本發(fā)明涉及DNA提取技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及全血DNA提取試劑盒及其提取方法。

背景技術(shù)：

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基因組水平上的研究已成為熱點(diǎn)。在分子遺傳學(xué)和分子流行病學(xué)中，無(wú)論是全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)、候選SNP位點(diǎn)基因分型，還是基因組文庫(kù)的建立，都需要從各類(lèi)樣本中提取基因組DNA。由于血液樣本取材方便，所含基因組DNA豐富可靠，因此上述許多研究均以血液作為樣本提取完整的基因組DNA。提取純化得到的基因組DNA濃度、純度和一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性都會(huì)影響到后續(xù)的研究，因此高效、可靠的基因組DNA提取方法是分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)研究迫切需要的。

目前基因組DNA提取純化的方法有很多種，如苯酚氯仿抽提法、SDS法、離心柱法和磁珠法。這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，但都應(yīng)考慮以下原則：防止和抑制DNase對(duì)DNA的降解；盡量減少對(duì)溶液中DNA的機(jī)械剪切破壞，保持DNA分子的完整；排除其他核酸分子的污染；排除有機(jī)溶劑和金屬離子的污染；將蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、糖類(lèi)等物質(zhì)分離干凈。

基于納米磁珠的DNA提取技術(shù)是利用親水性納米磁珠特異性地吸附樣品溶液的DNA分子，在外加磁場(chǎng)的作用將吸附的DNA-磁珠復(fù)合物從樣品溶液中分離，通過(guò)洗滌液洗滌去除溶液中的蛋白和鹽離子，最后在僅留有特異吸附DNA的磁珠中加入洗脫液，將DNA釋放于洗脫液中。磁珠法提取基因組DNA與上述其它方法相比，不使用有毒試劑，操作簡(jiǎn)單，不易污染，已經(jīng)成為目前分子生物學(xué)和臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究的理想方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述不足的缺陷，本發(fā)明提供了一種全血DNA提取試劑盒及提取方法，提取純化步驟少，操作簡(jiǎn)便，整個(gè)過(guò)程不涉及有毒試劑，安全便捷，所得基因組DNA含量高，完整度好，純度高，可直接用于后續(xù)檢測(cè)。

本發(fā)明提供了一種全血DNA提取試劑盒，包括裂解液、納米磁珠、洗滌液A、洗滌液B和洗脫液。

上述的試劑盒，其中，所述裂解液包括異硫氰酸胍、碘化鋰、檸檬酸三鈉、Tween 20，所述納米磁珠包括包裹有二氧化硅的Fe₃O₄,洗滌液A包括異硫氰酸胍、Tris-HCL和無(wú)水乙醇，所述洗滌液B包括Tris-HCL、NaCL和無(wú)水乙醇，所述洗脫液包括Tris-HCL、EDTA二鈉。

上述的試劑盒，其中，所述裂解液pH值為4.0-7.0，包含濃度3-5mM的異硫氰酸胍、濃度1-5M的碘化鋰、濃度50-200mM的檸檬酸三鈉和1％-5％Tween20。

上述的試劑盒，其中，所述納米磁珠包括包裹有二氧化硅的Fe₃O₄，直徑為200-2000nm，濃度為50-200mg/ml。

上述的試劑盒，其中，所述洗滌液A包含濃度1-4mM的異硫氰酸胍、pH 7.0-9.0濃度10-50mM的Tris-HCL和20％-50％的無(wú)水乙醇。

上述的試劑盒，其中，所述洗滌液B包含pH 7.0-9.0濃度1-5mM的Tris-HCL、濃度10-50mMNaCL和50％-80％的無(wú)水乙醇。

上述的試劑盒，其中，所述洗脫液包含pH為7.0-9.0濃度5-20mM的Tris-HCL和pH 8.0-9.0濃度0.5-3mM的EDTA二鈉。

本發(fā)明的另一面，本發(fā)明還提供了一種全血DNA提取試劑盒的提取方法，包括以下步驟：

步驟S1：取50-200ul新鮮全血樣本于1.5ml離心管中，使用無(wú)菌移液槍頭向該離心管中加入100-500ul裂解液和50-200mg/ml的納米磁珠10-30ul，震蕩混勻1min，室溫靜置10min；

步驟S2：將步驟S1中的離心管置于磁力架上30s，待納米磁珠完全吸至管壁之后，使用無(wú)菌移液槍頭吸棄上清溶液；

步驟S3：使用無(wú)菌移液槍頭向步驟S2離心管中加入500-800ul洗滌液A，將該離心管震蕩混勻1min，置于磁力架上30s，待納米磁珠完全吸至管壁之后，使用無(wú)菌移液槍頭吸棄上清溶液；

步驟S4：使用無(wú)菌移液槍頭向步驟S3離心管中加入500-800ul洗滌液B，將該離心管震蕩混勻1min，置于磁力架上30s，待納米磁珠完全吸至管壁之后，使用無(wú)菌移液槍頭吸棄上清溶液，室溫開(kāi)蓋干燥10-20min直至管內(nèi)無(wú)液體殘留；

步驟S5：使用無(wú)菌移液槍頭向步驟S4離心管中加入100-200ul洗脫液，65℃水浴5-10min；

步驟S6：將步驟S5離心管震蕩混勻1min，置于磁力架上30s，待納米磁珠完全吸至管壁之后，使用無(wú)菌移液槍頭吸取上清至新的離心管，即獲得基因組DNA。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：提取純化步驟簡(jiǎn)單、操作過(guò)程安全便捷、基因組DNA產(chǎn)物含量高，完整度好，純度高。通過(guò)簡(jiǎn)單的操作步驟得到高純度、完整的基因組DNA，方便研究人員進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

附圖說(shuō)明

通過(guò)閱讀參照以下附圖對(duì)非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明及其特征、外形和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯。在全部附圖中相同的標(biāo)記指示相同的部分。并未刻意按照比例繪制附圖，重點(diǎn)在于示出本發(fā)明的主旨。

圖1為本發(fā)明的全血DNA提取方法與QIAamp DNA Mini Kit和上海生工磁珠法基因組DNA抽提試劑盒(血液)提取方法的基因組DNA完整度比較示意圖。

圖2是本發(fā)明的全血DNA提取方法與QIAamp DNA Mini Kit和上海生工磁珠法基因組DNA抽提試劑盒(血液)提取方法的基因組DNA中β-actin熒光PCR Ct值比較示意圖。

具體實(shí)施方式

在下文的描述中，給出了大量具體的細(xì)節(jié)以便提供對(duì)本發(fā)明更為徹底的理解。然而，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)的是，本發(fā)明可以無(wú)需一個(gè)或多個(gè)這些細(xì)節(jié)而得以實(shí)施。在其他的例子中，為了避免與本發(fā)明發(fā)生混淆，對(duì)于本領(lǐng)域公知的一些技術(shù)特征未進(jìn)行描述。

為了徹底理解本發(fā)明，將在下列的描述中提出詳細(xì)的步驟以及詳細(xì)的結(jié)構(gòu)，以便闡釋本發(fā)明的技術(shù)方案。本發(fā)明的較佳實(shí)施例詳細(xì)描述如下，然而除了這些詳細(xì)描述外，本發(fā)明還可以具有其他實(shí)施方式。

本發(fā)明提供了一種全血DNA提取試劑盒，包括裂解液、納米磁珠、洗滌液A、洗滌液B和洗脫液。

在本發(fā)明一優(yōu)選但非限制的實(shí)施例中，裂解液包括異硫氰酸胍、檸檬酸三鈉、Tween 20，所述納米磁珠包括包裹有二氧化硅的Fe₃O₄,洗滌液A包括異硫氰酸胍、Tris-HCL和無(wú)水乙醇，所述洗滌液B包括Tris-HCL、NaCL和無(wú)水乙醇，洗脫液包括Tris-HCL、EDTA二鈉。

在本發(fā)明一優(yōu)選但非限制的實(shí)施例中，裂解液pH值為4.0-7.0，包含濃度3-5mM的異硫氰酸胍、濃度50-200mM的檸檬酸三鈉和1％-5％Tween 20。

在本發(fā)明一優(yōu)選但非限制的實(shí)施例中，納米磁珠包括包裹有二氧化硅的Fe₃O₄，直徑為200-2000nm，濃度為50-200mg/ml。

在本發(fā)明一優(yōu)選但非限制的實(shí)施例中，洗滌液A包含濃度1-4mM的異硫氰酸胍、pH 7.0-9.0濃度10-50mM的Tris-HCL和20％-50％的無(wú)水乙醇。

在本發(fā)明一優(yōu)選但非限制的實(shí)施例中，洗滌液B包含pH 7.0-9.0濃度1-5mM的Tris-HCL、濃度10-50mMNaCL和50％-80％的無(wú)水乙醇。

在本發(fā)明一優(yōu)選但非限制的實(shí)施例中，洗脫液包含pH為7.0-9.0濃度5-20mM的Tris-HCL和pH 8.0-9.0濃度0.5-3mM的EDTA二鈉。

本發(fā)明的另一面一種基因組DNA提取試劑盒的提取方法，包括以下步驟：

步驟S1：取50-200ul新鮮全血樣本于1.5ml離心管中，使用無(wú)菌移液槍頭向該離心管中加入100-500ul裂解液和50-200mg/ml的納米磁珠10-30ul，震蕩混勻1min，室溫靜置10min；

步驟S2：將步驟S1中的離心管置于磁力架上30s，待納米磁珠完全吸至管壁之后，使用無(wú)菌移液槍頭吸棄上清溶液；

步驟S3：使用無(wú)菌移液槍頭向步驟S2離心管中加入500-800u l洗滌液A，將該離心管震蕩混勻1min，置于磁力架上30s，待納米磁珠完全吸至管壁之后，使用無(wú)菌移液槍頭吸棄上清溶液；

步驟S4：使用無(wú)菌移液槍頭向步驟S3離心管中加入500-800u l洗滌液B，將該離心管震蕩混勻1min，置于磁力架上30s，待納米磁珠完全吸至管壁之后，使用無(wú)菌移液槍頭吸棄上清溶液，室溫開(kāi)蓋干燥10-20min直至管內(nèi)無(wú)液體殘留；

步驟S5：使用無(wú)菌移液槍頭向步驟S4離心管中加入100-200u l洗脫液，65℃水浴5-10min；

步驟S6：將步驟S5離心管震蕩混勻1min，置于磁力架上30s，待納米磁珠完全吸至管壁之后，使用無(wú)菌移液槍頭吸取上清至新的離心管，即獲得基因組DNA。

以下舉出本發(fā)明的具體實(shí)施例。

實(shí)施例1

1)取50ul新鮮全血樣本于1.5ml離心管中，使用無(wú)菌移液槍頭向離心管中加入200ul裂解液和50mg/ml的納米磁珠10ul。加納米磁珠之前可將納米磁珠充分混勻。震蕩混勻1min，室溫靜置10min。其中，裂解液內(nèi)加入的成分分別是：濃度3mM的異硫氰酸胍、濃度150mM的檸檬酸三鈉和2％Tween 20，其余成分為水。裂解液的pH值為6.0。

2)將該離心管置于磁力架上30s，待納米磁珠完全吸至管壁之后，使用無(wú)菌移液槍頭吸棄上清溶液。

3)從磁力架上取出離心管，使用無(wú)菌移液槍頭向該離心管中加入500ul洗滌液A，將該離心管震蕩混勻1min，置于磁力架上30s，待納米磁珠完全吸至管壁之后，使用無(wú)菌移液槍頭吸棄上清溶液。其中，洗滌液A內(nèi)加入的成分分別是：濃度1mM的異硫氰酸胍、pH 7.5且濃度15mM的Tris-HCL和50％的無(wú)水乙醇，其余成分為水。

4)從磁力架上取出離心管，使用無(wú)菌移液槍頭向該離心管中加入500ul洗滌液B，將該離心管震蕩混勻1min，置于磁力架上30s，待納米磁珠完全吸至管壁之后，使用無(wú)菌移液槍頭吸棄上清溶液。其中，洗滌液B內(nèi)加入的成分分別是：pH 7.5且濃度1mM的Tris-HCL、濃度10mM NaCL和80％的無(wú)水乙醇，其余成分為水。

5)從磁力架上取出離心管，室溫開(kāi)蓋干燥10min直至管內(nèi)無(wú)液體殘留。

6)使用無(wú)菌移液槍頭向該離心管中加入100ul洗脫液，65℃水浴10min。其中，洗脫液內(nèi)加入的成分分別是：pH 7.5且濃度5mM的Tris-HCL和pH 8.0且濃度2mM的EDTA二鈉，其余成分為水。洗脫液的pH值為8.0。

7)將該離心管震蕩混勻1min，置于磁力架上30s，待納米磁珠完全吸至管壁之后，使用無(wú)菌移液槍頭吸取上清至新的離心管，即獲得基因組DNA。

實(shí)施例2

1)取200ul新鮮全血樣本于1.5ml離心管中，使用無(wú)菌移液槍頭向離心管中加入500ul裂解液和200mg/ml的納米磁珠30ul。加納米磁珠之前可將納米磁珠充分混勻。震蕩混勻1min，室溫靜置10min。其中，裂解液內(nèi)加入的成分分別是：濃度5mM的異硫氰酸胍、濃度150mM的檸檬酸三鈉和2％Tween 20，其余成分為水。裂解液的pH值為6.0。

2)將該離心管置于磁力架上30s，待納米磁珠完全吸至管壁之后，使用無(wú)菌移液槍頭吸棄上清溶液。

3)從磁力架上取出離心管，使用無(wú)菌移液槍頭向該離心管中加入800ul洗滌液A，將該離心管震蕩混勻1min，置于磁力架上30s，待納米磁珠完全吸至管壁之后，使用無(wú)菌移液槍頭吸棄上清溶液。其中，洗滌液A內(nèi)加入的成分分別是：濃度1mM的異硫氰酸胍、pH 7.5且濃度15mM的Tris-HCL和50％的無(wú)水乙醇，其余成分為水。

4)從磁力架上取出離心管，使用無(wú)菌移液槍頭向該離心管中加入800ul洗滌液B，將該離心管震蕩混勻1min，置于磁力架上30s，待納米磁珠完全吸至管壁之后，使用無(wú)菌移液槍頭吸棄上清溶液。其中，洗滌液B內(nèi)加入的成分分別是：pH 7.5且濃度1mM的Tris-HCL、濃度10mM NaCL和80％的無(wú)水乙醇，其余成分為水。

5)從磁力架上取出離心管，室溫開(kāi)蓋干燥20min直至管內(nèi)無(wú)液體殘留。

6)使用無(wú)菌移液槍頭向該離心管中加入300ul洗脫液，65℃水浴10min。其中，洗脫液內(nèi)加入的成分分別是：pH 7.5且濃度5mM的Tris-HCL和pH 8.0且濃度2mM的EDTA二鈉，其余成分為水。洗脫液的pH值為8.0。

7)將該離心管震蕩混勻1min，置于磁力架上30s，待納米磁珠完全吸至管壁之后，使用無(wú)菌移液槍頭吸取上清至新的離心管，即獲得基因組DNA。

實(shí)施例3

1)取100ul新鮮全血樣本于1.5ml離心管中，使用無(wú)菌移液槍頭向離心管中加入300ul裂解液和100mg/ml的納米磁珠10ul。加納米磁珠之前可將納米磁珠充分混勻。震蕩混勻1min，室溫靜置10min。其中，裂解液內(nèi)加入的成分分別是：濃度5mM的異硫氰酸胍、濃度150mM的檸檬酸三鈉和2％Tween 20，其余成分為水。裂解液的pH值為6.0。

2)將該離心管置于磁力架上30s，待納米磁珠完全吸至管壁之后，使用無(wú)菌移液槍頭吸棄上清溶液。

3)從磁力架上取出離心管，使用無(wú)菌移液槍頭向該離心管中加入500ul洗滌液A，將該離心管震蕩混勻1min，置于磁力架上30s，待納米磁珠完全吸至管壁之后，使用無(wú)菌移液槍頭吸棄上清溶液。其中，洗滌液A內(nèi)加入的成分分別是：濃度1mM的異硫氰酸胍、pH 7.5且濃度15mM的Tris-HCL和50％的無(wú)水乙醇，其余成分為水。

4)從磁力架上取出離心管，使用無(wú)菌移液槍頭向該離心管中加入500ul洗滌液B，將該離心管震蕩混勻1min，置于磁力架上30s，待納米磁珠完全吸至管壁之后，使用無(wú)菌移液槍頭吸棄上清溶液。其中，洗滌液B內(nèi)加入的成分分別是：pH 7.5且濃度1mM的Tris-HCL、濃度10mM NaCL和80％的無(wú)水乙醇，其余成分為水。

5)從磁力架上取出離心管，室溫開(kāi)蓋干燥20min直至管內(nèi)無(wú)液體殘留。

6)使用無(wú)菌移液槍頭向該離心管中加入100ul洗脫液，65℃水浴10min。其中，洗脫液內(nèi)加入的成分分別是：pH 7.5且濃度5mM的Tris-HCL和pH 8.0且濃度2mM的EDTA二鈉，其余成分為水。洗脫液的pH值為8.0。

7)將該離心管震蕩混勻1min，置于磁力架上30s，待納米磁珠完全吸至管壁之后，使用無(wú)菌移液槍頭吸取上清至新的離心管，即獲得基因組DNA。

在本發(fā)明中，對(duì)照試劑1選用QIAampDNAMiniKit提取100ul新鮮全血樣本，洗脫體積為100ul。對(duì)照試劑2選用上海生工磁珠法基因組DNA抽提試劑盒(血液)提取100ul新鮮全血樣本，洗脫體積為100ul。

實(shí)施例4

1)取100ul新鮮全血樣本于1.5ml離心管中，使用無(wú)菌移液槍頭向離心管中加入100ul裂解液和100mg/ml的納米磁珠20ul。加納米磁珠之前可將納米磁珠充分混勻。震蕩混勻1min，室溫靜置10min。其中，裂解液內(nèi)加入的成分分別是：濃度5mM的異硫氰酸胍、濃度150mM的檸檬酸三鈉和2％Tween 20，其余成分為水。裂解液的pH值為6.0。

2)將該離心管置于磁力架上30s，待納米磁珠完全吸至管壁之后，使用無(wú)菌移液槍頭吸棄上清溶液。

3)從磁力架上取出離心管，使用無(wú)菌移液槍頭向該離心管中加入500ul洗滌液A，將該離心管震蕩混勻1min，置于磁力架上30s，待納米磁珠完全吸至管壁之后，使用無(wú)菌移液槍頭吸棄上清溶液。其中，洗滌液A內(nèi)加入的成分分別是：濃度1mM的異硫氰酸胍、pH 7.5且濃度15mM的Tris-HCL和50％的無(wú)水乙醇，其余成分為水。

4)從磁力架上取出離心管，使用無(wú)菌移液槍頭向該離心管中加入500ul洗滌液B，將該離心管震蕩混勻1min，置于磁力架上30s，待納米磁珠完全吸至管壁之后，使用無(wú)菌移液槍頭吸棄上清溶液。其中，洗滌液B內(nèi)加入的成分分別是：pH 7.5且濃度1mM的Tris-HCL、濃度10mM NaCL和80％的無(wú)水乙醇，其余成分為水。

5)從磁力架上取出離心管，室溫開(kāi)蓋干燥20min直至管內(nèi)無(wú)液體殘留。

6)使用無(wú)菌移液槍頭向該離心管中加入200ul洗脫液，65℃水浴10min。其中，洗脫液內(nèi)加入的成分分別是：pH 7.5且濃度5mM的Tris-HCL和pH 8.0且濃度2mM的EDTA二鈉，其余成分為水。洗脫液的pH值為8.0。

7)將該離心管震蕩混勻1min，置于磁力架上30s，待納米磁珠完全吸至管壁之后，使用無(wú)菌移液槍頭吸取上清至新的離心管，即獲得基因組DNA。

在本發(fā)明中，對(duì)照試劑1選用QIAamp DNA Mini Kit提取100ul新鮮全血樣本，洗脫體積為100ul。對(duì)照試劑2選用上海生工磁珠法基因組DNA抽提試劑盒(血液)提取100ul新鮮全血樣本，洗脫體積為100ul。

將實(shí)施例3、對(duì)照試劑1和對(duì)照試劑2，提取完成后，分別取基因組DNA溶液5ul做1.5％瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如附圖1所示。

參照?qǐng)D1所示，使用本發(fā)明建立的基于納米磁珠的全血DNA提取試劑盒及提取方法，將其實(shí)驗(yàn)結(jié)果與QIAamp DNA Mini Kit和上海生工磁珠法基因組DNA抽提試劑盒(血液)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較，結(jié)果表明，本發(fā)明提取的全血基因組DNA完整度與QIAamp DNA Mini Kit和上海生工磁珠法基因組DNA抽提試劑盒(血液)的基因組DNA完整度處于同一水平。而且具有提取純化步驟簡(jiǎn)單、操作過(guò)程安全便捷。

將實(shí)施例3、對(duì)照試劑1和對(duì)照試劑2，提取完成后，分別取基因組DNA溶液2ul，使用ThermoFisher的NanoDrop 2000超微量生物檢測(cè)儀檢測(cè)基因組DNA濃度和純度，結(jié)果如表1所示。

表1

參照表1所示，本發(fā)明提取的全血DNA的純度與QIAamp DNA Mini Kit和上海生工磁珠法基因組DNA抽提試劑盒(血液)的基因組DNA純度處于同一水平。對(duì)于基因組DNA的濃度明顯優(yōu)于對(duì)照試劑盒。

將實(shí)施例3、對(duì)照試劑1和對(duì)照試劑2，提取完成后，分別取基因組DNA溶液5ul做靶標(biāo)為β-action的熒光定量PCR，結(jié)果如附圖2和表2所示。

表2

參照?qǐng)D2和如表2所示，本發(fā)明提取的全血DNA的濃度明顯高于QIAamp DNA Mini Kit和上海生工磁珠法基因組DNA抽提試劑盒(血液)的基因組DNA濃度。

以上對(duì)本發(fā)明的較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實(shí)施方式，其中未盡詳細(xì)描述的設(shè)備和結(jié)構(gòu)應(yīng)該理解為用本領(lǐng)域中的普通方式予以實(shí)施；任何熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍情況下，都可利用上述揭示的方法和技術(shù)內(nèi)容對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案做出許多可能的變動(dòng)和修飾，或修改為等同變化的等效實(shí)施例，這并不影響本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容。因此，凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所做的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化及修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案保護(hù)的范圍內(nèi)。