本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種含細(xì)胞因子佐劑的重組腸道病毒表型混合系統(tǒng)的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

手足口?。℉and-foot-mouth disease，HFMD）是一種由腸道病毒感染引起的傳染性疾病，多發(fā)于5歲以下嬰幼兒，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、厭食、哭鬧，在手、足、口腔黏膜、肛周等部位出現(xiàn)皰疹或潰瘍。手足口病通常具有自限性，多數(shù)患兒一周左右自愈，但少數(shù)患兒會(huì)出現(xiàn)無(wú)菌性腦膜炎、腦炎、心肌炎、肺水腫等中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)及呼吸系統(tǒng)并發(fā)癥，迅速進(jìn)展為重癥手足口病，嚴(yán)重時(shí)可造成死亡。手足口病在我國(guó)高發(fā)，為我國(guó)公共健康帶來(lái)巨大威脅，2008年衛(wèi)生部將其納入丙類傳染病進(jìn)行管理。

引發(fā)HFMD的腸道病毒有柯薩奇病毒A組2-10、12、16、24型，B組的1-5型以及腸道病毒71型（EV71）等，其中最主要的病原為EV71和柯薩奇病毒 A組16型（CA16）。通常 CA16引起的癥狀相對(duì)較輕但感染病例數(shù)量大，EV71更易引起神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥等重癥手足口病，而2012年以來(lái)的流行中CA6的分離率也日益增高。目前治療手足口病缺乏有效治療藥物，主要以對(duì)癥和支持治療為主。

CA16、EV71以及CA6均屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，為無(wú)包膜的正向單鏈RNA病毒，其衣殼為二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，病毒衣殼由VP1、VP2、VP3和VP4構(gòu)成，其中VP1是其主要的衣殼蛋白，同時(shí)也是病毒吸附蛋白，在病毒吸附和穿入過(guò)程中起決定作用，因此VP1又是病毒的中和抗原。手足口病疫情嚴(yán)重，而在預(yù)防手段方面針對(duì)EV71病毒的目前僅有滅活疫苗已上市，CA16尚無(wú)疫苗應(yīng)用。

柯薩奇B組3型病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒I型、II型和III型病毒亦屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，腸道病毒屬的病毒在生物學(xué)特性上有相似之處。其中，腸道病毒屬的病毒在復(fù)制周期中，都是以基因組為模板，通讀轉(zhuǎn)錄成一條mRNA，并翻譯為前體蛋白，隨后在病毒蛋白酶的作用自切割形成多種病毒蛋白質(zhì)。在包裝階段，感染細(xì)胞中的病毒VP1、VP2、VP3和VP4會(huì)形成子代病毒衣殼，將子代基因組包裹并最終形成完整的子代病毒進(jìn)行釋放。在包裝過(guò)程中，腸道病毒屬的病毒VP1功能相似，因此，如一個(gè)細(xì)胞被兩種以上的腸道病毒屬病毒感染，會(huì)發(fā)生表型混合的現(xiàn)象，即一種病毒的基因組會(huì)被另一種病毒的衣殼所包裹，這種病毒的衣殼和基因組來(lái)源于不同的腸道病毒。

腸道病毒屬病毒的表型混合現(xiàn)象，具有疫苗研究的潛在價(jià)值，但天然的表型混合實(shí)際操作過(guò)程中存在問(wèn)題。兩種或兩種以上的腸道病毒同時(shí)細(xì)胞會(huì)引發(fā)干擾現(xiàn)象，使病毒的增殖效率降低，且不同病毒混合感染后的復(fù)制增殖效率不一，無(wú)法進(jìn)行有效的質(zhì)控，而對(duì)于疫苗應(yīng)用價(jià)值的毒株需要高復(fù)制效率，這也是目前疫苗研究領(lǐng)域均使用單型病毒各自增殖，然后將單獨(dú)制備的各型疫苗按需進(jìn)行混合，而不使用多種病毒同時(shí)感染細(xì)胞來(lái)增殖病毒，不去利用表型混合機(jī)制。

用于“天然”表型混合的病毒，除了干擾現(xiàn)象和增殖效率不一的瓶頸外，如果是強(qiáng)毒株來(lái)源則需要進(jìn)行滅活處理，制備為滅活疫苗，一方面其滅活疫苗的是利用已滅活無(wú)感染性的病毒衣殼，經(jīng)肌注后依靠體內(nèi)專職抗原提呈細(xì)胞加工處理后，激活機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，為MHC-II類分子依賴的外源性抗原提呈，而自然條件下病毒感染更多的是以MHC-I類分子依賴的內(nèi)源性抗原提呈方式激活機(jī)體免疫，因此保護(hù)力不如基于減毒毒株的減毒活疫苗。另一方面，如使用的是減毒腸道病毒毒株來(lái)進(jìn)行表型混合，一樣存在干擾現(xiàn)象和增殖效率不一的瓶頸，同時(shí)更為限制表型混合應(yīng)用的是，多種減毒腸道病毒毒株混合感染細(xì)胞，由于毒株之間可以發(fā)生功能互補(bǔ)，且會(huì)發(fā)生非預(yù)期的基因重組，會(huì)極大加大減毒毒株回復(fù)毒力的風(fēng)險(xiǎn)。

因此，如將腸道病毒表型混合現(xiàn)象應(yīng)用于腸道病毒疫苗研究和開(kāi)發(fā)，需要建立一種安全、高效的表型混合系統(tǒng)的方法，能夠避免多種病毒同時(shí)感染所造成的干擾現(xiàn)象、增殖效率不一、非預(yù)期的基因重組、減毒毒株回復(fù)毒力，同時(shí)又比滅活疫苗免疫保護(hù)效果好。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，提供一種含細(xì)胞因子佐劑的重組腸道病毒表型混合系統(tǒng)的構(gòu)建方法。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供所述方法獲得的含細(xì)胞因子佐劑的重組腸道病毒表型混合系統(tǒng)。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供所述混合系統(tǒng)的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的：

一種含細(xì)胞因子佐劑的重組腸道病毒表型混合系統(tǒng)的構(gòu)建方法，首先分別構(gòu)建VP1重組細(xì)胞系和負(fù)載細(xì)胞因子基因的重組減毒腸道病毒株；然后將負(fù)載細(xì)胞因子基因的重組減毒腸道病毒株在VP1重組細(xì)胞系中進(jìn)行感染擴(kuò)增即得含細(xì)胞因子佐劑的重組腸道病毒表型混合系統(tǒng)；所述VP1重組細(xì)胞系為單獨(dú)或同時(shí)表達(dá)腸道病毒71型、柯薩奇病毒A組16型的VP1的一種或兩種的細(xì)胞系；所述負(fù)載細(xì)胞因子基因的重組減毒腸道病毒株選自柯薩奇病毒B組3型、腸道病毒71型或者脊髓灰質(zhì)炎病毒I型；所述細(xì)胞因子選自霍亂毒素或干擾素γ。

該系統(tǒng)包括VP1重組細(xì)胞系和負(fù)載細(xì)胞因子基因的減毒腸道病毒毒株兩個(gè)部分。其中VP1重組細(xì)胞系為：構(gòu)建腸道病毒71型、柯薩奇病毒A組16型的VP1真核表達(dá)載體，經(jīng)轉(zhuǎn)染篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)多種來(lái)源VP1蛋白重組表達(dá)細(xì)胞系。負(fù)載細(xì)胞因子基因的減毒腸道病毒的背景毒株為：腸道病毒71型減毒毒株、或薩奇病毒B組3型的減毒毒株、或脊髓灰質(zhì)炎病毒I型減毒毒株。在上述背景毒株的基礎(chǔ)上，構(gòu)建感染性克隆，將細(xì)胞因子基因插入病毒基因組的P1和P2區(qū)之間，并加入病毒蛋白酶酶切位點(diǎn)，經(jīng)感染性克隆載體轉(zhuǎn)染和病毒拯救，獲得可外源表達(dá)細(xì)胞因子的減毒腸道病毒。其中的細(xì)胞因子可以為霍亂毒素或干擾素γ。在該系統(tǒng)中，含有負(fù)載細(xì)胞因子基因的重組減毒腸道病毒，感染其它腸道病毒VP1重組表達(dá)細(xì)胞系后，在病毒增殖的包裝階段，子代病毒會(huì)將其它腸道病毒的VP1混入子代病毒衣殼中。例如，經(jīng)過(guò)增殖的子代病毒，其病毒核心為柯薩奇病毒B組3型減毒毒株基因組，而其表面病毒衣殼中的VP1是混裝的，含有來(lái)源于包括腸道病毒71型、柯薩奇病毒A組16型的VP1。所獲得的子代病毒可感染宿主，但由于病毒核心為含有負(fù)載細(xì)胞因子基因的重組減毒腸道病毒毒株的基因組，其在宿主中的復(fù)制和致病性受到限制；同時(shí)重組表達(dá)的細(xì)胞因子可增強(qiáng)宿主的免疫反應(yīng)，而子代病毒含有多種腸道病毒的VP1蛋白，且VP1是腸道病毒具有型特異性的中和抗原，因此，此種系統(tǒng)形成的子代病毒可激活宿主免疫，針對(duì)多種腸道病毒產(chǎn)生免疫保護(hù)。

優(yōu)選地，所述含細(xì)胞因子佐劑的重組腸道病毒表型混合系統(tǒng)的制備方法，包括以下步驟：

S1. 擴(kuò)增腸道病毒71型和/或柯薩奇病毒A組16型的VP1基因，連接至真核表達(dá)載體中，經(jīng)轉(zhuǎn)染、篩選后得VP1重組細(xì)胞系；

S2. 將柯薩奇病毒B組3型、腸道病毒71型或者脊髓灰質(zhì)炎病毒I型進(jìn)行全基因組克隆，在反向遺傳系統(tǒng)下，在病毒全基因組的P1和P2區(qū)之間插入細(xì)胞因子得負(fù)載細(xì)胞因子基因的重組減毒腸道病毒株；

S3. S2得到的負(fù)載細(xì)胞因子基因的重組減毒腸道病毒株感染S1得到的VP1重組細(xì)胞系即得。

本發(fā)明所述VP1重組細(xì)胞系和負(fù)載細(xì)胞因子基因的重組減毒腸道病毒株的制備方法均為分子生物學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。

優(yōu)選地，VP1重組細(xì)胞系的制備方法為提取相應(yīng)病毒的RNA，利用polyA或隨機(jī)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。利用相應(yīng)病毒的特異性引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到相應(yīng)病毒的VP1基因，利用酶切連接將VP1基因片段插入真核表達(dá)載體中。真核表達(dá)載體可使用Neo或Puyo抗性基因，構(gòu)建好的真核表達(dá)載體利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至真核細(xì)胞Vero細(xì)胞（或293、Hep2、HeLa等細(xì)胞）中，然后使用G418或嘌呤霉素進(jìn)行篩選，經(jīng)免疫印跡鑒定和免疫熒光鑒定后，得到該表型混合系統(tǒng)的其中一部分，即VP1重組細(xì)胞系。

優(yōu)選地，負(fù)載細(xì)胞因子基因的重組減毒腸道病毒的制備方法為：將上述腸道病毒中的某一型進(jìn)行全基因組克隆，構(gòu)建病毒感染性克隆，在反向遺傳系統(tǒng)下，在病毒的P1和P2區(qū)之間引入編碼蛋白酶切位點(diǎn)的區(qū)域和特定限制性內(nèi)切酶區(qū)域，然后利用限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，插入細(xì)胞因子。細(xì)胞因子為霍亂毒素，以促進(jìn)該重組減毒毒株在腸道黏膜的黏膜免疫應(yīng)答；也可使用干擾素γ，促進(jìn)MHC-II抗原提呈，提高后續(xù)含有多種腸道病毒來(lái)源的VP1免疫應(yīng)答效率。

本發(fā)明還提供上述方法獲得的含細(xì)胞因子佐劑的重組腸道病毒表型混合系統(tǒng)。

如此，負(fù)載細(xì)胞因子基因的重組減毒腸道病毒感染VP1重組細(xì)胞系，細(xì)胞病變后收獲子代病毒，獲得含有多種不同來(lái)源腸道病毒VP1衣殼、含有減毒腸道病毒毒株基因組核心、可外源表達(dá)細(xì)胞因子的混合表型重組減毒毒株；此種系統(tǒng)形成的子代病毒可激活宿主免疫，針對(duì)多種腸道病毒產(chǎn)生免疫保護(hù)。

因此，本發(fā)明還提供含細(xì)胞因子佐劑的重組腸道病毒表型混合系統(tǒng)在制備治療腸道病毒的疫苗方法的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明提供了一種含細(xì)胞因子佐劑的重組腸道病毒表型混合系統(tǒng)的構(gòu)建方法，首先分別構(gòu)建VP1重組細(xì)胞系和負(fù)載細(xì)胞因子基因的重組減毒腸道病毒株；然后將負(fù)載細(xì)胞因子基因的重組減毒腸道病毒株在VP1重組細(xì)胞系中進(jìn)行感染擴(kuò)增記得含細(xì)胞因子佐劑的重組腸道病毒表型混合系統(tǒng)；所述VP1重組細(xì)胞系為單獨(dú)或同時(shí)表達(dá)腸道病毒71型、柯薩奇病毒A組16型的VP1的一種或兩種的細(xì)胞系；所述負(fù)載細(xì)胞因子基因的重組減毒腸道病毒株選自柯薩奇病毒B組3型、腸道病毒71型或者脊髓灰質(zhì)炎病毒I型；所述細(xì)胞因子選自霍亂毒素或干擾素γ；負(fù)載細(xì)胞因子基因的重組減毒腸道病毒感染VP1重組細(xì)胞系，細(xì)胞病變后收獲子代病毒，獲得含有多種不同來(lái)源腸道病毒VP1衣殼、含有減毒腸道病毒毒株基因組核心、可外源表達(dá)細(xì)胞因子的混合表型重組減毒毒株；此種系統(tǒng)形成的子代病毒可激活宿主免疫，針對(duì)多種腸道病毒產(chǎn)生免疫保護(hù)，該表型混合系統(tǒng)具有實(shí)際和廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1為CA16和EV71毒株VP1片段PCR擴(kuò)增電泳圖；M：NEB 1kb DNA ladder；1：CA16毒株VP1片段PCR產(chǎn)物；2：EV71毒株VP1片段PCR產(chǎn)物。

圖2為CA16和EV71毒株VP1片段及真核表達(dá)載體pcFlag的酶切回收；M：NEB 1kb DNA ladder；1：CA16毒株VP1片段酶切產(chǎn)物；2：EV71毒株VP1片段酶切產(chǎn)物；3：pcFlag酶切產(chǎn)物。

圖3為CA16的VP1真核表達(dá)質(zhì)粒pcFlag-CA16-VP1和EV71的VP1真核表達(dá)質(zhì)粒pcFlag-EV71-VP1的菌落PCR鑒定；M：NEB 1kb DNA ladder；1-8：pcFlag-CA16-VP1菌落PCR產(chǎn)物；9-16：pcFlag-EV71-VP1菌落PCR產(chǎn)物。

圖4為pcFlag-CA16-VP1和 pcFlag-EV71-VP1的Hind III和Xho I雙酶切鑒定；M：NEB 1kb DNA ladder；1-2：pcFlag-CA16-VP1質(zhì)粒Hind III和Xho I雙酶切鑒定；9-16：pcFlag-EV71-VP1質(zhì)粒Hind III和Xho I雙酶切鑒定。

圖5為CA16和EV71重組VP1蛋白在細(xì)胞中表達(dá)的免疫熒光檢測(cè)。

圖6（a）三段PCR擴(kuò)增Sabin1基因全長(zhǎng)，F(xiàn)1片段大小為2510bp，F(xiàn)2片段大小為3210bp，F(xiàn)3片段為1880bp。（b）三片段PCR橋接得到Sabin1全長(zhǎng)，Sabin1 大小為7441bp。（c）PCR橋接得到的Sabin1 基因和pMD19-T載體通過(guò)EcoR1和Sal1黏性末端連接得到pv-1,pv-2兩個(gè)克隆載體，用BamH1酶切鑒定，理論得到四個(gè)片段條帶，大小分別為5730bp，2471bp，1879bp，30bp，電泳分析只有三個(gè)目的條帶，30bp太小，無(wú)法辨認(rèn)，可以確定為陽(yáng)性克隆。（d）用EcoR1和Sal1 限制性內(nèi)切酶切割pv-1，pv-2 Sabin1載體，得到大小為7441bp的Sabin1 片段和大小為2692bp左右的pMD19-T 載體片段。

圖7（a）對(duì)Sabin1-f1,Sabin1-f2,Sabin1-f3,Sabin1-f4克隆質(zhì)粒進(jìn)行酶切回收目的片段，Sabin1-f1片段大小為2481bp，Sabin1-f2片段大小為2136bp，Sabin1-f3片段大小為1017bp，Sabin1-f4+pMD19-T片段大小為4487bp。（b） Sabin1-f1, Sabin1-f2, Sabin1-f3, Sabin1-f4+pMD19-T分段連接得到Sabin1基因全長(zhǎng)，用BamH1限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，理論得到四個(gè)片段條帶，大小分別為5730bp，2471bp，1879bp，30bp，電泳分析只有三個(gè)目的條帶，30bp太小，無(wú)法辨認(rèn)，基本可以判定Sabin1-1, Sabin1-2, Sabin1-3為陽(yáng)性克隆。

圖8(a)通過(guò)PCR橋接構(gòu)建的Sabin1載體用EcoR1和Sal1限制性內(nèi)切酶酶切回收Sabin1基因，與使用EcoR1和Xho1限制性內(nèi)切酶酶切得到EcoR1和Xho1黏性末端的pcDNA3連接，對(duì)克隆質(zhì)粒用BamH1酶切鑒定，理論有5個(gè)大小不一的片段，為8236bp， 2471bp， 1879bp， 256bp， 30bp。其中瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可以看到8236bp，2471bp，1879bp大小的片段，256bp，30bp過(guò)小，無(wú)法有效辨認(rèn)，初步確定為陽(yáng)性克隆。（b）通過(guò)片段連接構(gòu)建的pMD19-T_Sabin1載體用EcoR1和Not1限制性內(nèi)切酶酶切回收Sabin1片段和使用EcoR1和Not1限制性內(nèi)切酶酶切得到的pcDNA3連接得到的克隆，使用EcoR1和Sal1 限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，理論有5個(gè)大小不一的片段：7441bp，2285bp， 2188bp， 903bp， 34bp。實(shí)際瓊脂糖凝膠電泳鑒定只可以分辨7441bp和（2285bp，2188bp）兩條帶，初步分析為陽(yáng)性克隆。

圖9為pCV-CS質(zhì)粒圖譜。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的簡(jiǎn)單修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍；若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

實(shí)施例1

一、穩(wěn)定表達(dá)CA16和EV71的VP1的細(xì)胞的構(gòu)建

臨床及實(shí)驗(yàn)室確診的柯薩奇病毒A組16型（以下簡(jiǎn)稱CA16）和腸道病毒71型（以下簡(jiǎn)稱EV71）感染病例的標(biāo)本，使用病毒RNA提取試劑盒分別提取感染病例的病毒RNA，利用SuperScript III逆轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)引物，逆轉(zhuǎn)錄得到CA16和EV71的病毒cDNA。

以CA16和EV71病毒cDNA為模板，CA16-VP1基因的上游引物 ：5’- CCTAAGCTTTCTGGGTACTTTGACTATTACACC，下游引物5’- CAGCTCGAGTCATGTTGTTATCTTGTCTCTACTAC。EV71-VP1基因的上游引物 ：5’- CCTAAGCTTTATGCCCGAGATGGAGTGTTTGAC，下游引物5’- CAGCTCGAGTCATTTCCCAAGAGTGGTGATTGCTG。

擴(kuò)增反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min后進(jìn)入循環(huán)，94℃變性30s，52℃復(fù)性30s，72℃延伸2min，30個(gè)循環(huán)后72℃延伸5min。經(jīng)1.2％瓊脂糖凝膠電泳，回收相應(yīng)的產(chǎn)物片斷。PCR產(chǎn)物主帶大小約為1100bp左右，結(jié)果與預(yù)計(jì)相符（圖1）。

CA16和EV71毒株VP1 PCR產(chǎn)物，利用瓊脂糖凝膠電泳，回收預(yù)計(jì)大小的擴(kuò)增主帶，利用Hind III和Xho I對(duì)VP1片段和pCMV-C-Flag 質(zhì)粒（簡(jiǎn)稱pcFlag質(zhì)粒）進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物再次利用瓊脂糖凝膠電泳回收相應(yīng)片段，CA16和EV71毒株VP1分別與pCMV-C-Flag質(zhì)粒進(jìn)行連接（圖2）。CA16和EV71毒株VP1分別與pCMV-C-Flag質(zhì)粒進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后，經(jīng)抗性篩選的單菌落各挑選8個(gè)進(jìn)行菌落PCR鑒定，如圖3所示，CA16的VP1真核表達(dá)質(zhì)粒pcFlag-CA16-VP1和EV71的VP1真核表達(dá)質(zhì)粒pcFlag-EV71-VP1的16個(gè)菌落均能擴(kuò)增出相應(yīng)的VP1片段。

經(jīng)菌落PCR鑒定陽(yáng)性的菌落各挑取2個(gè)克隆進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和質(zhì)粒提取，進(jìn)行酶切鑒定，如圖4所示，經(jīng)Hind III和Xho I雙酶切后，均出現(xiàn)1100bp左右的VP1外源片段和約5kb的pcFlag載體片段。酶切鑒定的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果完全正確，質(zhì)粒分別命名為pcFlag-CA16-VP1和 pcFlag-EV71-VP1。

293T細(xì)胞、RD細(xì)胞、Vero細(xì)胞均用DMEM（含10% FBS）在37℃、5% CO₂、水飽和條件下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前，將生長(zhǎng)至95%以上融合率的細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞生長(zhǎng)20~24h至細(xì)胞密度達(dá)70~90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染操作按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑的操作手冊(cè)進(jìn)行。

經(jīng)酶切和測(cè)序驗(yàn)證的pcFlag-CA16-VP1和 pcFlag-EV71-VP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T和RD細(xì)胞，利用FLAG抗體進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)，在約32Kd的位置出現(xiàn)了預(yù)計(jì)大小條帶，表明真核表達(dá)質(zhì)粒可在293T和RD細(xì)胞中表達(dá)出FLAG融合的VP1重組蛋白。

pcFlag-CA16-VP1和 pcFlag-EV71-VP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，利用免疫熒光檢測(cè)重組VP1的表達(dá)，如圖5所示，CA16和EV71重組VP1蛋白主要分布于細(xì)胞胞漿中。

將pcFlag-CA16-VP1和 pcFlag-EV71-VP1質(zhì)粒，以1：1的比例共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后72h使用G418進(jìn)行篩選，經(jīng)過(guò)3周左右的篩選，獲得抗性細(xì)胞克隆，經(jīng)檢測(cè)得到穩(wěn)定表達(dá)CA16和EV71的VP1的Vero細(xì)胞系。

二、負(fù)載細(xì)胞因子基因的重組減毒腸道病毒株的制備

減毒腸道背景病毒株可使用減毒的柯薩奇病毒B組3型、或減毒的腸道病毒71型、或減毒的脊髓灰質(zhì)炎病毒I型（Sabin疫苗株）?？寺〔《径局甑娜L(zhǎng)，構(gòu)建感染性克隆和反向遺傳系統(tǒng)。

以脊髓灰質(zhì)炎病毒Sabin毒株I型為背景病毒，使用分段克隆的方式進(jìn)行克隆。引物序列如下：

通過(guò)橋聯(lián)PCR進(jìn)行全長(zhǎng)基因組的克隆，經(jīng)鑒定得到Sabin毒株I型反向遺傳質(zhì)粒系統(tǒng)（圖6-8）。然后利用PCR在Sabin毒株I型反向遺傳系統(tǒng)質(zhì)粒的P1和P2區(qū)，引入含有蛋白酶切位點(diǎn)的限制性酶切位點(diǎn)，然后插入霍亂毒素?zé)o毒B亞基基因片段。然后轉(zhuǎn)染至Vero細(xì)胞后拯救出含有負(fù)載細(xì)胞因子基因的重組減毒腸道病毒株Sabin毒株I型。

亦可使用pCV-CS質(zhì)粒，內(nèi)含減毒的柯薩奇病毒B組3型全基因組，以及含有蛋白酶切位點(diǎn)的限制性酶切位點(diǎn)（圖9），插入霍亂毒素?zé)o毒B亞基基因片段。然后轉(zhuǎn)染至Vero細(xì)胞后拯救出含有負(fù)載細(xì)胞因子基因的重組減毒腸道病毒株柯薩奇病毒B組3型。

含有負(fù)載細(xì)胞因子基因的重組減毒腸道病毒株Sabin毒株I型，或含有負(fù)載細(xì)胞因子基因的重組減毒腸道病毒株柯薩奇病毒B組3型，在穩(wěn)定表達(dá)CA16和EV71的VP1的Vero細(xì)胞系進(jìn)行感染，48h后收獲細(xì)胞上清，利用超速離心法獲得表型混合的重組腸道病毒。

SEQUENCE LISTING

<110> 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院

<120> 一種含細(xì)胞因子佐劑的重組腸道病毒表型混合系統(tǒng)的構(gòu)建方法及其應(yīng)用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> CA16-VP1基因的上游引物

<400> 1

cctaagcttt ctgggtactt tgactattac acc 33

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> CA16-VP1基因的下游引物

<400> 2

cagctcgagt catgttgtta tcttgtctct actac 35

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> EV71-VP1基因的上游引物

<400> 3

cctaagcttt atgcccgaga tggagtgttt gac 33

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> EV71-VP1基因的下游引物

<400> 4

cagctcgagt catttcccaa gagtggtgat tgctg 35