本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及鹽生植物溝葉結(jié)縷草中一個新的耐鹽基因ZmDUF1644及其植物表達載體和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

鹽脅迫顯著抑制植物生長發(fā)育，抗鹽種質(zhì)的培育利用顯得至關(guān)重要。常規(guī)育種如雜交輻射等方法為抗逆新品種做出了巨大貢獻，然而由于周期長、效率低，不足以滿足目前抗逆育種的需求；為了加快抗逆育種進程，快速高效的基因工程技術(shù)逐漸受到社會的關(guān)注，優(yōu)異抗逆基因的開發(fā)顯得至關(guān)重要；已有研究表明，轉(zhuǎn)高效抗逆調(diào)控基因的分子育種對提高植物抗逆性有積極作用。

研究發(fā)現(xiàn)，在植物中存在一類DUF1644基因家族，編碼的蛋白包括一段相對保守的160個氨基酸序列，其中含有9-10個半胱氨酸位點，然而其參與的植物生物學(xué)功能鮮有報道；近期從水稻中發(fā)現(xiàn)了一個受鹽脅迫誘導(dǎo)表達的OsSIDP366基因（編碼DUF1644家族蛋白），其過量表達顯著提高水稻耐鹽性（Guo.et al., 2015）。

本發(fā)明通過表達文庫篩選從鹽生植物溝葉結(jié)縷草中獲得了一個耐鹽候選基因ZmDUF1644，與水稻中一個未知功能的DUF1644蛋白（LOC4325319）具有56.55%相似性，與已發(fā)現(xiàn)的耐鹽基因OsSIDP366（LOC_Os06g47860）在序列上的相似性極低（僅24.59%）；由此，我們獲得的ZmDUF1644是一個新的耐鹽候選DUF1644家族基因；本發(fā)明的動因就是：將溝葉結(jié)縷草ZmDUF1644構(gòu)建到植物表達載體中，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法進行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得具有耐鹽特性的新種質(zhì)；本專利對于優(yōu)良作物新品種的培育及在生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用，具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對背景技術(shù)提出的培育耐鹽新種質(zhì)的問題，本發(fā)明的目的在于提供一個新的鹽生植物溝葉結(jié)縷草耐鹽基因ZmDUF1644。

本發(fā)明的另一目的在于該耐鹽基因ZmDUF1644的植物表達載體。

本發(fā)明所構(gòu)建的植物表達載體可直接用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化，創(chuàng)制耐鹽新種質(zhì)，可用于植物品種改良。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)。

溝葉結(jié)縷草耐鹽基因ZmDUF1644，該基因的序列為SEQ ID NO. 1。

含有本發(fā)明所述的溝葉結(jié)縷草耐鹽基因ZmDUF1644的植物表達載體，由所述的溝葉結(jié)縷草耐鹽基因ZmDUF1644與植物表達載體構(gòu)成。

所述的含有溝葉結(jié)縷草耐鹽基因ZmDUF1644的植物表達載體，優(yōu)選為BamHⅠ和NotⅠ雙酶切ZmDUF1644后插入到gateway入門載體pENTR1A后與pEarleyGate103表達載體質(zhì)粒進行重組反應(yīng)得到。

本發(fā)明所述的含有溝葉結(jié)縷草耐鹽基因ZmDUF1644的植物表達載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟：（1）ZmDUF1644基因全長的克?。涸O(shè)計引物ZmDUF1644-F: SEQ ID NO.2和ZmDUF1644-R: SEQ ID NO.3，以溝葉結(jié)縷草cDNA為模板，進行PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T Simple載體，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，提取陽性質(zhì)粒并測序獲得基因全長序列為SEQ ID NO. 1；（2）pENTR1A-ZmDUF1644質(zhì)粒構(gòu)建：設(shè)計引物ZmDUF1644-BamHⅠ-F: SEQ ID NO.4和ZmDUF1644-NotⅠ-R: SEQ ID NO.5，以步驟（1）中的陽性測序質(zhì)粒為模板，用高保真酶進行PCR反應(yīng)，獲得在上游和下游分別引入BamHⅠ和NotⅠ酶切位點的ZmDUF1644基因，PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T Simple載體，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，提取陽性質(zhì)粒pMD19-T Simple-ZmDUF1644；BamHⅠ和NotⅠ分別對陽性質(zhì)粒pMD19-TSimple-ZmDUF1644和pENTR1A進行雙酶切，取酶切后的ZmDUF1644片段與BamHⅠ和NotⅠ雙酶切的pENTR1A連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞；37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取陽性單克隆擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒pENTR1A-ZmDUF1644；（3）提取的陽性質(zhì)粒pENTR1A-ZmDUF1644經(jīng)PvuⅠ單酶切線性化后與pEarleyGate103載體質(zhì)粒進行LR重組反應(yīng)，轉(zhuǎn)化，提取陽性質(zhì)粒，電泳檢測并測序驗證為SEQ ID NO. 1，植物表達載體pEarleyGate103-ZmDUF1644構(gòu)建成功。

本發(fā)明所述的溝葉結(jié)縷草耐鹽基因ZmDUF1644在創(chuàng)建耐鹽新種質(zhì)中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述的植物表達載體在創(chuàng)建耐鹽新種質(zhì)中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果

1．本發(fā)明提供的溝葉結(jié)縷草ZmDUF1644是一個新的耐鹽基因，該基因可提高植物耐鹽性；

2．本發(fā)明構(gòu)建的溝葉結(jié)縷草ZmDUF1644植物表達載體為首次報道，可直接用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，創(chuàng)造耐鹽新種質(zhì)，提高植物的耐鹽性，可進行植物品種改良。

附圖說明

圖1 ZmDUF1644瓊脂糖凝膠電泳分析

M：DNA Marker

1：ZmDUF1644；2：pMD19-T Simple-ZmDUF1644 質(zhì)粒BamHⅠ和NotⅠ雙酶切

3：pEarleyGate103-ZmDUF1644 表達載體電泳檢測圖

圖2 植物表達載體pEarleyGate103-ZmDUF1644構(gòu)建流程圖

圖3 野生型（WT）與轉(zhuǎn)基因擬南芥（ZmDUF1644）PCR鑒定

圖4 野生型與轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗期耐鹽性評價

圖5 野生型與轉(zhuǎn)基因擬南芥成苗期耐鹽性評價

具體實施方式

實施例1 溝葉結(jié)縷草ZmDUF1644的克隆。

選用溝葉結(jié)縷草（Zoysia matrella）作為材料，選取健康的草皮塊，置于裝滿石英砂的杯中，于1/2 Hongland營養(yǎng)液水培20天后，轉(zhuǎn)入到含300mM NaCl的1/2 Hongland營養(yǎng)液中處理7d，取0.1g幼嫩葉片，參照Trizol RNA提取試劑盒（TaKaRa）說明書方法，提取葉片總RNA，按照M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）取1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用RNase消化cDNA產(chǎn)物，設(shè)計引物擴增ZmDUF1644；

上游引物ZmDUF1644-F: 5′-ATGCCAAAGGACAGGAGC-3′（SEQ ID NO.2）；

下游引物ZmDUF1644-R: 5′-TTGTGCAGGGTCACCGTC-3′（SEQ ID NO.3）。

以提取的葉片cDNA為模板，進行PCR反應(yīng)，20 μL反應(yīng)體系：2×LA RCR Mix 10 μL，ZmDUF1644-F、ZmDUF1644-R引物各1.0 μL（10 μmol·L^-1），cDNA模板 1 μL，ddH₂O 7 μL；反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min，然后94 ℃解鏈30 sec，58 ℃退火30 sec，72 ℃延伸1 min 30 sec，反應(yīng)30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min；PCR產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒（AXYGEN）回收純化，用T₄DNA連接酶（TaKaRa）連接到pMD19-T Simple載體（TaKaRa），轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒并測序為SEQ ID NO.1。

實施例2. 植物表達載體pEarleyGate103-ZmDUF1644的構(gòu)建。

設(shè)計引物進行PCR反應(yīng)，在目的基因ZmDUF1644的上游和下游分別引入酶切位點BamHⅠ和NotⅠ，PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T Simple載體，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，提取陽性質(zhì)粒，BamHⅠ和NotⅠ雙酶切的ZmDUF1644片段與BamHⅠ和NotⅠ雙酶切的pENTR1A連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提取的陽性質(zhì)粒經(jīng)NsiⅠ單酶切線性化后與pEarleyGate103載體質(zhì)粒進行LR重組反應(yīng)（Invitrogen），轉(zhuǎn)化，提取陽性質(zhì)粒，電泳檢測并測序驗證為SEQ ID NO.1；

上游引物ZmDUF1644-BamHⅠ-F：5′-GGATCCGGATGCCAAAGGACAGGAGC-3′（SEQ ID NO.4）；

下游引物ZmDUF1644-NotⅠ-R：5′-GCGGCCGCGATTGTGCAGGGTCACCGTC-3′（SEQ ID NO.5）。

①以實施例1中提取的陽性測序質(zhì)粒作為模板，用高保真酶（PrimeSTAR^TM HS DNA Polymerase，TaKaRa）進行PCR反應(yīng)，25 μL反應(yīng)體系：10×HS RCR Buffer 2.5 μL，ZmDUF1644-BamHⅠ-F、ZmDUF1644-NotⅠ-R引物各1.0 μL (10 μmol·L^-1)，dNTP mix 2.0 μL (2.5 mmol·L^-1)，PrimeSTAR^TM HS DNA Polymerase 0.2 μL，cDNA模板 1 μL，ddH₂O 17.3 μL；反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min，然后94 ℃解鏈30 sec，62 ℃退火30 sec，72 ℃延伸1 min 30 sec，反應(yīng)30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min；PCR產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒（AXYGEN, USA）回收，連接到pMD19-T Simple載體，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，提取陽性質(zhì)粒pMD19-T Simple-ZmDUF1644并測序驗證。

②取gateway入門載體pENTR1A (Invitrogen) 和pMD19-T Simple-ZmDUF1644用BamHⅠ和NotⅠ雙酶切，雙酶切體系（40 μL）：10×K Buffer 2 μL，0.1% BSA 4 μL，質(zhì)粒pENTR1A或pMD19-T Simple-ZmDUF1644 15 μL，BamHⅠ2 μL，NotⅠ2 μL，ddH₂O 15 μL；37 ℃反應(yīng)2 h；雙酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，用凝膠回收試劑盒（AXYGEN）回收質(zhì)粒pENTR1A大片段和pMD19-T Simple-ZmDUF1644小片段。用TaKaRa連接體系連接兩個回收的產(chǎn)物，反應(yīng)體系（5 μL）：SolutionⅠ2.5 μL，pENTR1A大片段0.5 μL，pMD19-T Simple-ZmDUF1644小片段2 μL；16 ℃連接2h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞。37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取陽性單克隆擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒pENTR1A-ZmDUF1644。

③取質(zhì)粒pENTR1A-ZmDUF1644用PvuⅠ單酶切，酶切體系（40 μL）：10×K Buffer 4 μL，質(zhì)粒pENTR1A-ZmDUF1644 15 μL，PvuⅠ2 μL，ddH₂O 19 μL；37 ℃反應(yīng)2 h，用凝膠回收試劑盒（AXYGEN）回收質(zhì)粒pENTR1A-PvuⅠ片段。將回收的片段與pEarleyGate103載體質(zhì)粒進行LR重組反應(yīng)，反應(yīng)體系（5 μL）：pENTR1A-ZmDUF1644大片段3 μL，pEarleyGate103質(zhì)粒1 μL，LR Clonase^TMⅡ enzyme mix 1 μL；25 ℃反應(yīng)1 h，加入1 μL Proteinase K，37 ℃反應(yīng)10 min；重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取陽性單克隆擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒pEarleyGate103-ZmDUF1644，電泳和測序驗證為SEQ ID NO.1。植物表達載體pEarleyGate103-ZmDUF1644的構(gòu)建成功。

實施例3 植物表達載體pEarleyGate103-ZmDUF1644遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥及其耐鹽性鑒定。①農(nóng)桿菌菌株EHA105感受態(tài)制備及凍融法轉(zhuǎn)化：從YEB（50 μg/mL 利福平）平板上挑取EHA105單菌落，接種于50 mL 含50 μg/mL 利福平的YEB液體培養(yǎng)基中，220 rpm，28℃培養(yǎng)至OD值0.6，而后冰浴菌液30 min，離心收集菌體，懸浮于2 mL預(yù)冷的100mM CaCl₂ （20%甘油）溶液中，200 μL/管分裝，待用；取5 μL pEarleyGate103-ZmDUF1644載體質(zhì)粒，加入100 μL 感受態(tài)細(xì)胞，冰浴30 min，液氮冷凍5 min，37℃ 5 min，加入800 μL YEB 液體培養(yǎng)基，28℃ 200 rpm預(yù)培養(yǎng)3 h，菌液涂板于YEB（50 μg/mL 利福平 + 50 μg/mL卡那霉素）固體培養(yǎng)基上，28℃ 暗培養(yǎng)2天，挑取單克隆檢測，選取陽性克隆搖菌，用于擬南芥花序轉(zhuǎn)化。

②擬南芥花序浸染及種子篩選：將陽性單克隆接到50 mL 的YEB（50 μg/mL 利福平 + 50 μg/mL卡那霉素）液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)36小時，5000 rpm離心20分鐘，然后用轉(zhuǎn)化液（5%蔗糖+500μL/L的Silwet L-77）劇烈懸浮沉淀至完全懸起。將擬南芥地上部分直接浸泡于上述懸浮液中1分鐘，然后用保鮮膜完全包裹植株以保濕，放回培養(yǎng)室培養(yǎng)24小時，打開保鮮膜，待種子成熟時采收。

③種子消毒于播種：將種子放入5mL的離心管中，加入50%巴斯消毒液，添加0.1%的Triton X-100搖晃15分鐘，然后在超凈臺中用無菌水洗5次，而后直接把種子倒在滅菌過的濾紙上，吹干種子（放置1小時），輕輕敲擊濾紙將干種子均勻撒播到篩選培養(yǎng)基（1/2MS + 20mg/L 草胺磷 + 25mg/L氨芐青霉素）篩選培養(yǎng)10天，然后將抗性苗移栽到土中，用透明的蓋子覆蓋幼苗1周以保濕。待抗性苗7～8片葉，提取擬南芥葉片DNA，PCR（引物ZmDUF1644-F和ZmDUF1644-R）鑒定（圖3）。

④耐鹽評價：經(jīng)PCR鑒定的T₁代轉(zhuǎn)基因苗繼續(xù)生長，采收T₂代種子。對野生型和T₂代抗性轉(zhuǎn)基因擬南芥進行鹽處理，一方面將種子置于培養(yǎng)基鹽處理（0mM和120mM NaCl+MS培養(yǎng)基）培養(yǎng)14天（圖4），一方面將生長14天擬南芥成苗種植于土壤中采用150mM和200mM 的NaCl鹽溶液進行澆灌后生長14天（圖5），發(fā)現(xiàn)3個轉(zhuǎn)ZmDUF1644基因擬南芥的生長明顯優(yōu)于野生型擬南芥（圖4和5），耐鹽性顯著提高。

綜上所述，本發(fā)明構(gòu)建了含有耐鹽基因的植物表達載體pEarleyGate103-ZmDUF1644，其中ZmDUF1644首次報道。所構(gòu)建的載體可導(dǎo)入植物中，提高植物的耐鹽特性。

<110> 江蘇省中國科學(xué)院植物研究所

<120> 一個新的植物耐鹽基因ZmDUF1644及其表達載體和應(yīng)用

<160> 5

<210> 1

<211> 1023

<212> DNA

<213> 溝葉結(jié)縷草（Zoysia matrella）

<220>

<223> 溝葉結(jié)縷草耐鹽基因ZmDUF1644核苷酸序列

<400> 1

atgcc aaagg acagg agctc ccatg gcgcc tcttc tgaga gccgc tggtc acgtg gttct 60

ccgta cattg tgtct cgtgg aggga gcagc acttc tcgcc ggtct aagga gtctt cggca 120

gccac agcca ctgca aactt atcac cgaat cgacg gagta ggggt tctca ccgct cagag 180

gagtc ctctg cagct gcagc cgtgg ctgca gcgaa gctgg ctgct gaatg ggagg atgtt 240

cgctg ccctg tgtgc atgga tcacc cacac aatgc agtcc tgctg atctg ctcgt cacac 300

gagaa gggat gccgc ccatt catgt gtgac acgag caccc ggcac tccaa ctgcc tcgat 360

cagta ctgca aggcc ttcca ggagt cttcc aaaga tccag gggcg gcagc atcag cagag 420

tgcag cgagt gccag cagcc ggtga atctt tcgtg tccac tatgc cgcgg tcctg tcagc 480

cattg gatca aggat tacaa cgcga ggagg cacat ggact gcaag gttag gtctt gcacc 540

atgga gtcct gtgag ttcag gggcg tgtac agcgt gctga gaaag catgc caagg aggaa 600

catcc tttgg tgaag ccgat ggagg tggac ccagc gcggc agcgc gactg gcgca ggatg 660

gagca gcagc gtgat attgg ggact tgctg agcat gttgc gttct gggtt tagca gcagc 720

cttga tgatg ccggg cttgt ggcca atgaa gaagg ggaac aggag atcac agaga gggtt 780

ctgca tagtc acggc caggg ccatt ccatt acaat gatct ttatt atgcg atcaa ccagc 840

tcgat gcagc ggcac acatc tggcc gcagc aggct tgttt tggtc agccg ttctg tcgac 900

ggagc aagca gcagt ggtga cactg acacc aacgg ccttg acaac gaaga agatg ataac 960

cctgc gccgt caacg gaggt atcac agcat gacgc tgaag aagcg gacgg tgacc ctgca 1020

caa 1023

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> PCR反應(yīng)擴增ZmDUF1644基因用上游引物ZmDUF1644-F

<400> 2

atgccaaagg acaggagc 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> PCR反應(yīng)擴增ZmDUF1644基因用下游引物ZmDUF1644-R

<400> 3

ttgtgcaggg tcaccgtc 18

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> PCR反應(yīng)擴增ZmDUF1644基因引入BamH I酶切位點用上游引物ZmDUF1644-BamH I-F

<400> 4

ggatccggat gccaaaggac aggagc 26

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> PCR反應(yīng)擴增ZmDUF1644基因引入Not I酶切位點用下游引物ZmDUF1644- Not I-R

<400> 5

gcggccgcga ttgtgcaggg tcaccgtc 28