本發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)和基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種玉米MS8基因突變體ms8-4505及其分子鑒定方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

植物雄性不育突變是自然界中十分普遍的現(xiàn)象，至少己在43個(gè)科、162個(gè)屬的617個(gè)物種中發(fā)現(xiàn)了雄性不育突變體。在遺傳上植物雄性不育分為細(xì)胞核雄性不育，細(xì)胞質(zhì)雄性不育和細(xì)胞核細(xì)胞質(zhì)互作雄性不育三大類：1)細(xì)胞核雄性不育由細(xì)胞核基因突變產(chǎn)生，有顯性突變和隱性突變，有孢子體基因突變和配子體基因突變。顯性突變和配子體基因突變只能通過(guò)雌配子遺傳，隱性突變既可通過(guò)雌配子也可通過(guò)雄配子進(jìn)行遺傳，而且遵循孟德?tīng)柖?。目前已克隆了一些孢子體隱性核不育基因，如擬南芥的ms2，玉米的ms45和水稻的mil1等；一些配子體隱性核不育基因也被克隆，如擬南芥的兩個(gè)小孢子有絲分裂異常的突變體sidecar pollen和gemini pollen；玉米上還克隆了一個(gè)孢子體顯性核不育基因MS44(Cigan and Albertsen，1998，Reversible nuclear genetic system for male sterility in transgenic plants，US5750868)；2)細(xì)胞質(zhì)雄性不育則是由細(xì)胞質(zhì)基因控制，并沒(méi)有相對(duì)應(yīng)的核恢復(fù)基因，屬母性遺傳；3)細(xì)胞核細(xì)胞質(zhì)互作雄性不育由細(xì)胞質(zhì)基因和細(xì)胞核基因共同控制，其實(shí)質(zhì)是細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核遺傳物質(zhì)不和的結(jié)果。不育細(xì)胞質(zhì)是一些由突變線粒體基因引起，但有相對(duì)應(yīng)的核恢復(fù)基因，能抑制不育細(xì)胞質(zhì)基因。不育細(xì)胞質(zhì)基因可產(chǎn)生一種新的蛋白質(zhì)，夠影響線粒體正常功能(Chen and Liu，2014，Male sterility and fertility restoration in crops，Annu Rev Plant Biol，65:5.1-5.28)。在育恢復(fù)基因方面，目前水稻中已經(jīng)克隆了Rf-1，Rf-2，Rf-4，Rf-5等基因。

玉米已成為我國(guó)第一大糧食作物，播種面積達(dá)到5.5億畝，是飼料、食品加工、生物能源的重要原料，在國(guó)外也是消費(fèi)量最大的蔬菜之一。目前國(guó)內(nèi)種植的玉米幾乎全部為雜交玉米。玉米雜交授粉主要通過(guò)人工去雄進(jìn)行雜交，需耗費(fèi)大量的勞動(dòng)力，成本高昂；而且由于去雄損傷玉米頂部葉片，會(huì)造成制種產(chǎn)量損失。利用雄性不育系制種可解決人工去雄帶來(lái)的問(wèn)題。但玉米中曾經(jīng)應(yīng)用的胞質(zhì)雄性不育系存在一些缺陷：首先由于胞質(zhì)雄性不育系需要特定的恢復(fù)基因恢復(fù)育性，因此種質(zhì)資源利用率很低，限制了優(yōu)良品種的選育效率；其次部分不育系育性不穩(wěn)定，在特定條件下可恢復(fù)育性，影響雜交種的純度；最后，由于胞質(zhì)基因型單一，造成玉米斑病大爆發(fā)，直接導(dǎo)致胞質(zhì)雄性不育技術(shù)退出市場(chǎng)。普通核不育則可避免這些問(wèn)題，如在玉米中得以應(yīng)用，不但可以節(jié)省人工去雄所需的勞動(dòng)力成本，而且可以提高制種產(chǎn)量。

通過(guò)自然突變體鑒定和人工誘變?nèi)缥锢磔椛?，化學(xué)處理，組織培養(yǎng)等方法，人們?cè)谟衩字蝎@得了多種不育突變體。MS8突變體是其中之一。玉米MS8基因有9個(gè)外顯子，編碼一個(gè)β-1,3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶類蛋白，可能與脂類物質(zhì)合成有關(guān)，但其確切底物還未發(fā)現(xiàn)；MS8功能缺失影響了玉米花藥表皮和絨粘層分化，進(jìn)而導(dǎo)致雄性不育；除花藥外，MS8在其它組織也有少量表達(dá)，但在ms8突變體中這些組織沒(méi)有突變表型(Wang等,2013,Maize Male sterile 8(Ms8),a putativeβ-1,3-galactosyltransferase,modulates cell division,expansion,and differentiation during early maize anther development.Plant Reprod,26:329–338)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種玉米MS8基因突變體ms8-4505及其分子鑒定方法和應(yīng)用。

本發(fā)明首先對(duì)玉米品種京科糯2000種子(M₀代)進(jìn)行鈷60輻射誘變處理，種植處理的種子獲M₁代植株；M₁代植株自交產(chǎn)生種子(為M₂代)，種植M₂代植株，對(duì)M₂代植株進(jìn)行形態(tài)學(xué)，組織學(xué)和遺傳學(xué)鑒定，篩選不育植株；然后對(duì)不育植株進(jìn)行基因測(cè)序和DNA序列分析，在分子水平上進(jìn)行驗(yàn)證。最后獲得純合不育單株，并用于雜交育種和生物技術(shù)研究。

本發(fā)明提供的玉米MS8基因突變體ms8-4505，其為玉米MS8基因編碼區(qū)第814個(gè)堿基，即基因組序列中起始密碼子起第1302位堿基，由T突變?yōu)镃，導(dǎo)致一個(gè)酪氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€(gè)組氨酸；該突變位點(diǎn)位于第6個(gè)外顯子。

進(jìn)一步地，玉米MS8基因突變體ms8-4505，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；其編碼的蛋白序列如SEQ ID No.2所示。

本發(fā)明提供了含有本發(fā)明所述玉米MS8基因突變體ms8-4505的表達(dá)載體。

本發(fā)明提供了含有上述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。

本發(fā)明提供了玉米MS8基因突變體ms8-4505在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了玉米MS8基因突變體ms8-4505在制備隱性雄性核不育的轉(zhuǎn)基因玉米中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了玉米MS8基因突變體ms8-4505在玉米改良育種、制種中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了檢測(cè)玉米MS8基因突變體ms8-4505的分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記是由以下一組引物擴(kuò)增得到，所述引物對(duì)的核苷酸序列為：

上游引物4505_F1：GACGCGCCCGAGGGTGT(如SEQ ID NO.3所示)；

下游引物4505_R1：ACTCTGGCTCGTGGTACTTGACTCCT(如SEQ ID NO.4所示)；

上游引物4505_R2：GACTTCATGCAGCCGACGTG(如SEQ ID NO.5所示)；

下游引物4505_F2：CCAAGACCAGGACCTACTTCACCACC(如SEQ ID NO.6所示)。

本發(fā)明提供了上述分子標(biāo)記在制備隱性雄性核不育的轉(zhuǎn)基因玉米中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了上述分子標(biāo)記在玉米種質(zhì)資源改良中的應(yīng)用。

一種玉米MS8基因突變體ms8-4505的分子標(biāo)記的方法，通過(guò)下述一組引物擴(kuò)增待檢植物基因組DNA，并檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物：

上游引物4505_F1：GACGCGCCCGAGGGTGT(如SEQ ID NO.3所示)；

下游引物4505_R1：ACTCTGGCTCGTGGTACTTGACTCCT(如SEQ ID NO.4所示)；

上游引物4505_R2：GACTTCATGCAGCCGACGTG(如SEQ ID NO.5所示)；

下游引物4505_F2：CCAAGACCAGGACCTACTTCACCACC(如SEQ ID NO.6所示)。

PCR反應(yīng)體系為：1μL 10×反應(yīng)緩沖液，0.25μL dNTP，0.25μL正向引物和0.25μL反向引物，0.5U Taq酶，1μL 10ng/μL模板DNA，加超純水將總體積補(bǔ)至10μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4-98℃變性1-3min，然后執(zhí)行以下循環(huán)：95℃變性20s，53-58℃復(fù)性20s，72℃延伸30s，30-40個(gè)循環(huán)。

擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5％瓊脂糖凝膠中，5V/cm電場(chǎng)下電泳30min，在凝膠成像系統(tǒng)中記錄電泳圖像。

如果用上述引物對(duì)擴(kuò)增出的產(chǎn)物為501bp和191bp，則標(biāo)志著該待檢植物MS8基因型為野生型；如果擴(kuò)增產(chǎn)物為501bp和247bp，則標(biāo)志著該待檢植物MS8基因型為ms8-4505突變體；如果擴(kuò)增產(chǎn)物為501bp、247bp和191bp三條帶型，則標(biāo)志著該待檢植物MS8基因型為野生型和ms8-4505突變體的雜合基因型。

本發(fā)明還提供了用于檢測(cè)玉米MS8基因突變體ms8-4505的引物組合，含有4條引物，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO.3-6所示。

含有上述引物組合的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明提供了上述引物組合或含有其的試劑盒在玉米育種、制種中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了上述引物組合或含有其的試劑盒在制備轉(zhuǎn)基因玉中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了上述引物組合或含有其的試劑盒在制備隱性雄性核不育的轉(zhuǎn)基因玉米中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的突變體ms8-4505優(yōu)點(diǎn)如下：

(1)該突變體只影響雄性育性，造成雄性完全不育，但對(duì)雌雄育性和其它農(nóng)藝性狀沒(méi)有影響。

(2)該突變體為基因內(nèi)點(diǎn)突變，不會(huì)影響MS8兩側(cè)相鄰基因的功能。

(3)該突變體為點(diǎn)突變，可設(shè)計(jì)為CAPS、多引物標(biāo)記，用最廣泛使用的瓊脂糖凝膠電泳即可完成檢測(cè)；同時(shí)也適用于中、高通量的單核苷酸多態(tài)(SNP)檢測(cè)技術(shù)。

(4)該突變體為點(diǎn)突變，利于研究特定氨基酸殘基與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能的關(guān)系。

附圖說(shuō)明

圖1是實(shí)施例2中4505突變體的花藥和果穗。

圖2是實(shí)施例3中野生型和4505突變體的花粉I₂-KI染色結(jié)果。

圖3是實(shí)施例6中4505突變體MS8基因的突變位點(diǎn)示意圖。

圖4是實(shí)施例7中野生型京科糯2000、4505分離株系中的突變體、和分離株系中野生型MS8基因分子標(biāo)記鑒定的電泳結(jié)果。

圖5是實(shí)施例8中所描述的雜交轉(zhuǎn)育的技術(shù)路線圖。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。

若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

實(shí)施例1鈷60輻射誘變突變體庫(kù)

2015年9月，于長(zhǎng)沙用鈷60(⁶⁰Co)輻射京科糯2000種子(M₀代)3公斤，輻射劑量250Gy。輻射的種子于2015年10月種植于海南三亞市崖城區(qū)田間，分單株嚴(yán)格自交，收獲M₁代種子。

選取M₁代種子5400個(gè)株系，每個(gè)株系種植50棵單株，于2016年2月種植于海南臨高田間。在苗期、抽穗期、開(kāi)花期、灌漿期等經(jīng)過(guò)仔細(xì)觀察田間性狀，篩查株型、穗型、育性、產(chǎn)量等各種類型突變體，對(duì)各類型突變體單株收種保存。

實(shí)施例2M₂代種植與性狀觀察

在M₂代抽穗、開(kāi)花期間，在田間對(duì)花藥的形態(tài)進(jìn)行觀察，選取顏色淺白、形態(tài)小、花粉量小等表現(xiàn)異常的花藥在顯微鏡下進(jìn)行進(jìn)一步鏡檢。在編號(hào)為4505的家系中發(fā)現(xiàn)6株育性異常的植株。該突變體花藥比野生型癟小，顏色淺黃，無(wú)可見(jiàn)花粉，但在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、抽穗期、穗型均與野生型沒(méi)有明顯區(qū)別，被選作候選突變體材料進(jìn)行下一步研究。

實(shí)施例3花粉鏡檢，自交，異交

通過(guò)碘染著色與不著色花粉比例，統(tǒng)計(jì)花粉育性。在體式顯微鏡下觀察4505突變體雄花形態(tài)，花藥比野生型小，顏色較淺(見(jiàn)圖1)。田間采集開(kāi)花期小花，用鑷子取出花藥，在碘-碘化鉀溶液(0.6％KI，0.3％I₂，w/w)中輕輕擠壓花藥，滴在載玻片上，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察花粉碘染情況并拍照。野生型花粉多而染成藍(lán)黑色，而突變體則看不到花粉粒(圖2)。

突變體開(kāi)放授粉下可正常結(jié)實(shí)(圖1)，表明該突變體為雄性不育突變體，雌性不受影響。對(duì)同家系野生型進(jìn)行套袋自交，均正常結(jié)實(shí)，獲得10個(gè)M3株系的種子，將M3種子播種，抽穗后鑒定育性，其中2個(gè)株系的雄性育性發(fā)生分離。將分離株系的花藥碘染后在顯微鏡下觀察，其中88株花粉正常碘染，27株無(wú)花粉，符合3:1分離，表明該不育性狀由單個(gè)隱性基因控制。

實(shí)施例4葉片采樣與DNA提取

采用CTAB法提取玉米葉片DNA，具體方法如下：稱取約0.1g葉片，放入離心管，加入600μL CTAB提取緩沖液，5μL RNase A，震蕩分散，65℃水浴0.5hr，其間輕搖2-3次；加入等體積氯仿/Tris-飽和酚(1:1，v/v)，混勻，輕搖10min；4℃10000rpm離心20min；轉(zhuǎn)移上清至新管，加入1/10體積的3M乙酸鈉(pH值5.2)、0.6-1倍體積的冷異丙醇；輕搖混勻，至絮狀沉淀出現(xiàn)；4℃10000rpm離心10min；棄去上清，用體積百分含量70％乙醇洗沉淀2次；風(fēng)干，加入50μL 1×TE溶解沉淀，-20℃保存。用Nanodrop2000檢測(cè)DNA濃度，稀釋至10ng/L用作PCR模板。

實(shí)施例5PCR反應(yīng)與產(chǎn)物回收

根據(jù)玉米自交系B73的MS8基因序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增野生型京科糯2000和4505突變體的基因組DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后拼接出完整序列。用于擴(kuò)增玉米MS8的引物對(duì)序列見(jiàn)下表1：

表1用于擴(kuò)增玉米MS8的引物對(duì)序列

PCR反應(yīng)體系為：1μL 10×反應(yīng)緩沖液，0.25μL dNTP，0.25μL正向引物和0.25μL反向引物，0.5U Taq酶，1μL 10ng/μL模板DNA，加超純水將總體積補(bǔ)至10μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4-98℃變性1-3min，然后執(zhí)行以下循環(huán)：95℃變性20s，53-58℃復(fù)性20s，72℃延伸30s，30-40個(gè)循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后72℃補(bǔ)充延伸3-10min，結(jié)束反應(yīng)。配置1.5％瓊脂糖凝膠，在5V/cm電場(chǎng)下電泳30min；采用市面DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

實(shí)施例6DNA序列分析與突變位點(diǎn)的確定

將回收所得野生型與突變體的PCR產(chǎn)物DNA采用ABI3730測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物分別使用正向引物與反向引物。使用常見(jiàn)DNA序列分析軟件DNAman6.0對(duì)雙向測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接；4505突變體MS8基因全長(zhǎng)核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，由2031個(gè)堿基組成，將玉米MS8基因的該突變體基因命名為ms8-4505。對(duì)野生型和突變體序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在野生型京科糯2000的MS8基因編碼區(qū)第814位堿基，即基因組序列中起始密碼子起第1302位堿基由T突變?yōu)镃，導(dǎo)致其翻譯的蛋白質(zhì)第272位氨基酸由酪氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榻M氨酸。ms8-4505突變基因編碼的蛋白序列如SEQ ID NO.1所示。該突變位點(diǎn)位于第6個(gè)外顯子。MS8基因結(jié)構(gòu)及ms8-4505突變位點(diǎn)見(jiàn)圖3。

實(shí)施例7突變位點(diǎn)分子標(biāo)記設(shè)計(jì)與基因型鑒定

根據(jù)實(shí)施例6中得到的突變位點(diǎn)兩側(cè)的序列設(shè)計(jì)4條基因特異引物：正向引物4505_F1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；反向引物4505_R1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；反向引物4505_R2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；正向引物4505_F2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。其中4505_F1和4505_R2的5’末端堿基分別與突變位點(diǎn)的野生型與突變體的堿基相同，4505_F2和4505_R1位于突變位點(diǎn)較遠(yuǎn)的兩側(cè)，5’末端向內(nèi)。

用上述引物對(duì)擴(kuò)增出的產(chǎn)物如果為501bp和191bp，則標(biāo)志著該待檢植物MS8基因型為野生型；如果擴(kuò)增產(chǎn)物為501bp和247bp，則標(biāo)志著該待檢植物MS8基因型為ms8-4505突變體；如果擴(kuò)增產(chǎn)物為501bp、247bp和191bp三條帶型，則標(biāo)志著該待檢植物MS8基因型為野生型和ms8-4505突變體的雜合基因型。

在實(shí)施例3中獲得的有表型分離的M3群體中，隨機(jī)選取野生型和突變體表型的植株，提取葉片DNA，與京科糯2000基因組DNA一起，分別用上述引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：10×反應(yīng)緩沖液1μL，dNTP 0.25μL，引物4505_F1、4505_F2、4505_R1和4505_R2各0.25μL，Taq酶0.5U，10ng/μL模板DNA 1μL，加超純水將總體積補(bǔ)至10μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃變性3min，然后執(zhí)行以下循環(huán)：95℃變性20s，53-58℃復(fù)性20s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)。

擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5％瓊脂糖凝膠中，5V/cm電場(chǎng)下電泳30min，在凝膠成像系統(tǒng)中記錄電泳圖像。

結(jié)果見(jiàn)圖4，野生型對(duì)照的擴(kuò)增產(chǎn)物為501bp+191bp；4505家系中突變體的擴(kuò)增產(chǎn)物均為501bp+247bp；所有的分離家系中的野生型擴(kuò)增為501bp+191bp或501bp+191bp+247bp，而沒(méi)有501bp+247bp帶型。這一結(jié)果表明實(shí)施例6中所述突變位點(diǎn)與隱性核雄性不育基因是共分離的。這一結(jié)果結(jié)合該突變體的突變表型、突變位點(diǎn)，以及已發(fā)表文獻(xiàn)中的表型描述，可推斷4505突變體的雄性不育表型是由實(shí)施例6中所述的點(diǎn)突變?cè)斐傻摹?/p>

實(shí)施例8突變基因的雜交轉(zhuǎn)育

可按圖5的步驟將4505的不育基因ms8-4505通過(guò)雜交轉(zhuǎn)育到其它玉米遺傳背景中：

①雜交：

以4505為母本，與受體玉米材料為父本雜交獲得F₁種子；

②第一輪回交：

F₁播種后獲得F₁植株，將F₁植株與輪回親本進(jìn)行雜交，獲得BC₁種子；

③BC₁不育基因選擇(前景選擇)：

播種BC₁種子，獲得不少于500株幼苗，在幼苗期采集各單株葉片，以實(shí)施例4中所述方法提取DNA，以實(shí)施例7中所列的引物組(4505_F1、4505_R1、4505_F2和4505_R2)進(jìn)行擴(kuò)增、酶切和電泳，選取基因型為雜合的單株繼續(xù)種植，棄去純合野生型的單株；

④BC₁背景選擇：

采用一組(例如100個(gè)，或200個(gè)等)在突變體4505和輪回親本之間存在多態(tài)的，且在基因組上均勻分布的分子標(biāo)記(可以是但不限于SSR、SNP、EST、RFLP、AFLP、RAPD、SCAR等類型標(biāo)記)，對(duì)步驟③中選出的單株進(jìn)行鑒定，選取與輪回親本相似度高(例如大于88％相似度，或2％中選率等)的材料；

⑤第二輪回交：用步驟④中選出的單株為父本，為輪回親本授粉，獲得BC₂種子；

⑥BC₂的前景與背景選擇：對(duì)選出的材料重復(fù)步驟③至步驟④的操作，選出與輪回親本相似度高于選擇標(biāo)準(zhǔn)(如相似度大于98％，或2％中選率等)的BC₂代植株；

⑦自交獲得BC₂F₂種子：對(duì)步驟⑥中選出的BC₂植株進(jìn)行自交，獲得BC₂F₂種子；

⑧BC₂F₂的前景選擇：將步驟⑦中獲得的BC₂F₂種子播種，獲得500株以上幼苗，在幼苗期采集葉片，以實(shí)施例4中所述方法提取DNA，以實(shí)施例7中所列的引物組(4505_F1、4505_R1、4505_F2和4505_R2)進(jìn)行擴(kuò)增、酶切和電泳，選出帶型為純合突變體和雜合型的單株繼續(xù)栽培，丟棄純合野生型的單株；

⑨BC₂F₂的背景選擇及應(yīng)用：將步驟⑧中選出的單株按照步驟④的方法進(jìn)行背景篩選，選出100％背景純合的單株。如果中選單株的基因型為純合突變體，則該單株為最終目標(biāo)材料，可進(jìn)一步與輪回親本雜交保存材料，或與其它玉米材料進(jìn)行雜交。如果中選單株是雜合帶型，可直接用于保存種質(zhì)，或通過(guò)自交獲得不育株用于雜交育種或制種。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 海南波蓮水稻基因科技有限公司

<120> 一種玉米MS8基因突變體及其分子鑒定方法和應(yīng)用

<130> KHP161117253.7Q

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2002

<212> DNA

<213> 玉米

<400> 1

atgctccagc tgctgcgcgc aatgatggtg tgtatgatga tatgtcagct acgcaatttg 60

gattcctgct agtgcttcga cgaagtgact gacggtgttt tccgtgttgg tgcaggcact 120

gacggagcgg cagccgcagc tggagaagaa gccggcgcgc gggagggcgc cgctgtccgg 180

gaaggccgtc gcggcgctgt gcgtgacgag cttcgttgtg gggttgctgc ttagcggcaa 240

cgtgtcgctc atgtcggcct cggcgtcgcc gtcgtcctcg agcacggaca gcgagaagag 300

cattcgtgtt tccggttgcg acaatgagcg tgtaagtagt ctgcttagaa cccatttttt 360

tttaccgcgc gtactggttg gcacgcatcc tgatcgaatt ctgcatctca tctgaccaga 420

aactcggaga gaaccacccc aaggatctcc tgaacgaggt gtcgagaact catcaagcaa 480

tccagtaagc atccggcggt ctcgaatcga acgctgcagg ccttgtcagc aggcacactc 540

attcaacggt gtacggcgtg taaggccatg gactcacggg tcgcacgtgg tgcgctgctg 600

aacttgtagg tcgctggaca aggcggtgtc caccctggag atggagatgg ccgtggaacg 660

cgctaggggc gggggcgggg gcggcggcgc cgcgtccatg gcgtccagca ggactcccca 720

gaaggccttc gtcgtggtcg gcatcaacac ggccttcacc agcaagaagc ggcgcgactc 780

gctccgcgac acctgggtcc ccagaggtac gcacacatgg acggaccgac aagccagcat 840

acatacatac atacattgat cacgtacgta acgtacggga cggcgggcgc atcgcgcgtg 900

caggggataa gctgaggaag ctggagcggg agaaggggat cgtggtccgg ttcgtgatcg 960

ggcacagcgg cacgccgggc ggcggcgcgc tggaccgcgc cctggacgcg gaggaggccg 1020

agaccaggga cttcatgcgg ctggaccacg ccgagggcta ccacgagctg tcgtccaaga 1080

ccaggaccta cttcaccacc gccgtcgcca cctgggacgc cgacttctac gtcaaggtcg 1140

acgacgacat ccacctcaac ctcggtacgt gcgtacgtgc atgcggcgtt acagggtggg 1200

cgtagctgct ggtagcagta gcaggccgta agaatctcgt ttccaactgc acagggatgc 1260

tggcgagcag gctggcgaaa cacaggacgc gcccgagggt gcacgtcggc tgcatgaagt 1320

ccgggcctgt cctgtcacag aagtgagcag agatcatttt tcttcttctt cttctcacag 1380

ccgagttagt tctgttctgt cgagtgagat cggcctgtac tgtactgtgt ctctgtatct 1440

gttgttgcag aggagtcaag taccacgagc cagagtactg gaagttcggc gacgagggca 1500

acaagtactt ccgccacgcc accggccaaa tctacgccat ctccaaggac ctcgccgcct 1560

acatctccat caaccagtta tgtttccgga cacaatcaca tacataatgc cacgtgtggc 1620

cgcgttcgtc tgtgcgtctg acgtgcgtgc gtgcatcgtt tccaggccga tccttcacag 1680

gttcgcgaac gaggacgtct cgctgggcgc gtggctgatc gggctcgagg tcgagcacgt 1740

cgacgaccgg agcatgtgct gcgcgacgcc tccaggtggg tcatgaaact gacagccagc 1800

gtcactcctc tcctgaacaa ttcacctaca tacacctctg actgcgtgtg cagactgcga 1860

gtggaagaag cgagccggga acgtttgcgt ggcgtccttc gactggtcgt gcagcggcgt 1920

ctgcaagtcg gtggaccgga tgcgccacat ccacaaggcg tgcggcgaag gcgaaggcgc 1980

cgtctggaac gccgccacat ga 2002

<210> 2

<211> 412

<212> PRT

<213> 玉米

<400> 2

Met Leu Gln Leu Leu Arg Ala Met Met Ala Leu Thr Glu Arg Gln Pro

1 5 10 15

Gln Leu Glu Lys Lys Pro Ala Arg Gly Arg Ala Pro Leu Ser Gly Lys

20 25 30

Ala Val Ala Ala Leu Cys Val Thr Ser Phe Val Val Gly Leu Leu Leu

35 40 45

Ser Gly Asn Val Ser Leu Met Ser Ala Ser Ala Ser Pro Ser Ser Ser

50 55 60

Ser Thr Asp Ser Glu Lys Ser Ile Arg Val Ser Gly Cys Asp Asn Glu

65 70 75 80

Arg Lys Leu Gly Glu Asn His Pro Lys Asp Leu Leu Asn Glu Val Ser

85 90 95

Arg Thr His Gln Ala Ile Gln Ser Leu Asp Lys Ala Val Ser Thr Leu

100 105 110

Glu Met Glu Met Ala Val Glu Arg Ala Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ala Ala Ser Met Ala Ser Ser Arg Thr Pro Gln Lys Ala Phe Val

130 135 140

Val Val Gly Ile Asn Thr Ala Phe Thr Ser Lys Lys Arg Arg Asp Ser

145 150 155 160

Leu Arg Asp Thr Trp Val Pro Arg Gly Asp Lys Leu Arg Lys Leu Glu

165 170 175

Arg Glu Lys Gly Ile Val Val Arg Phe Val Ile Gly His Ser Gly Thr

180 185 190

Pro Gly Gly Gly Ala Leu Asp Arg Ala Leu Asp Ala Glu Glu Ala Glu

195 200 205

Thr Arg Asp Phe Met Arg Leu Asp His Ala Glu Gly Tyr His Glu Leu

210 215 220

Ser Ser Lys Thr Arg Thr Tyr Phe Thr Thr Ala Val Ala Thr Trp Asp

225 230 235 240

Ala Asp Phe Tyr Val Lys Val Asp Asp Asp Ile His Leu Asn Leu Gly

245 250 255

Met Leu Ala Ser Arg Leu Ala Lys His Arg Thr Arg Pro Arg Val His

260 265 270

Val Gly Cys Met Lys Ser Gly Pro Val Leu Ser Gln Lys Gly Val Lys

275 280 285

Tyr His Glu Pro Glu Tyr Trp Lys Phe Gly Asp Glu Gly Asn Lys Tyr

290 295 300

Phe Arg His Ala Thr Gly Gln Ile Tyr Ala Ile Ser Lys Asp Leu Ala

305 310 315 320

Ala Tyr Ile Ser Ile Asn Gln Pro Ile Leu His Arg Phe Ala Asn Glu

325 330 335

Asp Val Ser Leu Gly Ala Trp Leu Ile Gly Leu Glu Val Glu His Val

340 345 350

Asp Asp Arg Ser Met Cys Cys Ala Thr Pro Pro Asp Cys Glu Trp Lys

355 360 365

Lys Arg Ala Gly Asn Val Cys Val Ala Ser Phe Asp Trp Ser Cys Ser

370 375 380

Gly Val Cys Lys Ser Val Asp Arg Met Arg His Ile His Lys Ala Cys

385 390 395 400

Gly Glu Gly Glu Gly Ala Val Trp Asn Ala Ala Thr

405 410

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gacgcgcccg agggtgt 17

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

actctggctc gtggtacttg actcct 26

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gacttcatgc agccgacgtg 20

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccaagaccag gacctacttc accacc 26

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cctcggcaca taaatcgtct c 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cgtgagtcca tggccttaca c 21

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ccttgtcagc aggcacact 19

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ccgctccagc ttcctcag 18

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cagaggtacg cacacatgga c 21

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ggcctggaaa cgatgcac 18

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tccaaggacc tcgccgccta 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gaaacaacca cgcttgccat 20

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gcctacatct ccatcaacca gt 22

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gaatgtgtca tgccaaacag tg 22