本發(fā)明涉及一種可以形成脂滴的分化后的皮脂腺細(xì)胞的制造方法。

背景技術(shù)：

皮脂腺為多細(xì)胞性的胞狀腺體，從在毛孔的內(nèi)表面開口的皮脂腺開口部分泌皮脂。在皮脂腺中存在皮脂腺細(xì)胞，起到放出皮脂的作用。所分泌的皮脂對皮膚及毛發(fā)進(jìn)行保護(hù)及保濕。皮脂的分泌異常成為油性皮膚、干燥皮膚、粉刺、皮脂溢出癥、脂溢性皮炎、干皮病等皮膚病的原因。特別是粉刺是以青年人為中心、在世界中許多人體驗到的問題。

為了研究開發(fā)控制皮脂分泌的醫(yī)藥品或化妝品，能夠再現(xiàn)動物生物體的皮脂腺的行為的培養(yǎng)細(xì)胞模型的構(gòu)建是重要的。目前，作為可以利用于實驗的皮脂腺細(xì)胞株，已知有倉鼠皮脂腺細(xì)胞株。該細(xì)胞與生物體的皮脂腺細(xì)胞同樣地具有在細(xì)胞內(nèi)形成脂滴的優(yōu)點，另一方面，基因組信息未弄清，因此，不適于利用遺傳學(xué)方法的研究。

專利文獻(xiàn)1及非專利文獻(xiàn)1中公開有一種對皮脂腺的生理學(xué)檢查有用的、通過sv-40的巨大t抗原dna的轉(zhuǎn)染而永生化的源自人的皮脂腺細(xì)胞細(xì)胞株sz95。由于該細(xì)胞源自人，因此，基因組信息清楚，并且在增殖性高方面作為研究工具是有利的，另一方面，具有在細(xì)胞內(nèi)幾乎不形成脂滴的缺點。

除了專利文獻(xiàn)1及非專利文獻(xiàn)1所公開的sz95細(xì)胞以外，在以往的人皮脂腺細(xì)胞中存在如果在體外進(jìn)行培養(yǎng)則失去形成脂滴的能力的共同的問題。迄今為止，報道有將從人的皮膚中分離的皮脂腺細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時，雖然在細(xì)胞質(zhì)中可以看到脂質(zhì)的蓄積，但是，其量只不過是角化細(xì)胞的4～8倍左右，與在活體內(nèi)的皮脂腺細(xì)胞相比非常低，作為其原因，暗示在體外培養(yǎng)中皮脂腺細(xì)胞的分化變得不完全(非專利文獻(xiàn)2)。與該報道一致，報道有如果在上述sz95細(xì)胞中導(dǎo)入促進(jìn)上述sz95細(xì)胞向皮脂腺細(xì)胞的分化的myc基因，則在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)蓄積脂滴(非專利文獻(xiàn)3)。

在專利文獻(xiàn)2中提示有如下想法：在培養(yǎng)皮脂腺細(xì)胞中包含生物合成皮脂的分化后的細(xì)胞和具有增殖能力、但不具有皮脂的生物合成能力的未分化細(xì)胞；及培養(yǎng)皮脂腺細(xì)胞不產(chǎn)生皮脂是因為通過繼代培養(yǎng)僅增殖未分化細(xì)胞，生物合成皮脂的分化后的細(xì)胞減少。專利文獻(xiàn)2中還公開了通過將未分化的皮脂腺細(xì)胞進(jìn)行回轉(zhuǎn)培養(yǎng)，從而誘導(dǎo)該細(xì)胞的分化的方法。

非專利文獻(xiàn)4中報道有：在將非專利文獻(xiàn)1記載的源自人的皮脂腺細(xì)胞細(xì)胞株sz95用亞油酸進(jìn)行處理時，觀察到細(xì)胞內(nèi)的脂滴的蓄積。非專利文獻(xiàn)5中公開有由源自人耳前部的正常皮膚的皮脂腺細(xì)胞細(xì)胞株seb-1確認(rèn)了脂滴蓄積。

(專利文獻(xiàn)1)日本特表2002-535984號公報

(專利文獻(xiàn)2)日本特開平5-268948號公報

(非專利文獻(xiàn)1)jinvestdermatol,1999,113:1011-1120

(非專利文獻(xiàn)2)dermatology,1998,196:21-31

(非專利文獻(xiàn)3)stemcell,2008,26:1241-1252

(非專利文獻(xiàn)4)jinvestdermatol,2008,128:1266-1272

(非專利文獻(xiàn)5)jinvestdermatol,2003,120:905-914

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種成熟人皮脂腺細(xì)胞的制造方法，其中，包括將未成熟人皮脂腺細(xì)胞在低氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

另外，本發(fā)明提供一種未成熟人皮脂腺細(xì)胞向成熟人皮脂腺細(xì)胞的分化誘導(dǎo)方法，其中，包括將未成熟人皮脂腺細(xì)胞在低氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

另外，本發(fā)明提供一種皮脂分泌控制劑的評價和/或選擇方法，其中，包括：將未成熟人皮脂腺細(xì)胞在低氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)；和調(diào)查被檢測物質(zhì)或試驗條件對培養(yǎng)后的細(xì)胞的脂滴形成的影響。

進(jìn)一步，本發(fā)明提供一種用于培養(yǎng)成熟人皮脂腺細(xì)胞的裝置，其具備：用于細(xì)胞培養(yǎng)的腔室、和用于將培養(yǎng)氣氛調(diào)整或維持在低氧條件的氧濃度控制器。

進(jìn)一步，本發(fā)明提供一種用于將未成熟人皮脂腺細(xì)胞向成熟人皮脂腺細(xì)胞分化誘導(dǎo)的裝置，其具備：用于細(xì)胞培養(yǎng)的腔室、和用于將培養(yǎng)氣氛調(diào)整或維持在低氧條件的氧濃度控制器。

附圖說明

圖1表示氧濃度對皮脂腺細(xì)胞的脂滴形成產(chǎn)生的影響。左：核染色圖像，中：脂滴染色圖像，右：融合圖像。圖像左側(cè)的數(shù)值表示氧濃度。放大(enlarged)表示以在1％氧濃度下培養(yǎng)的融合圖像中的白框包圍的區(qū)域的放大圖。

圖2表示氧濃度對皮脂腺細(xì)胞的脂滴形成產(chǎn)生的影響。左：核染色圖像，中：脂滴染色圖像，右：融合圖像。圖像左側(cè)的數(shù)值表示氧濃度。

圖3表示低氧下培養(yǎng)時間(3～9小時)產(chǎn)生的皮脂腺細(xì)胞的脂滴形成量的變化。左：核染色圖像，中：脂滴染色圖像，右：融合圖像。

圖4表示低氧下培養(yǎng)時間(24～48小時)產(chǎn)生的皮脂腺細(xì)胞的脂滴形成量的變化。左：核染色圖像，中：脂滴染色圖像，右：融合圖像。放大(enlarged)表示以培養(yǎng)48小時的融合圖像中的白框包圍的區(qū)域的放大圖。

圖5表示在低氧下進(jìn)行培養(yǎng)的皮脂腺細(xì)胞中的plin1表達(dá)量的提高。誤差條＝sd、n＝3。

具體實施方式

本發(fā)明涉及一種可以形成脂滴的分化后的培養(yǎng)皮脂腺細(xì)胞的制造方法。

本發(fā)明者們深入研究了用于在以往的培養(yǎng)人皮脂腺細(xì)胞中如生物體內(nèi)的皮脂腺細(xì)胞那樣獲得形成脂滴的能力的方法。其結(jié)果，發(fā)現(xiàn)：通過將人皮脂腺細(xì)胞在低氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)，該細(xì)胞分化為形成脂滴的細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明，可以提供如生物體內(nèi)的皮脂腺細(xì)胞那樣獲得了形成脂滴的性質(zhì)的培養(yǎng)成熟人皮脂腺細(xì)胞。由本發(fā)明所提供的培養(yǎng)成熟人皮脂腺細(xì)胞可以成為用于皮脂分泌的機(jī)理的研究、或用于控制皮脂分泌的醫(yī)藥品或化妝品的開發(fā)的有用的工具。

在皮脂腺的最外層中存在作為未分化的皮脂腺細(xì)胞的基底細(xì)胞，積極地進(jìn)行細(xì)胞分裂。如果基底細(xì)胞轉(zhuǎn)移至皮脂腺的中心部，則細(xì)胞分裂逐漸地停止。停止了分裂的細(xì)胞開始在細(xì)胞內(nèi)蓄積脂滴，最終使脂滴占細(xì)胞質(zhì)的大部分。該蓄積脂滴的皮脂腺細(xì)胞為分化后的皮脂腺細(xì)胞的(j.invest.dermatol,1974,62:147-152)。蓄積了脂滴的分化后的皮脂腺細(xì)胞最后進(jìn)行崩解而放出皮脂。

在本說明書中，“成熟皮脂腺細(xì)胞”是指為分化后的皮脂腺細(xì)胞、且在細(xì)胞內(nèi)具有脂滴(lipiddroplet)的細(xì)胞。另外，在本說明書中，“未成熟(的)皮脂腺細(xì)胞”是為了與上述的“成熟皮脂腺細(xì)胞”區(qū)別而使用的用語，是指不是上述“成熟皮脂腺細(xì)胞”的未分化的皮脂腺細(xì)胞、或在細(xì)胞內(nèi)不具有脂滴的皮脂腺細(xì)胞。

細(xì)胞內(nèi)的脂滴的存在可以通過公知的方法來確認(rèn)。例如，如后述的實施例中記載的，可以通過利用油紅o、尼羅紅等油脂染色試劑進(jìn)行了染色的細(xì)胞的顯微鏡觀察、或熒光或吸光度測定來確認(rèn)。例如，在細(xì)胞內(nèi)存在脂滴的情況下，在用油脂染色試劑進(jìn)行了處理的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)觀察到清晰的點狀或圓形的染色區(qū)域(例如圖1)?；蛘撸?xì)胞內(nèi)的脂滴的存在也可以通過細(xì)胞中的脂滴包被蛋白1(perilipin1，plin1)等脂肪滴結(jié)合蛋白質(zhì)(pnas,2001,98:6494-6499)的表達(dá)量的測定等來確認(rèn)。

在本發(fā)明中，誘導(dǎo)沒有形成或蓄積脂滴的未成熟人皮脂腺細(xì)胞的分化，制備形成或蓄積了脂滴、或者脂滴蓄積量增加的成熟人皮脂腺細(xì)胞。即，本發(fā)明的一個實施方式為成熟人皮脂腺細(xì)胞的制造方法。本發(fā)明的另一實施方式為未成熟人皮脂腺細(xì)胞向成熟人皮脂腺細(xì)胞的分化誘導(dǎo)方法。這些本發(fā)明的方法包括將未成熟的人皮脂腺細(xì)胞在低氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

在上述本發(fā)明的方法中，作為提供給低氧條件下的培養(yǎng)的未成熟人皮脂腺細(xì)胞的例子，可以列舉由包含皮脂腺的生物體的皮膚使用公知的方法而制備的培養(yǎng)人皮脂腺細(xì)胞、被確立的人皮脂腺細(xì)胞株等，優(yōu)選為被確立的人皮脂腺細(xì)胞株。作為人皮脂腺細(xì)胞株的例子，可以列舉專利文獻(xiàn)1、或非專利文獻(xiàn)1、5中所記載的永生化源自人的皮脂腺細(xì)胞細(xì)胞株(例如dsmacc2383或sz95、及seb-1)，但并不限定于這些。

在上述的培養(yǎng)人皮脂腺細(xì)胞及細(xì)胞株中，不僅存在未成熟的皮脂腺細(xì)胞，而且可能在一部分中存在成熟皮脂腺細(xì)胞。但是，如果按照本發(fā)明的方法培養(yǎng)這樣的未成熟細(xì)胞和成熟細(xì)胞的混合物，則可以制備蓄積有脂滴的成熟人皮脂腺細(xì)胞的含有率顯著地增加的培養(yǎng)皮脂腺細(xì)胞。因此，用本發(fā)明的方法培養(yǎng)的未成熟的皮脂腺細(xì)胞可以是僅由未成熟的皮脂腺細(xì)胞構(gòu)成的皮脂腺細(xì)胞群，也可以是含有未成熟的皮脂腺細(xì)胞的皮脂腺細(xì)胞群。換句話說，本發(fā)明的成熟人皮脂腺細(xì)胞的制造方法的一實施方式可以為由未成熟的人皮脂腺細(xì)胞制造成熟人皮脂腺細(xì)胞的方法，另一實施方式可以為由含有未成熟的人皮脂腺細(xì)胞的人皮脂腺細(xì)胞培養(yǎng)物制造成熟人皮脂腺細(xì)胞的含有率更高的人皮脂腺細(xì)胞培養(yǎng)物的方法。

在上述本發(fā)明的方法中，將上述未成熟的人皮脂腺細(xì)胞在低氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)。由此，將該未成熟細(xì)胞分化誘導(dǎo)為成熟人皮脂腺細(xì)胞。本發(fā)明中的低氧條件優(yōu)選為培養(yǎng)氣氛中的氧濃度為約5％以下、更優(yōu)選約2％以下、進(jìn)一步優(yōu)選約1％以下的條件，或培養(yǎng)氣氛中的氧濃度為約0.1％～約5％的條件。低氧條件可以由具備氧濃度控制器的培養(yǎng)器來實現(xiàn)。這種培養(yǎng)器為公知的，市售有各種類型(例如bionlx低氧培養(yǎng)試劑盒，sugiyama-genco.,ltd.)。

將上述本發(fā)明的方法中的人皮脂腺細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時的其它條件按照通常的人皮脂腺細(xì)胞的體外的培養(yǎng)條件即可。以下列舉培養(yǎng)條件的例子：對于培養(yǎng)基，使用相對于william’semedium、d-mem、rpm11640、ham’sf-12、modifiedd-mem/ham’sf-12(1:1)培養(yǎng)基(例如、sebomed^tmbasalmedium)等基礎(chǔ)培養(yǎng)基、優(yōu)選為modifiedd-mem/ham’sf-12(1:1)培養(yǎng)基，添加有血清0.1％～20％、優(yōu)選為10％；表皮生長因子(epidermalgrowthfactor，egf)1～10ng/ml、優(yōu)選為3～6ng/ml；氫化可的松0.1～20μg/ml、優(yōu)選為5～15μg/ml；胰島素5～50μg/ml、優(yōu)選為8～20μg/ml而成的培養(yǎng)基。培養(yǎng)容器使用塑料、玻璃等，優(yōu)選使用塑料。細(xì)胞在培養(yǎng)基中的播種濃度為1×10³～1×10⁶細(xì)胞/cm²、優(yōu)選為0.5×10³細(xì)胞/cm²～0.5×10⁵細(xì)胞/cm²。在培養(yǎng)溫度為30～40℃、優(yōu)選為33～38℃下靜置、振蕩、或旋轉(zhuǎn)條件下、優(yōu)選在靜置狀態(tài)下實施培養(yǎng)。培養(yǎng)時間根據(jù)細(xì)胞內(nèi)的脂滴的形成狀態(tài)適當(dāng)確定即可，優(yōu)選為24小時以上，更優(yōu)選為24～72小時左右。

因此，本發(fā)明的另一實施方式涉及一種用于培養(yǎng)成熟人皮脂腺細(xì)胞、或用于將未成熟人皮脂腺細(xì)胞向成熟人皮脂腺細(xì)胞分化誘導(dǎo)而使用具備可以在上述低氧條件下將細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的裝置的細(xì)胞培養(yǎng)裝置。在一個實施方式中，該細(xì)胞培養(yǎng)裝置具備用于細(xì)胞培養(yǎng)的腔室、和用于將培養(yǎng)氣氛調(diào)整或維持在低氧條件的氧濃度控制器。

作為上述用于細(xì)胞培養(yǎng)的腔室，只要可以對培養(yǎng)培養(yǎng)細(xì)胞的氣氛阻擋來自周邊的通常的大氣即可，可以列舉例如密閉型的培養(yǎng)皿、罐子、孵化器等。上述氧濃度控制器是可以將上述腔室內(nèi)的氧濃度調(diào)整或維持為比通常的大氣低的濃度、優(yōu)選為上述的低氧條件的裝置。作為該氧濃度控制器，例如可以列舉氧吸收劑；和可以將氧、氮及二氧化碳以任意的濃度進(jìn)行混合的氧控制器等。上述中例示的腔室及氧濃度控制器各自有市售，或也市售有將它們組合而成的低氧培養(yǎng)用試劑盒(例如bionix低氧培養(yǎng)試劑盒，sugiyama-genco.,ltd.)。例如，可以將現(xiàn)有癌細(xì)胞的培養(yǎng)用所提供的用于低氧培養(yǎng)的設(shè)備或試劑盒用作本發(fā)明的用于培養(yǎng)成熟人皮脂腺細(xì)胞的裝置。

由上述的步驟得到的成熟人皮脂腺細(xì)胞如生物體內(nèi)的皮脂腺細(xì)胞那樣具有形成或蓄積脂滴的性質(zhì)，因此，在皮脂分泌的機(jī)理的研究、或用于控制皮脂分泌的醫(yī)藥品或化妝品的開發(fā)研究中，可以作為人皮脂腺模型使用。

因此，本發(fā)明的另一實施方式為利用了在上述低氧下進(jìn)行了培養(yǎng)的人皮脂腺細(xì)胞形成或蓄積脂滴的性質(zhì)的皮脂分泌控制劑的評價和/或選擇方法。該方法包括：將未成熟人皮脂腺細(xì)胞在低氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)；及調(diào)查被檢測物質(zhì)或試驗條件對所培養(yǎng)的細(xì)胞的脂滴形成的影響。將該未成熟人皮脂腺細(xì)胞在低氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)的步驟如上所述。

在本發(fā)明的皮脂分泌控制劑的評價和/或選擇方法的一個實施方式中，上述未成熟人皮脂腺細(xì)胞在低氧條件下的培養(yǎng)在被檢測物質(zhì)的存在下進(jìn)行。規(guī)定期限的培養(yǎng)之后，觀察經(jīng)過培養(yǎng)的細(xì)胞的脂滴，調(diào)查被檢測物質(zhì)對該細(xì)胞的脂滴形成的影響。

在另一實施方式中，上述未成熟人皮脂腺細(xì)胞在低氧條件下的培養(yǎng)在試驗條件的適用下進(jìn)行。規(guī)定期限的培養(yǎng)之后，觀察經(jīng)過培養(yǎng)的細(xì)胞的脂滴，調(diào)查試驗條件對該細(xì)胞的脂滴形成的影響。

在另一實施方式中，上述未成熟人皮脂腺細(xì)胞在低氧條件下的培養(yǎng)在無被檢測物質(zhì)或試驗條件下進(jìn)行，該培養(yǎng)后的細(xì)胞適用被檢測物質(zhì)或試驗條件而進(jìn)一步進(jìn)行培養(yǎng)。該被檢測物質(zhì)或試驗條件適用后的培養(yǎng)不需要在低氧條件下。規(guī)定期限的培養(yǎng)之后，觀察細(xì)胞的脂滴，調(diào)查被檢測物質(zhì)或試驗條件對該細(xì)胞的脂滴形成的影響。

作為被檢測物質(zhì)或試驗條件，只要是期望用于皮脂分泌控制的物質(zhì)或條件，就沒有特別地限制。被檢測物質(zhì)可以為天然存在的物質(zhì)，也可以為用化學(xué)或生物學(xué)的方法等人工地合成的物質(zhì)，或可以為化合物，也可以為組合物或混合物。作為試驗條件，可以列舉光(例如光照射或遮光)、溫度(例如加熱或冷卻)等物理化學(xué)的條件等，但并不限定于這些。

作為在培養(yǎng)細(xì)胞中適用被檢測物質(zhì)或試驗條件的方法，可以列舉在培養(yǎng)基中添加被檢測物質(zhì)的方法、在細(xì)胞中直接添加被檢測物質(zhì)的方法、在被檢測物質(zhì)存在的氣氛下培養(yǎng)細(xì)胞的方法、將培養(yǎng)中的細(xì)胞暴露于規(guī)定的物理化學(xué)的條件的方法等，但并不限定于這些。

在細(xì)胞的脂滴的觀察中，可以用顯微鏡觀察等定性地評價脂滴，但也可以將細(xì)胞的脂滴形成量進(jìn)行定量。作為細(xì)胞的脂滴形成量的定量方法，可以列舉：基于使用熒光或吸光度測定裝置測定的、用油紅o、尼羅紅等油脂染色試劑進(jìn)行了染色的細(xì)胞的染色強(qiáng)度來定量油脂量的方法；通過實時rt-pcr等定量細(xì)胞中的脂滴包被蛋白1(plin1)等脂滴相關(guān)蛋白質(zhì)(lipiddroplet-associatedprotein)的表達(dá)量的方法等。

接著，調(diào)查被檢測物質(zhì)或試驗條件對細(xì)胞的脂滴形成的影響。在培養(yǎng)后的細(xì)胞的脂滴形成量由于被檢測物質(zhì)或試驗條件的適用而增加或減少的情況下，將該被檢測物質(zhì)或試驗條件選擇作為皮脂分泌控制劑。更詳細(xì)而言，在由于被檢測物質(zhì)或試驗條件的適用而造成培養(yǎng)后的細(xì)胞的脂滴形成量增加的情況下，將該被檢測物質(zhì)或試驗條件選擇作為皮脂分泌促進(jìn)劑。另一方面，在由于被檢測物質(zhì)或試驗條件的適用而造成培養(yǎng)后的細(xì)胞的脂滴形成量減少的情況下，將該被檢測物質(zhì)或試驗條件選擇作為皮脂分泌抑制劑。

優(yōu)選細(xì)胞的脂滴形成量與對照進(jìn)行比較。在適用了被檢測物質(zhì)或試驗條件的細(xì)胞的脂滴形成量與對照相比統(tǒng)計學(xué)上顯著性增加的情況下，將該被檢測物質(zhì)或試驗條件選擇作為皮脂分泌促進(jìn)劑。另一方面，在適用了被檢測物質(zhì)或試驗條件的細(xì)胞的脂滴形成量與對照相比統(tǒng)計學(xué)上顯著性減少的情況下，將該被檢測物質(zhì)或試驗條件選擇作為皮脂分泌抑制劑?；蛘?，在適用了被檢測物質(zhì)或試驗條件的細(xì)胞的脂滴形成量優(yōu)選增加至對照的120％以上、更優(yōu)選為150％以上的情況下，將該被檢測物質(zhì)或試驗條件選擇作為皮脂分泌促進(jìn)劑。另一方面，在適用了被檢測物質(zhì)或試驗條件的細(xì)胞的脂滴形成量優(yōu)選減少至對照的80％以下、更優(yōu)選為60％以下的情況下，將該被檢測物質(zhì)或試驗條件選擇作為皮脂分泌抑制劑。

作為對照，例如可以列舉在不適用被檢測物質(zhì)或試驗條件、或?qū)φ瘴镔|(zhì)存在下將未成熟人皮脂腺細(xì)胞在低氧條件下進(jìn)行了培養(yǎng)的細(xì)胞、或在低氧條件下的培養(yǎng)中及培養(yǎng)后不適用被檢測物質(zhì)或試驗條件的細(xì)胞等。

選擇后的皮脂分泌控制劑具有皮脂分泌的促進(jìn)或抑制的效果，可以治療或改善伴有過剩的皮脂分泌或皮脂分泌的降低的各種狀態(tài)或疾病。例如，皮脂分泌抑制劑可以作為粉刺、油性皮膚、皮脂溢出癥等的治療或改善劑、或以皮脂為原因的臭味(體臭等)的抑制的有效成分使用，皮脂分泌促進(jìn)劑可以作為干燥皮膚、干皮病、干眼癥、唇的皴裂或干燥等的治療或改善劑的有效成分使用。

本發(fā)明還作為例示的實施方式包含以下的物質(zhì)、制造方法、用途或方法。但是，本發(fā)明并不限定于這些實施方式。

＜1＞一種成熟人皮脂腺細(xì)胞的制造方法，其中，包括將未成熟人皮脂腺細(xì)胞在低氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

＜2＞一種未成熟人皮脂腺細(xì)胞向成熟人皮脂腺細(xì)胞的分化誘導(dǎo)方法，其中，包括將未成熟人皮脂腺細(xì)胞在低氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

＜3＞一種人皮脂腺細(xì)胞的脂滴形成量的增加方法，其中，包括將未成熟人皮脂腺細(xì)胞在低氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

＜4＞根據(jù)＜1＞～＜3＞中任一項所述的方法，其中，優(yōu)選上述未成熟人皮脂腺細(xì)胞為僅由未成熟皮脂腺細(xì)胞構(gòu)成的皮脂腺細(xì)胞群，或為含有未成熟皮脂腺細(xì)胞的皮脂腺細(xì)胞群。

＜5＞根據(jù)＜1＞～＜3＞中任一項所述的方法，其中，上述未成熟人皮脂腺細(xì)胞優(yōu)選為人皮脂腺細(xì)胞株，更優(yōu)選為以dsmacc2383注冊的細(xì)胞、sz95細(xì)胞、或seb-1細(xì)胞。

＜6＞根據(jù)＜1＞～＜5＞中任一項所述的方法，其中，上述低氧條件為培養(yǎng)氣氛中的氧濃度為優(yōu)選約5％以下、更優(yōu)選約2％以下、進(jìn)一步優(yōu)選約1％以下的條件，或者培養(yǎng)氣氛中的氧濃度為約0.1％～約5％的條件。

＜7＞根據(jù)＜1＞～＜6＞中任一項所述的方法，其中，優(yōu)選在靜置狀態(tài)下實施上述培養(yǎng)。

＜8＞根據(jù)＜1＞～＜7＞中任一項所述的方法，其中，優(yōu)選上述培養(yǎng)實施24小時以上。

＜9＞一種皮脂分泌控制劑的評價和/或選擇方法，其中，包括：將未成熟人皮脂腺細(xì)胞在低氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)；和調(diào)查被檢測物質(zhì)或試驗條件對培養(yǎng)后的細(xì)胞的脂滴形成的影響。

＜10＞根據(jù)＜9＞所述的方法，其中，優(yōu)選上述未成熟人皮脂腺細(xì)胞為僅由未成熟皮脂腺細(xì)胞構(gòu)成的皮脂腺細(xì)胞群，或為含有未成熟皮脂腺細(xì)胞的皮脂腺細(xì)胞群。

＜11＞根據(jù)＜9＞所述的方法，其中，上述未成熟人皮脂腺細(xì)胞優(yōu)選為人皮脂腺細(xì)胞株，更優(yōu)選為以dsmacc2383注冊的細(xì)胞、sz95細(xì)胞、或seb-1細(xì)胞。

＜12＞根據(jù)＜9＞～＜11＞中任一項所述的方法，其中，上述低氧條件為培養(yǎng)氣氛中的氧濃度為優(yōu)選約5％以下、更優(yōu)選約2％以下、進(jìn)一步優(yōu)選約1％以下的條件，或者培養(yǎng)氣氛中的氧濃度為約0.1％～約5％的條件。

＜13＞根據(jù)＜9＞～＜12＞中任一項所述的方法，其中，優(yōu)選在靜置狀態(tài)下實施上述培養(yǎng)。

＜14＞根據(jù)＜9＞～＜13＞中任一項所述的方法，其中，優(yōu)選上述培養(yǎng)實施24小時以上。

＜15＞根據(jù)＜9＞～＜14＞中任一項所述的方法，其中，優(yōu)選在被檢測物質(zhì)的存在下或試驗條件的適用下進(jìn)行上述未成熟人皮脂腺細(xì)胞的低氧條件下的培養(yǎng)。

＜16＞根據(jù)＜9＞～＜14＞中任一項所述的方法，其中，優(yōu)選在無被檢測物質(zhì)或試驗條件下進(jìn)行上述未成熟人皮脂腺細(xì)胞的低氧條件下的培養(yǎng)，并且上述方法還包括將在該低氧條件下進(jìn)行了培養(yǎng)的細(xì)胞在被檢測物質(zhì)或試驗條件的適用下進(jìn)一步進(jìn)行培養(yǎng)。

＜17＞根據(jù)＜9＞～＜16＞中任一項所述的方法，其中，優(yōu)選還包括：在培養(yǎng)后的細(xì)胞的脂滴形成量由于被檢測物質(zhì)或試驗條件的適用而增加或減少的情況下，將該被檢測物質(zhì)或試驗條件選擇作為皮脂分泌控制劑。

＜18＞根據(jù)＜15＞所述的方法，其中，優(yōu)選還包括：不適用被檢測物質(zhì)或試驗條件而將未成熟人皮脂腺細(xì)胞在低氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)；以及以下的任一種：

在適用了上述被檢測物質(zhì)或條件的細(xì)胞的脂滴形成量與不適用該被檢測物質(zhì)或試驗條件的細(xì)胞相比統(tǒng)計學(xué)上顯著性增加的情況下，將該被檢測物質(zhì)或試驗條件選擇作為皮脂分泌促進(jìn)劑；

在適用了上述被檢測物質(zhì)或條件的細(xì)胞的脂滴形成量與不適用該被檢測物質(zhì)或試驗條件的細(xì)胞相比統(tǒng)計學(xué)上顯著性減少的情況下，將該被檢測物質(zhì)或試驗條件選擇作為皮脂分泌抑制劑；

在適用了上述被檢測物質(zhì)或條件的細(xì)胞的脂滴形成量與不適用該被檢測物質(zhì)或試驗條件的細(xì)胞相比增加至優(yōu)選120％以上、更優(yōu)選為150％以上的情況下，將該被檢測物質(zhì)或試驗條件選擇作為皮脂分泌促進(jìn)劑；或者

在適用了上述被檢測物質(zhì)或條件的細(xì)胞的脂滴形成量與不適用該被檢測物質(zhì)或試驗條件的細(xì)胞相比減少至優(yōu)選80％以下、更優(yōu)選為60％以下的情況下，將該被檢測物質(zhì)或試驗條件選擇作為皮脂分泌抑制劑。

＜19＞根據(jù)＜16＞所述的方法，其中，優(yōu)選還包括：將在上述低氧條件下進(jìn)行了培養(yǎng)的細(xì)胞不適用被檢測物質(zhì)或試驗條件而進(jìn)一步進(jìn)行培養(yǎng)；以及以下的任一種：

在適用了上述被檢測物質(zhì)或條件的細(xì)胞的脂滴形成量與不適用該被檢測物質(zhì)或試驗條件的細(xì)胞相比統(tǒng)計學(xué)上顯著性增加的情況下，將該被檢測物質(zhì)或試驗條件選擇作為皮脂分泌促進(jìn)劑；

在適用了上述被檢測物質(zhì)或條件的細(xì)胞的脂滴形成量與不適用該被檢測物質(zhì)或試驗條件的細(xì)胞相比統(tǒng)計學(xué)上顯著性減少的情況下，將該被檢測物質(zhì)或試驗條件選擇作為皮脂分泌抑制劑；

在適用了上述被檢測物質(zhì)或條件的細(xì)胞的脂滴形成量與不適用該被檢測物質(zhì)或試驗條件的細(xì)胞相比增加至優(yōu)選120％以上、更優(yōu)選為150％以上的情況下，將該被檢測物質(zhì)或試驗條件選擇作為皮脂分泌促進(jìn)劑；或者

在適用了上述被檢測物質(zhì)或條件的細(xì)胞的脂滴形成量與不適用該被檢測物質(zhì)或試驗條件的細(xì)胞相比減少至優(yōu)選80％以下、更優(yōu)選為60％以下的情況下，將該被檢測物質(zhì)或試驗條件選擇作為皮脂分泌抑制劑。

＜20＞根據(jù)＜9＞～＜19＞中任一項所述的方法，其中，優(yōu)選上述皮脂分泌控制劑為伴有過剩的皮脂分泌或皮脂分泌的降低的各種狀態(tài)或疾病的治療或改善劑。

＜21＞一種用于培養(yǎng)成熟人皮脂腺細(xì)胞的裝置，其中，具備：用于細(xì)胞培養(yǎng)的腔室、和用于將培養(yǎng)氣氛調(diào)整或維持在低氧條件的氧濃度控制器。

＜22＞一種用于將未成熟人皮脂腺細(xì)胞向成熟人皮脂腺細(xì)胞分化誘導(dǎo)的裝置，其中，具備：用于細(xì)胞培養(yǎng)的腔室、和用于將培養(yǎng)氣氛調(diào)整或維持在低氧條件的氧濃度控制器。

＜23＞根據(jù)＜21＞或＜22＞所述的裝置，其中，上述低氧條件為培養(yǎng)氣氛中的氧濃度為優(yōu)選約5％以下、更優(yōu)選約2％以下、進(jìn)一步優(yōu)選約1％以下的條件、或培養(yǎng)氣氛中的氧濃度為約0.1％～約5％的條件。

實施例

以下，基于實施例來進(jìn)一步詳細(xì)地說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限定于此。

＜方法＞

1)細(xì)胞

人皮脂腺細(xì)胞株(sz95)在含有10％fbs、5ng/mlegf的sebomed^tmbasalmedium中進(jìn)行培養(yǎng)。通常氧濃度下的培養(yǎng)在大氣中的氧濃度(20.9％)下進(jìn)行。在低氧下的培養(yǎng)使用bionix低氧培養(yǎng)試劑盒(sugiyama-genco.,ltd.)，在氧濃度10％、5％、1％或0.1％的條件下進(jìn)行。任一種情況均在5％co2、37℃下培養(yǎng)最多72小時。

2)脂滴的熒光顯微鏡觀察

使用4％多聚甲醛溶液將sz95固定5分鐘，其后用1μg/ml的尼羅紅溶液(sigmaaldorich)、及dapi溶液(lifetechnologies)在室溫下染色15分鐘，使用熒光顯微鏡實施脂滴的觀察。

3)實時rt-pcr

使用rneasy(注冊商標(biāo))minikit，按照所附的實驗流程從細(xì)胞中提取總rna。由提取的總rna合成cdna中使用quantitect(注冊商標(biāo))逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(qiagen)。在實時pcr中，使用taqman(注冊商標(biāo))universalmastermix(lifetechnologies)、以及taqman探針(lifetechnologies)，將脂滴包被蛋白1(plin1)、及核糖體蛋白lp0(rplp0)的mrna表達(dá)量進(jìn)行定量。plin1的mrna表達(dá)量根據(jù)rplp0的表達(dá)量進(jìn)行校正。

(試驗1)低氧下培養(yǎng)導(dǎo)致的皮脂腺細(xì)胞的脂滴形成量的促進(jìn)

將sz95細(xì)胞在20.9％、10％、5％、1％及0.1％的氧濃度下培養(yǎng)2天，進(jìn)行了尼羅紅染色之后，進(jìn)行熒光顯微鏡觀察。將顯微鏡圖像示于圖1～2中。圖1～2中，以亮度低的白色所看到的圓形的區(qū)域(圖1的放大圖中的虛線包圍的區(qū)域內(nèi))為細(xì)胞的核，在核的周邊大量散布的亮度高的白點(圖1的放大圖中的箭頭)為脂滴。顯微鏡觀察的結(jié)果可知：在0.1％、1％及5％的氧濃度下進(jìn)行了培養(yǎng)的細(xì)胞較強(qiáng)地被尼羅紅染色，在細(xì)胞內(nèi)蓄積脂滴。其中確認(rèn)：在氧濃度最低的0.1％的氧濃度下進(jìn)行了培養(yǎng)的細(xì)胞其脂滴的形成率最高。

(試驗2)培養(yǎng)時間導(dǎo)致的皮脂腺細(xì)胞的脂滴形成量的變化

將sz95細(xì)胞以氧濃度0.1％培養(yǎng)3、6、9、24、48小時。其結(jié)果可知：培養(yǎng)了24小時以上的細(xì)胞較強(qiáng)地被尼羅紅染色。在細(xì)胞內(nèi)豐富地蓄積了脂滴(圖3～4)。

(試驗3)低氧導(dǎo)致的脂滴形成的分子機(jī)制

報道有在脂滴包被蛋白1(plin1)敲除的小鼠中，通常蓄積于脂肪細(xì)胞的脂滴顯著地減少(pnas,2001,98:6494-6499)。本試驗中，將sz95細(xì)胞在氧濃度20.9％(通常)及0.1％(低氧)的條件下培養(yǎng)了24小時或48小時之后，測定細(xì)胞的plin1的表達(dá)量。其結(jié)果可知：plin1的表達(dá)與通常氧濃度條件下(20.9％)相比，在低氧條件下(0.1％)進(jìn)行了培養(yǎng)的細(xì)胞中顯著地上升(圖5)。由此啟示了：在皮脂腺細(xì)胞的低氧環(huán)境下的脂滴形成的分子機(jī)制中plin1參與，并且以plin1為指標(biāo)可以將皮脂腺細(xì)胞的脂滴形成量定量。