，其3 ' UTR同時(shí)還含有組織缺氧誘導(dǎo)的mRNA穩(wěn)定信號(hào)（HIPBS)， 可保證Cygb基因在組織缺氧時(shí)的表達(dá)和穩(wěn)定性。在各種應(yīng)激情況下如缺血、氧化應(yīng)激及纖 維化時(shí)，Cygb表達(dá)增加。與球蛋白家族的其他成員一樣，Cygb具有保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激 的損傷，體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)表明外源性過表達(dá)rhCygb可保護(hù)肝星狀細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷 并且抑制其向纖維樣細(xì)胞分化。迄今未有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)人源珠蛋白具有改善或治療高脂血癥和 動(dòng)脈粥樣硬化的作用。
[0008] 由于人類Cygb與大鼠 Cygb在基因序列上具有97%的同源性，故本發(fā)明采用來源 于人的細(xì)胞珠蛋白（重組人源細(xì)胞珠蛋白，rhCygb)蛋白進(jìn)行大鼠模型的治療實(shí)驗(yàn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于提供重組人源細(xì)胞珠蛋白（rhCygb)在制備治療心血管疾病藥 物中的應(yīng)用，所述心血管疾病優(yōu)選為高血脂癥、動(dòng)脈粥樣硬化。
[0010] 發(fā)明人分別建立高血脂大鼠模型和動(dòng)脈粥樣硬化大鼠模型，通過皮下注射rhCYGB 進(jìn)行治療。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，rhCYGB藥物無毒性，與模型對(duì)照組相比，rhCYGB治療組有顯著的 改善，其血脂四項(xiàng)較模型組明顯減少，而藻雙酯鈉治療組血脂四項(xiàng)明顯高于正常，故rhCYGB 治療高脂飲食引起的高血脂比藻酸雙酯鈉藥效更好。動(dòng)脈粥樣硬化大鼠模型中，治療組與 模型對(duì)照組相比較，其血脂四項(xiàng)也有明顯減少，并且動(dòng)脈粥樣斑塊也有明顯減少。因而采用 重組人源細(xì)胞珠蛋白治療高血脂癥及動(dòng)脈粥樣硬化具有低毒、安全、有效的優(yōu)點(diǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011] 圖1為rhCygb治療組和藻酸雙酯鈉治療組的大鼠肝臟病理觀察結(jié)果。
[0012] 圖2為模型對(duì)照組和正常對(duì)照組的大鼠肝臟病理觀察結(jié)果。
[0013] 圖3為大鼠動(dòng)脈標(biāo)本病理觀察結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0014] 一、高血脂大鼠模型試驗(yàn) 1、動(dòng)物建模： 將體重為200?250g的清潔級(jí)健康成年雄性SD大鼠50只按完全隨機(jī)方法分為2組， 正常對(duì)照組10只，造模組40只。
[0015] 正常對(duì)照組：投喂普通顆粒飼料，自由攝食，平均每天每只約20克左右。
[0016] 模型組：投喂高脂飼料(高脂飼料為實(shí)驗(yàn)室自選配方，并由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 中心制作：85%基礎(chǔ)飼料，4%膽固醇，10%豬油，0. 2%丙硫氧嘧啶，0. 5%膽鹽)，自由攝食，平 均每天每只約20克左右。造模4周。
[0017] 40只造模組大鼠經(jīng)過4周造模成功后，隨機(jī)選取10只采用尾部靜脈采血測量血脂 四項(xiàng)，測量結(jié)果證實(shí)造模成功。
[0018] 2、動(dòng)物給藥： 40只造模組大鼠隨機(jī)分為3mg/kg rhCygb治療組（8只)、6mg/kg rhCygb治療組（8只)、 9mg/kg rhCygb治療組（8只)、陽性藥(藻酸雙酯鈉）治療組（8只)、模型對(duì)照組（8只）。 [0019] 正常對(duì)照組：一直投喂普通顆粒飼料。
[0020] 模型對(duì)照組：在實(shí)驗(yàn)期間持續(xù)投喂高脂飼料。
[0021] rhCygb治療組：造模成功后，分別給予rhCygb 3mg/kg、6mg/kg、9mg/kg的劑量皮 下注射，1次/天，共治療1個(gè)月。在實(shí)驗(yàn)期間持續(xù)投喂高脂飼料。
[0022] 藻酸雙酯鈉治療組：造模成功后，給予藻酸雙酯鈉9mg/kg. d劑量皮下注射，1次/ 天，共治療1個(gè)月。在實(shí)驗(yàn)期間持續(xù)喂高脂飼料。
[0023] 各組動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物房保持安靜，自然采光，溫度25°C左右。
[0024] 3、急性毒性試驗(yàn)： Cygb是機(jī)體固有的保護(hù)性蛋白，基本對(duì)機(jī)體無毒副作用。急性毒性試驗(yàn)結(jié)果也表明： 一日內(nèi)給小鼠灌胃rhCygb 500. Omg/kg，連續(xù)觀察七天，小鼠一般狀況良好，無一死亡，說明 rhCygb低毒、安全。
[0025] 4、藥效結(jié)果： (1)動(dòng)物一般情況的觀察 正常對(duì)照組大鼠進(jìn)食、生長正常，皮毛整潔，毛色潤澤，對(duì)外界環(huán)境的刺激反應(yīng)迅速，無 死亡。造模期間，造模組食欲下降，精神萎靡，后期皮毛不整且晦暗無光澤，進(jìn)食量及飲水量 明顯少于正常對(duì)照組，體重增長緩慢。
[0026] 治療期間，rhCygb治療組進(jìn)食量漸增多，反應(yīng)漸靈敏，活動(dòng)較前增多。藻酸雙酯鈉 治療組癥狀稍改善，但不及rhCygb治療組改善明顯。治療期間，無大鼠死亡。
[0027] 結(jié)論：重組人源細(xì)胞珠蛋白藥物無毒性。
[0028] ( 2 )大鼠血脂四項(xiàng)的檢測 各組間血脂水平比較，單因素方差分析結(jié)果見表1。
[0029] 表1 rhCYGB對(duì)大鼠血脂四項(xiàng)的影響（Γ ±s)

【權(quán)利要求】
1. 重組人源細(xì)胞珠蛋白在制備治療心血管疾病藥物中的應(yīng)用。
2. 重組人源細(xì)胞珠蛋白在制備治療商血脂癥中的應(yīng)用。
3. 重組人源細(xì)胞珠蛋白在制備治療動(dòng)脈粥樣硬化藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K38/17GK104096218SQ201410247879
【公開日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2014年6月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月5日
【發(fā)明者】董文其, 歐玲伶, 魏威, 李珍, 王萍 申請(qǐng)人:董文其