本發(fā)明屬于分子生物學(xué)及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種調(diào)節(jié)肝再生的c9orf116基因及其siRNA干擾靶點(diǎn)和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

肝臟是機(jī)體的重要器官，具有儲(chǔ)存、代謝、生物轉(zhuǎn)化、解毒、造血、合成膽色素、分泌和再生等功能。研究肝再生相關(guān)基因?qū)Ω渭?xì)胞增殖和肝再生的作用，對(duì)揭示肝再生機(jī)制、構(gòu)建人工肝、建立治療和預(yù)防肝病的方法等都有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。目前，已有大量報(bào)道指出，應(yīng)用RNAi技術(shù)特異性地向哺乳動(dòng)物和人類細(xì)胞中導(dǎo)入siRNA來(lái)降低靶基因的表達(dá)，進(jìn)而引起靶蛋白的表達(dá)下降，最終達(dá)到高效特異性的基因治療作用。

c9orf116基因全長(zhǎng)為4351bp，含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，其中3個(gè)外顯子分別位于該基因的1-211、951-1029、3764-4351bp處，其mRNA全長(zhǎng)為878bp，共編碼136個(gè)氨基酸。比較大鼠、小鼠和人的c9orf116基因序列發(fā)現(xiàn)，三者基因結(jié)構(gòu)相似，CDS區(qū)長(zhǎng)度基本一致。進(jìn)一步通過(guò)Cluster X軟件比對(duì)大鼠、小鼠和人的c9orf116氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，它們的氨基酸序列相似性可達(dá)到90.74%，其保守結(jié)構(gòu)域是DUF4490，屬于DUF4547超家族，是個(gè)未知功能的結(jié)構(gòu)域，首先在真核生物中發(fā)現(xiàn)具有這個(gè)結(jié)構(gòu)域家族的蛋白是典型的101-220個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。在小鼠中，其家族成員由P53誘導(dǎo)表達(dá)，在DNA損傷應(yīng)答中起一定作用。然而，在大鼠體內(nèi)，c9orf116基因還是一個(gè)功能不詳?shù)幕?，能否促進(jìn)體外培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞增殖尚不明確。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題是提供了一種調(diào)節(jié)肝再生的c9orf116基因及其siRNA干擾靶點(diǎn)和應(yīng)用，該c9orf116基因在細(xì)胞增殖與分化、腫瘤治療及抗腫瘤藥物研發(fā)等方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

本發(fā)明為解決上述技術(shù)問(wèn)題采用如下技術(shù)方案：

一種調(diào)節(jié)肝再生的c9orf116基因，其特征在于該c9orf116基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。

進(jìn)一步優(yōu)選，所述的調(diào)節(jié)肝再生的c9orf116基因在制備促進(jìn)肝再生用的物質(zhì)中的應(yīng)用。

進(jìn)一步優(yōu)選，所述的調(diào)節(jié)肝再生的c9orf116基因在制備促進(jìn)肝再生用的物質(zhì)中的應(yīng)用，其特征在于：通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子JUN調(diào)節(jié)CCNA2、CCND1及MYC基因的表達(dá)共同促進(jìn)肝細(xì)胞增殖。

進(jìn)一步優(yōu)選，所述促進(jìn)肝再生用的物質(zhì)為c9orf116蛋白的特異性抗體。

進(jìn)一步優(yōu)選，所述調(diào)節(jié)肝再生的c9orf116基因的拮抗劑在制備促進(jìn)肝再生用的藥物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步優(yōu)選，所述調(diào)節(jié)肝再生的c9orf116基因的拮抗劑是特異性干擾c9orf116基因表達(dá)的siRNA干擾靶點(diǎn)，該siRNA干擾靶點(diǎn)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

本發(fā)明首次提出了一種調(diào)節(jié)肝再生的c9orf116基因的功能及其應(yīng)用，采用分子生物學(xué)手段首次確證基因c9orf116與肝再生有顯著相關(guān)性，篩選了一條siRNA干擾靶點(diǎn)，為進(jìn)一步的研究奠定基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖1為c9orf116 siRNA轉(zhuǎn)染BRL-3A細(xì)胞后c9orf116 mRNA水平表達(dá)情況圖，其中C9-NC表示陰性對(duì)照，C9-S1、C9-S2和C9-S3表示c9orf116的3個(gè)siRNA片段；

圖2為重組慢病毒在BRL-3A細(xì)胞中對(duì)c9orf116基因mRNA和蛋白水平的影響圖；

圖3為c9orf116對(duì)細(xì)胞活力的影響圖，其中A為MTT法檢測(cè)c9orf116干涉后對(duì)細(xì)胞活力的影響，B為MTT法檢測(cè)c9orf116過(guò)表達(dá)后對(duì)細(xì)胞活力的影響；

圖4為c9orf116對(duì)細(xì)胞周期的影響圖，其中A為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)c9orf116干涉后對(duì)細(xì)胞周期變化，B為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)c9orf116過(guò)表達(dá)后對(duì)細(xì)胞周期變化；

圖5為c9orf116對(duì)細(xì)胞增殖相關(guān)基因表達(dá)的影響，其中c9orf116-PCDH為過(guò)表達(dá)c9orf116后細(xì)胞增殖相關(guān)基因的mRNA水平的表達(dá)變化，c9orf116-SIRNA為干涉c9orf116后細(xì)胞增殖相關(guān)基因的mRNA水平的表達(dá)變化。

具體實(shí)施方式

以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但不應(yīng)該將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例

BRL-3A細(xì)胞培養(yǎng)：大鼠BRL-3A肝細(xì)胞株購(gòu)自北京醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心，培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基（Invitrogen公司），其中含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清（杭州天杭生物科技有限公司）和200U/mL青霉素和鏈霉素（Invitrogen公司），于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO₂及飽和濕度條件下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

c9orf116的siRNA序列設(shè)計(jì)、合成：用Ambion、Qiagen、Dharmacon等多種siRNA設(shè)計(jì)軟件，根據(jù)GenBank獲取大鼠的c9orf116 mRNA序列（NM_019165.1）搜索AA序列并記錄每個(gè)AA 3’端相鄰的19個(gè)核苷酸，篩選出GC含量在30%-55%之間的siRNA。再根據(jù)siRNA基本設(shè)計(jì)原則進(jìn)行進(jìn)一步篩選，并將篩選出的siRNA序列在GenBank的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中用BLAST檢索其同源性，選用與非同源基因有3個(gè)以上的堿基錯(cuò)配的序列，以排除非特異性抑制的可能，在滿足以上條件的基礎(chǔ)上，最終確定3條c9orf116的siRNA序列（Tab.1）。siRNA序列由廣州銳博生物科技有限公司合成，同時(shí)合成一個(gè)雜亂的不識(shí)別任何哺乳動(dòng)物基因的序列作為陰性對(duì)照。

Tab 1. the sequence of siRNA targeting c9orf116

細(xì)胞轉(zhuǎn)染：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BRL-3A細(xì)胞，質(zhì)量體積比（g/mL）0.25%的胰酶（Invitrogen公司）消化，按0.3×10⁴個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37℃繼續(xù)培養(yǎng)12h，按脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（LipofectamineTM 2000，Invitrogen, USA）操作說(shuō)明書進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。分別將50nM的siRNA和0.2μL轉(zhuǎn)染試劑加入5μL OPTI-MEM培養(yǎng)基，室溫靜置5min。將上述溶液輕輕混勻，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，室溫靜置20min，加入到含0.1mL OPTI-MEM培養(yǎng)基的細(xì)胞中，于37℃孵育4h，換完全培養(yǎng)基。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

有效c9orf116 siRNA的篩選：c9orf116 siRNA轉(zhuǎn)染BRL-3A細(xì)胞，48h后收集細(xì)胞，提取總RNA，其中28S:18S的條帶為2:1，提取RNA的OD260:280為1.9-2.1。用qRT-PCR檢測(cè)c9orf116的表達(dá)情況，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染c9orf116 siRNA的BRL-3A細(xì)胞中，c9orf116表達(dá)量明顯低于陰性對(duì)照NC組（比值分別為0.81、0.23、0.67）（圖1）。用SPSS 13.0軟件的單因素方差分析（one-way ANOVA）的最小顯著性法（least significance difference, LSD）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果表明，S3與NC（對(duì)照）比差異顯著（p＜0.05），S1 組、S2組與NC對(duì)照比差異極顯著（p＜0.01），為此，后續(xù)試驗(yàn)均用S2。

分子克隆和慢病毒包裝：根據(jù)NCBI中c9orf116基因序列，用慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP構(gòu)建包含c9orf116基因 cDNA全長(zhǎng)的過(guò)表達(dá)載體，將穿梭質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，包裝產(chǎn)生慢病毒。再用慢病毒感染大鼠BRL-3A肝細(xì)胞，用 RT-PCR和Western Blotting方法檢測(cè)c9orf116的表達(dá)。

慢病毒的制備和鑒定：重組慢病毒質(zhì)粒pCDH-c9orf116轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞24h, 過(guò)濾病毒液，濃縮后測(cè)定病毒滴度為1.5×108TU/mL，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。慢病毒轉(zhuǎn)染BRL-3A細(xì)胞后，RT-PCR和Western blot方法檢測(cè)3A-pCDH和3A-pCDH-c9orf116組細(xì)胞中c9orf116的表達(dá)，mRNA和蛋白水平均顯著提高（圖2A/B）（p<0.01）。

MTT法：在含細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入MTT（Geneview, USA），使其最終濃度達(dá)0.5mg/mL，于37℃避光培養(yǎng)4h，徹底棄去培養(yǎng)基，每孔加入150μL二甲基亞砜（DMSO，Geneview，USA），輕輕震蕩10min，充分溶解甲瓚晶體。最后，用Biotek reader酶標(biāo)儀檢測(cè)490nm處各孔的吸光值。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

c9orf116對(duì)BRL-3A細(xì)胞活力的影響：體外培養(yǎng)的BRL-3A細(xì)胞干涉和過(guò)表達(dá)c9orf116后24h、48 h、72h，MTT檢測(cè)細(xì)胞活力發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染c9orf116 siRNA后，細(xì)胞活力與陰性對(duì)照（NC）相比，明顯低于NC組（圖3A），而過(guò)表達(dá)c9orf116后，細(xì)胞活力與空載（pCDH）相比，明顯高于PCDH組（圖3B），SPSS 13.0軟件用單因素方差分析（one-way ANOVA）的LSD法進(jìn)行組間差異性的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果表明，c9orf116 siRNA組/過(guò)表達(dá)組與NC組相比，24h差異不明顯，但48 h、72h差異顯著（p＜0.05），表明c9orf116能夠通過(guò)提高BRL-3A細(xì)胞活力促進(jìn)大鼠BRL-3A細(xì)胞增殖。

流式細(xì)胞術(shù)：體積質(zhì)量比（g/mL）0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞后收集材料，于體積分?jǐn)?shù)為90%乙醇中-20℃固定過(guò)夜。然后，用PBS洗和400目篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞，再用含0.2mg/mL RNase A的PI染色液（20μg/mL）重懸細(xì)胞，室溫避光孵育15min，最后流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期分布情況。

c9orf116對(duì)BRL-3A細(xì)胞周期的影響：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，siRNA處理后，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞增殖率（S+G2/M %）為29.50±2.3%，陰性對(duì)照組的細(xì)胞增殖率為32.56±3.1%，并且c9orf116 S2組與NC組相比，S+G2/M期細(xì)胞數(shù)顯著降低（p＜0.05），c9orf116過(guò)表達(dá)后與PCDH組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖率（S+G2/M %）為40.38±2.5%，PCDH組的細(xì)胞增殖率為38.92±3.5%，c9orf116過(guò)表達(dá)組與PCDH組相比，S+G2/M期細(xì)胞數(shù)顯著增高（p＜0.05）（圖4）。

實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）：細(xì)胞總RNA抽提按Trizol試劑操作說(shuō)明書進(jìn)行（Invitrogen Corporation, Carlsbad, California, USA），分光光度計(jì)檢測(cè)其純度（A260/280吸光值）。然后，以2μg RNA為模板，按照AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega，USA）操作說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到第一鏈cDNA。最后取1μL cDNA，按PCR試劑盒（Promega，USA）擴(kuò)增基因，檢測(cè)基因的擴(kuò)增產(chǎn)物熒光信號(hào)值，并以β-actin（NM_031144）為內(nèi)參計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量（Ratio值）。每個(gè)樣品做3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。根據(jù)基因在GenBank登錄的序列號(hào)，用primer express 2.0軟件設(shè)計(jì)其相應(yīng)引物，并由上海生工有限公司合成（Tab. 2）。

Tab 2. The primer sequences of genes for qRT-PCR

c9orf116對(duì)BRL-3A的細(xì)胞增殖相關(guān)基因表達(dá)的影響：用qRT-PCR和Western Blot檢測(cè)干涉和過(guò)表達(dá)c9orf116后細(xì)胞增殖相關(guān)基因的mRNA和蛋白水平表達(dá)變化。結(jié)果表明，干涉c9orf116后大鼠BRL-3A細(xì)胞中細(xì)胞增殖相關(guān)基因CCNA2、CCND1和MYC等3個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)c9orf116后大鼠BRL-3A細(xì)胞中細(xì)胞增殖相關(guān)靶基因CCNA2、CCND1和MYC等3個(gè)基因表達(dá)上調(diào)（圖5））。用qRT-PCR和Western Blot檢測(cè)干涉和過(guò)表達(dá)c9orf116后對(duì)細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)變化。結(jié)果表明，干涉c9orf116后大鼠BRL-3A細(xì)胞中細(xì)胞增殖相關(guān)基因CCNA2、CCND1和MYC等3個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)c9orf116后大鼠BRL-3A細(xì)胞中細(xì)胞增殖相關(guān)靶基因CCNA2、CCND1和MYC等3個(gè)基因表達(dá)上調(diào)。

以上實(shí)施例描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征及優(yōu)點(diǎn)，本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明原理的范圍下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)均落入本發(fā)明保護(hù)的范圍內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南師范大學(xué)

<120> 一種調(diào)節(jié)肝再生的c9orf116基因及其siRNA干擾靶點(diǎn)和應(yīng)用

<130> 2017

<160> 30

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 878

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caacaggacg ccctgccgca gtagccacag acttgactgt cctgggctag tttcctgtgg 60

gaggccaaat gtctgaagaa aacccccaag agtgcgccga gccggtggag cccaaggcta 120

agcctgcccc agagaaaacg agcgactact accgcattag cgagaagctc ccagacaggt 180

tcaacaaccc ggggtggttt catggctaca gtaccaatga agctgtttcc atgtacagga 240

ccagtaacca aacctatggg agcagagctc ccacagcgca tgagatgccg aaagcatatt 300

atccatcttc aaataagttt tccacacaac acgcagcttt cggaatgttc cggagacata 360

atatgaatgt ctgcctggat aagagcctag tgactgggcc ggacaatcac gtcacccact 420

acgacccctt aaactttcac cccagttaca atgtcaacag gccatccatc tgtgactaag 480

gaagctggct gcctgtcgtc ggggctgtcc tgactcaggg ctgctgtagg gagcacggat 540

gcccctgatt ctggacaagt gccccattct aaaggcacgg agctcactgc cttctcagaa 600

aacacttttc ctttccagag gagaaaatta tgtaaatagg gccataatgt cttgtgttct 660

gcatttcaca caggaaggat gctgacagaa tctttgtttt attaaaaagt tgccacggct 720

tcaatttctg tcgtgcttca tatttgtcct gaagtagcag gggacccgca catcttggaa 780

cccgagtctt ggtttgcaat gtggggtgtt ctagggagtg ccacaaagca tctttatttg 840

ggagctgttg ccatgtgtgt gactgttact gggataaa 878

<210> 2

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

GAATGTTCCG GAGACATAA 19

<210> 3

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

GCATGAGATG CCGAAAGCA 19

<210> 4

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

CCAATGAAGC TGTTTCCAT 19

<210> 5

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

GAAUGUUCCG GAGACAUAA 19

<210> 6

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

CUUACAAGGC CUCUGUAUU 19

<210> 7

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

GCAUGAGAUG CCGAAAGCA 19

<210> 8

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

CGUACUCUAC GGCUUUCGU 19

<210> 9

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

CCAAUGAAGC UGUUUCCAU 19

<210> 10

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

GGUUACUUCG ACAAAGGUA 19

<210> 11

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

GCCAAATGTC TGAAGAAAAC C 21

<210> 12

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

GTACTGTAGC CATGAAACCA CC 22

<210> 13

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

GTGCTGGGCC AAGGAAAATG 20

<210> 14

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

GGAGTTCAGC TGAGGGATCG 20

<210> 15

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

CAGCCCACTC TGGTCTCCTC 20

<210> 16

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

CCATCTTATT CCTTTCCCTT CG 22

<210> 17

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

TGCAAAGATG GAAACGACCT T 21

<210> 18

<211> 17

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

GCCGTAGGCG CCACTCT 17

<210> 19

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

CGCTCTTCAC GAAACCCAG 19

<210> 20

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

CCATCCATAG CCAGCCATT 19

<210> 21

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

GCGTCAACAG GGAGATGTCA 20

<210> 22

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

TTCCACAAAG GCATCCCAGC 20

<210> 23

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

CTTTTAGTGC CGCTGTCTCT TT 22

<210> 24

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

GCCCGCATAC TGTTAGTGAT GT 22

<210> 25

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

ACAACGGTGA ATGGACACCA 20

<210> 26

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

GCCACGGTTC ACCATGACTA 20

<210> 27

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

ACCCAACATC AGCGGTCG 18

<210> 28

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

CGTGACTGTC GGGTTTTCCA 20

<210> 29

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

AAAATGCCAG AGGCGGATGA 20

<210> 30

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

GAAAGTGCGT TGTGCGGTAG 20