用于乳腺癌的piRNA的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于乳腺癌的piRNA，其來自人乳腺癌細胞，包含SEQIDNO.1所示序列，定位于人染色體1q25，其前體序列為snoRNA。Northernblot和定量RT-PCR檢測結(jié)果表明該piRNA在乳腺癌組織中低表達。本發(fā)明提供的piRNA可用于制備治療乳腺癌疾病的藥物。例如，采用基因治療的方法，以質(zhì)粒或者病毒為表達載體，使其在癌變部位高效表達。
【專利說明】用于乳腺癌的piRNA

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學及生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及人源piRNA寡核苷酸序列以及 其在制備治療乳腺癌疾病藥物中的用途。

【背景技術(shù)】
[0002] piRNA (PlWI-interacting RNA)是一類具有 26 ?32nt 的 RNA 分子，經(jīng)由其前體 分子在酶的作用下加工生成的，其前體序列一般為長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, IncRNA)，目前認為piRNA的功能是參與生命的一些基本過程，如分化發(fā)育等，越來越多的 證據(jù)表明PiRNA在細胞中起著調(diào)控基因表達的重要作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)piRNA與腫瘤的 發(fā)生發(fā)展有緊密的相關(guān)性，一些PiRNA可以顯著的抑制腫瘤生長。腫瘤相關(guān)的piRNA的發(fā) 現(xiàn)可能會對腫瘤的基因治療產(chǎn)生重大的影響。通過對腫瘤和正常組織的小RNA高通量測序 分析，可以鑒定腫瘤相關(guān)的PiRNA，通過引入對腫瘤細胞過表達小RNA可以有效抑制腫瘤的 生長。因此，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞中的PiRNA以及基于piRNA的腫瘤治療具有十分重要的意義。
[0003] 近四十年來關(guān)于腫瘤學的大量而迅速的研究，極大擴展了我們對于腫瘤理解的深 入程度以及復雜性。腫瘤疾病涉及到整個基因組動態(tài)改變的復雜過程，比如各種突變引起 的抗癌基因與促癌基因功能的紊亂。乳腺癌是全球高發(fā)腫瘤類型之一。盡管目前一些治療 手段可以幫助大多數(shù)腫瘤患者緩解痛苦，但乳腺癌仍極大威脅著女性生命安全，導致生活 質(zhì)量下降。每一年，全世界范圍內(nèi)有超過一百三十萬的乳腺癌新發(fā)病例，有四十五萬人死于 此病癥。建立發(fā)現(xiàn)更多的新的可以用于乳腺癌預防及治療的靶點有重大意義，也仍面臨著 巨大挑戰(zhàn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種PiRNA寡核苷酸序列及其在制備治療乳腺癌疾病藥物 中的用途。
[0005] 本發(fā)明以人乳腺癌和癌旁組織為材料進行deep-sequencing的小分子RNA高通 量測序以及mRNA芯片表達譜分析，采用分子生物學以及生物信息學常規(guī)技術(shù)進行試驗以 及分析，得到了一條28nt的RNA分析，經(jīng)過Blast比對，Northern blot雜交，及RNA共沉 淀實驗得到證實其為piRNA分子，命名為pi-sno75。Pi-sno75是由其前體snoRNA75在細 胞內(nèi)經(jīng)過加工后形成的成熟體，經(jīng)過基因序列的同源性分析獲得snoRNA的前體RNA序列。 此外，針對該PiRNA序列設(shè)計其2'-0_甲基化修飾的化學合成小分子RNA，并研究其對乳腺 癌細胞生長的影響進行了分析。
[0006] 本發(fā)明所提供的piNA來自人乳腺癌細胞，成熟piRNA序列長度為28nt，其前體序 列為snoRNA。Northern blot和定量RT-PCR檢測結(jié)果表明該piRNA在乳腺癌組織中低表 達。構(gòu)建pi-sn〇75高表達的乳腺癌細胞系，結(jié)果表明在與多柔比星聯(lián)用條件下，可以顯著 抑制乳腺癌細胞的生長增殖?；谏鲜龉ぷ鞅景l(fā)明得以完成。
[0007] 具體的說，本發(fā)明所提供的人源piRNA--pi-sno75包含如下序列：5'-GGGAUUUC UGAAAUUCUAUUCUGAGGCU-3 '，定位于人染色體1 q25。其中，序列中的U可用T替換。
[0008] 本發(fā)明所提供的人源piRNA可采用化學合成的方法得到，為增強其穩(wěn)定性，生物 利用度等藥學特征，可對其進行氧甲基化修飾。
[0009] 本發(fā)明提供的piRNA可用于制備治療乳腺癌疾病的藥物。例如，采用基因治療的 方法，以質(zhì)粒或者病毒為表達載體，使其在癌變部位高效表達。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010] 圖1、Northern blot檢測pi_sno75在乳腺癌組織中的表達； 圖2、定量PCR檢測pi-sn〇75在乳腺癌及癌旁組織中的表達； 圖3、過表達pi-sn〇75及聯(lián)合應用多柔比星抑制MCF7細胞的增殖(其中A為過表達 pi-sno75對MCF7細胞增殖的抑制作用，B為過表達pi-sno75及聯(lián)合應用多柔比星對MCF7 細胞增殖的抑制作用）； 圖4、pi-sn〇75過表達細胞系在體內(nèi)與多柔比星聯(lián)合給藥對乳腺癌的抑制效果。

【具體實施方式】
[0011] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。
[0012] 實驗一乳腺癌組織以及癌旁組織的deep-sequencing以及乳腺癌中pi_sno75 表達的Northern blot驗證 我們從中山大學附屬第一醫(yī)院女性乳腺癌患者術(shù)后摘除腫瘤組織中，分離500mg腫 瘤組織以及200mg癌旁組織。分離后液氮冷凍保存。研磨均勻的組織（〈100 mg)加 lmL Trizol溶解，吹打至散，室溫放置5分鐘；加氯仿200 μ 1，劇烈振蕩60秒；靜置5分鐘，然 后4°C，12000g，離心15分鐘；轉(zhuǎn)移上清到新的ΕΡ管中，加異丙醇500μ 1，混勻，放置10分 鐘；4°C，12000g，離心10分鐘；棄上清，加75 %乙醇1000 μ 1，洗兩次，4°C，12000g，離心5分 鐘；棄上清，室溫干燥。用DEPC水溶解RNA，檢測純度和濃度。樣品合格后，寄到深圳華大 基因公司做小分子RNA深度測序，測定小分子RNA長度范圍是18-40bp。測序結(jié)果由華大 公司進行分析比對。其中得到一條來自snoRNA75的piRNA序列（如SEQ ID NO. 1所示)，命 名為pi-sno75。長度為28nt。以【γ-32Ρ】ΑΤΡ標記pi-sno75反向互補LNA雜交檢測探 針，按照常規(guī)Northern blot方法檢測pi-sno75在人乳腺癌細胞中的表達。由圖1可知， pi-sn〇75在乳腺癌組織的中確實有表達。
[0013] 實驗二乳腺癌組織以及癌旁組織中pi-sn〇75表達情況分析 以乳腺癌組織以及對應癌旁組織為材料，利用上述方法提取RNA，按照TakaraRT反轉(zhuǎn) 錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄試驗，cDNA產(chǎn)物利用Takara SYBR real-time試劑盒進行定量PCR檢 測。GAPDH作為內(nèi)參。成對T-test進行統(tǒng)計學分析。由圖2可知，pi-sno75在乳腺癌的表 達較其癌旁組織中的表達要低。
[0014] 實驗三體外pi_sno75對乳腺癌細胞系MCF7誘導凋亡情況檢測 人的 MCF7 細胞培養(yǎng)在 10% 血清濃度的 DMEM(D μ lbecco' s modified Eagle's medium) 中。采用Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen)轉(zhuǎn)染試劑進行小RNA轉(zhuǎn)染。具體操作按 照使用說明進行。轉(zhuǎn)染后36h加入多柔比星5 μ M。MCF細胞用不含EDTA的胰酶消化收集， 用PBS洗滌細胞二次（2000rpm離心5min)收集1?5Χ 105細胞；加入500 μ L的Binding Buffer懸浮細胞；加入5μ? Annexin V-FITC混勻后，加入5 μ? Propidium Iodide,混勻； 室溫、避光、反應5?15min，然后進行流式細胞儀的觀察和檢測(激發(fā)波長Ex=488 nm ;發(fā)射 波長Em=530 nm ;熒光補償調(diào)節(jié)：使用未經(jīng)凋亡誘導處理的正常細胞，作為對照進行熒光補 償調(diào)節(jié)去除光譜重疊和設(shè)定十字門的位置)，結(jié)果顯示在多柔比星存在條件下，pi-sn 〇75顯 著引起凋亡(見圖3)。
[0015] 實驗四體內(nèi)pi_sno75對乳腺癌細胞系MCF7誘導凋亡情況檢測 構(gòu)建過表達pi_sn〇75的乳腺癌細胞系，利用上邊的質(zhì)粒，包含pi-sn〇75的內(nèi)含 子片段插入在慢病毒載體中，其位置處于CMV啟動子之后，ires-gfp之前。構(gòu)建好的 pHIV-cPPT-GFP-pi-sno75 與空白載體，分別同 pCMV-Δ R8. 2 和 pCMV-VSV-G 共轉(zhuǎn)染 HEK293T 包裝假病毒，之后用PEG6000濃縮病毒，感染MCF7細胞。流式分選GFP陽性細胞（FACS Aria II，Becton Dickinson)，培養(yǎng)擴增。選擇5周齡左右的雌性N0D/SCID小鼠，在同一只小鼠 的左右兩側(cè)乳腺組織附近分別注射等量過表達的pi_sn 〇75細胞系與對照載體細胞系。當 成瘤直徑大小在5mm左右時，每周通過小鼠尾靜脈注射doxorubicin (2mg/kg)。給藥后， 腫瘤的生長速度變慢，在首次給藥四周后，我們從小鼠體內(nèi)取出腫瘤及稱量濕重。Pi-sn〇75 過表達的細胞系成瘤大小比空白載體顯著性的小，且質(zhì)量輕(見圖4)。
[0016] 綜合細胞實驗與動物模型實驗，pi-sn〇75在于抗腫瘤藥物聯(lián)合使用下，體內(nèi)體外 結(jié)果表明可以顯著誘導乳腺癌凋亡并抑制腫瘤增殖。 <110>中山大學 〈120>用于乳腺癌的piRNA <130> <160> 1 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 28 <212> RNA <213> human <400> 1 gggauuucug aaauucuauu cugaggcu 28
【權(quán)利要求】
1. 一種piRNA，其包含如下序列： 5' -GGGAUUUCUGAAAUUCUAUUCUGAGGCU-3'（SEQ ID NO. 1)，其中，U 可用 T 替換。
2. 含有權(quán)利要求1所述piRNA的質(zhì)?；虿《据d體。
3. 權(quán)利要求1所述的piRNA在制備治療乳腺癌疾病的制劑或藥物中的應用。
4. 權(quán)利要求1所述的piRNA和其他抗腫瘤藥物聯(lián)用在制備治療乳腺癌疾病的制劑或藥 物中的應用。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應用，其特征在于，所述其他抗腫瘤藥物為多柔比星。
6. 權(quán)利要求2所述的質(zhì)?；虿《据d體在制備治療乳腺癌疾病的制劑或藥物中的應用。
【文檔編號】A61P35/00GK104099333SQ201410247837
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年6月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月5日
【發(fā)明者】張輝, 何欣, 陳欣欣, 張雪 申請人:中山大學