本發(fā)明涉及藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一類新型含氨基二硫代甲酸酯的刺芒柄花素衍生物、它們的制備方法及其作為一類新的抗腫瘤藥物先導(dǎo)化合物的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

刺芒柄花素(Formononetin)為天然植物紅車軸草的花序及帶花枝葉，屬于異黃酮類化合物，對(duì)于預(yù)防乳腺癌、前列腺癌等癌癥有一定的作用?？鼓[瘤機(jī)制表明，天然產(chǎn)物刺芒柄花素通過(guò)IGF1/PI3K/Akt通路誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的周期阻滯，可作為候選抗腫瘤藥物。但是，刺芒柄花素作為候選抗腫瘤藥物的主要缺陷為活性較弱，在應(yīng)用過(guò)程中收到很大限制。例如Xin Chen小組報(bào)道了刺芒柄花素的體外抗增殖活性，其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116、神經(jīng)母腫瘤細(xì)胞SH-SY5Y及前列腺癌細(xì)胞DU-145的活性分別僅為60.97μM,>100μM,>100μM(European Journal of Medicinal Chemistry,2012,54,175-187)。

氨基二硫代甲酸酯是一種重要的抗腫瘤活性基團(tuán)，通常由氨基化合物和二硫化碳合成。多個(gè)研究小組利用藥物拼接原理將氨基二硫代甲酸酯和其它藥效基團(tuán)進(jìn)行連接，合成得到了一些具有優(yōu)秀抗腫瘤活性的化合物。例如本課題組在查爾酮中引入氨基二硫代甲酸酯(如下式)，合成了一系列抗腫瘤活性優(yōu)于先導(dǎo)化合物的新型查爾酮衍生物(Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,2016,26,3918-3922)。

以氨基二硫代甲酸酯為母體，設(shè)計(jì)合成含氨基二硫代甲酸酯的刺芒柄花素衍生物，同樣具有研究?jī)r(jià)值，對(duì)拓寬刺芒柄花素類化合物的研究領(lǐng)域具有重要意義，目前沒(méi)見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供系列新型含氨基二硫代甲酸酯的刺芒柄花素衍生物，解決天然產(chǎn)物刺芒柄花素抗腫瘤活性弱的問(wèn)題。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種簡(jiǎn)單高效，綠色環(huán)保的合成含氨基二硫代甲酸酯的刺芒柄花素衍生物的方法。

本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供所述化合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明通過(guò)藥物拼接原理，引入氨基二硫代甲酸酯基團(tuán)合成了新型含氨基二硫代甲酸酯的刺芒柄花素衍生物，所述一類新型含氨基二硫代甲酸酯的刺芒柄花素衍生物結(jié)構(gòu)式如下：

為芐基哌嗪基、乙基哌嗪基、甲?；哙夯?、甲基哌嗪基、嗎啡啉基、四氫吡咯基、叔丁氧羰基哌嗪基。

n代表碳原子的個(gè)數(shù)，為0,1,2。

優(yōu)選如下化合物之一：

本發(fā)明所述新型含氨基二硫代甲酸酯的刺芒柄花素衍生物主要通過(guò)下列步驟制得：

1.通式(1a～1d)的制備方法：

溶劑中，將刺芒柄花素在堿性條件下和1,2-二溴乙烷、1,3-二溴丙烷或1,4-二溴丁烷反應(yīng)，體系濃縮至干，加入適量乙醇重結(jié)晶得到化合物1a～1d，所用的堿性化合物是氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸鉀、磷酸鈉、十二水磷酸鈉、磷酸鉀、碳酸氫鉀、碳酸氫鈉中的一種；所用的溶劑為乙醇、甲醇、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、四氫呋喃、二氧六環(huán)中之一或其中任意兩種的混合物；反應(yīng)在0-90℃之間進(jìn)行。

刺芒柄花素與1,2-二溴乙烷、1,3-二溴丙烷或1,4-二溴丁烷的摩爾比范圍：1:1～1:1.2.

2.通式(I1～I(xiàn)9)的制備方法：

溶劑中，化合物1a～1d其中之一與取代仲胺化合物、二硫化碳在弱堿性條件下反應(yīng)，待反應(yīng)完成后，抽濾，濾液濃縮重結(jié)晶即得到通式(I1～I(xiàn)9)化合物；所用的溶劑為丙酮、乙腈、乙醇、甲醇中之一或其中任意兩種或三種的混合物；反應(yīng)在0-30℃之間進(jìn)行，重結(jié)晶溶劑為乙醇。所用的弱堿性化合物是磷酸鈉、十二水磷酸鈉、磷酸鉀、碳酸氫鉀、碳酸氫鈉中的一種。

所述取代仲胺化合物為：芐基哌嗪、乙基哌嗪、甲?；哙?、甲基哌嗪、嗎啡啉、四氫吡咯、叔丁氧羰基哌嗪。

化合物1a～1d與取代仲胺化合物、二硫化碳的摩爾比：1:1.2:1.5。

本發(fā)明創(chuàng)新點(diǎn)及優(yōu)點(diǎn)在于：通過(guò)藥物拼接原理，以氨基二硫代甲酸酯為母體，經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的2步反應(yīng)，設(shè)計(jì)合成了9個(gè)含氨基二硫代甲酸酯的刺芒柄花素衍生物，解決天然產(chǎn)物刺芒柄花素抗腫瘤活性弱的問(wèn)題。顯著提高了刺芒柄花素的抗腫瘤活性，有望將其應(yīng)用于抗腫瘤藥物的制備，拓寬了刺芒柄花素類化合物的研究領(lǐng)域。

附圖說(shuō)明

圖1為不同濃度的本發(fā)明衍生物I-8在48h下，對(duì)前列腺癌細(xì)胞細(xì)胞周期的影響。

具體實(shí)施方式

為了對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更好的說(shuō)明，特舉實(shí)施例如下：

實(shí)施例1通式(1a～1d)的制備

100ml四氫呋喃中，將10g刺芒柄花素、6.2g碳酸鉀和7g 1,2-二溴乙烷或7.5g 1,3-二溴丙烷或8g 1,4-二溴丁烷反應(yīng)，80℃加熱攪拌。反應(yīng)6h后，體系濃縮至干，加入10ml乙醇重結(jié)晶得到化合物1a～1d。

實(shí)施例2通式(I1～I(xiàn)9)的制備

10ml丙酮中，1g化合物(1a～1d)與600mg取代仲胺、300mg二硫化碳、440mg磷酸鈉室溫條件下反應(yīng)，待反應(yīng)完成后，抽濾，濾液濃縮，3ml乙醇重結(jié)晶即得到通式(I1～I(xiàn)9)化合物。

通式(I1～I(xiàn)9)結(jié)構(gòu)表征如下：

I-1：產(chǎn)率83％.白色固體.Mp:124～125℃.¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.42(s,1H),8.03(d,J＝8.9Hz,1H),7.53(d,J＝8.7Hz,2H),7.38–7.29(m,4H),7.29–7.22(m,1H),7.17(d,J＝2.2Hz,1H),7.09(dd,J＝8.9,2.3Hz,1H),7.00(d,J＝8.8Hz,2H),4.22(t,J＝6.1Hz,4H),3.92(s,2H),3.79(s,3H),3.51(s,2H),3.42(t,J＝7.2Hz,2H),2.45(s,4H),2.22–2.09(m,2H).¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ194.74,174.60,162.81,158.99,157.38,153.45,137.53,130.04,128.91,128.22,127.09,126.96,124.05,123.35,117.63,115.02,113.60,101.12,67.14,61.27,55.13,51.93,32.72,27.86.HR-MS(ESI):Calcd.C₃₁H₃₃N₂O₄S₂,[M+H]⁺m/z:561.1885,found:561.1882.

I-2：產(chǎn)率85％.黃色固體.Mp:167～168℃.¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.43(s,1H),8.03(d,J＝8.9Hz,1H),7.53(d,J＝8.8Hz,2H),7.18(d,J＝2.3Hz,1H),7.09(dd,J＝8.9,2.3Hz,1H),7.00(d,J＝8.8Hz,2H),4.22(t,J＝6.1Hz,4H),3.91(s,2H),3.79(s,3H),3.42(t,J＝7.2Hz,2H),2.47–2.39(m,4H),2.36(q,J＝7.2Hz,2H),2.21–2.10(m,2H),1.01(t,J＝7.2Hz,3H).¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ194.69,174.60,162.82,158.99,157.38,153.46,130.05,126.96,124.05,123.35,117.62,115.03,113.61,101.13,67.15,55.14,51.71,50.99,32.69,27.87,11.85.HR-MS(ESI):Calcd.C₂₆H₃₁N₂O₄S₂,[M+H]⁺m/z:499.1729,found:499.1725.

I-3：產(chǎn)率78％.白色固體.Mp:174～176℃.¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.43(s,1H),8.04(d,J＝8.9Hz,1H),7.53(d,J＝8.7Hz,2H),7.18(d,J＝2.2Hz,1H),7.10(dd,J＝8.9,2.3Hz,1H),7.00(d,J＝8.8Hz,2H),4.23(t,J＝6.1Hz,4H),3.97(s,2H),3.79(s,3H),3.64–3.55(m,4H),3.44(t,J＝7.2Hz,2H),2.24–2.11(m,2H),2.03(s,3H).¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ195.33,174.61,168.68,162.81,158.99,157.38,153.47,130.05,126.97,124.04,123.35,117.62,115.05,113.61,101.13,67.15,55.15,44.41,32.69,27.81,21.21.HR-MS(ESI):Calcd.C₂₆H₂₉N₂O₅S₂,[M+H]⁺m/z:513.1510,found:513.1518.

I-4：產(chǎn)率78％.黃色固體.Mp:167～169℃.¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.43(s,1H),8.04(d,J＝8.9Hz,1H),7.53(d,J＝8.7Hz,2H),7.18(d,J＝2.3Hz,1H),7.10(dd,J＝8.9,2.3Hz,1H),7.00(d,J＝8.8Hz,2H),4.22(t,J＝6.1Hz,4H),3.92(s,2H),3.79(s,3H),3.42(t,J＝7.2Hz,2H),2.44–2.32(m,4H),2.20(s,3H),2.14(dd,J＝13.7,7.0Hz,2H).¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ194.86,174.60,162.81,158.99,157.38,153.47,130.04,126.96,124.04,123.35,117.62,115.03,113.60,101.12,67.15,55.13,53.94,45.03,32.71,27.86.HR-MS(ESI):Calcd.C₂₅H₂₉N₂O₄S₂,[M+H]⁺m/z:485.1574,found:485.1569.

I-5：產(chǎn)率79％.白色固體.Mp:156～158℃.¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.43(s,1H),8.04(d,J＝8.9Hz,1H),7.53(d,J＝8.8Hz,2H),7.18(d,J＝2.3Hz,1H),7.10(dd,J＝8.9,2.3Hz,1H),7.00(d,J＝8.8Hz,2H),4.23(t,J＝6.1Hz,4H),3.94(s,2H),3.79(s,3H),3.72–3.60(m,4H),3.44(t,J＝7.2Hz,2H),2.23–2.11(m,2H).¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ195.39,174.60,162.81,158.99,157.38,153.47,130.05,126.97,124.04,123.35,117.62,115.03,113.60,101.12,67.14,65.56,55.13,32.56,27.84.HR-MS(ESI):Calcd.C₂₄H₂₆NO₅S₂,[M+H]⁺m/z:472.1257,found:472.1252.

I-6：產(chǎn)率81％.白色固體.Mp:159～161℃.¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.43(s,1H),8.04(d,J＝8.9Hz,1H),7.53(d,J＝8.8Hz,2H),7.18(d,J＝2.3Hz,1H),7.09(dd,J＝8.9,2.3Hz,1H),7.00(d,J＝8.8Hz,2H),4.22(t,J＝6.2Hz,2H),3.79(s,3H),3.76(d,J＝6.9Hz,2H),3.62(t,J＝6.8Hz,2H),3.40(t,J＝7.2Hz,2H),2.23–2.10(m,2H),2.07–1.96(m,2H),1.91(p,J＝6.7Hz,2H).¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ190.61,174.60,162.83,158.99,157.39,153.47,130.05,126.96,124.05,123.35,117.62,115.04,113.60,101.11,67.15,55.13,54.93,50.53,32.03,28.03,25.53,23.71.HR-MS(ESI):Calcd.C₂₄H₂₆NO₄S₂,[M+H]⁺m/z:456.1306,found:456.1303.

I-7：產(chǎn)率79％.白色固體.Mp:140～142℃.¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.43(s,1H),8.04(d,J＝8.9Hz,1H),7.53(d,J＝8.6Hz,2H),7.26(d,J＝1.8Hz,1H),7.11(dd,J＝9.0,2.0Hz,1H),7.00(d,J＝8.6Hz,2H),4.38(t,J＝6.2Hz,2H),4.26(s,2H),3.97(s,2H),3.80(s,3H),3.77(t,J＝6.2Hz,2H),3.48(s,4H),1.42(s,9H).¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ195.25,190.44,175.10,162.88,159.52,157.85,154.03,130.55,127.56,124.33,123.87,118.19,115.46,114.10,101.78,79.89,75.53,67.15,55.63,35.36,28.49.HR-MS(ESI):Calcd.C₂₈H₃₃N₂O₆S₂,[M+H]⁺m/z:557.1788,found:557.1780.

I-8：產(chǎn)率83％.白色固體.Mp:165～167℃.¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.42(s,1H),8.03(d,J＝8.9Hz,1H),7.53(d,J＝8.8Hz,2H),7.17(d,J＝2.3Hz,1H),7.09(dd,J＝8.9,2.3Hz,1H),7.00(d,J＝8.8Hz,2H),4.22(t,J＝6.1Hz,4H),3.95(s,2H),3.79(s,3H),3.44(dd,J＝15.1,7.3Hz,6H),2.22–2.10(m,2H),1.42(s,9H).¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ195.33,174.59,162.80,158.98,157.37,153.68,153.44,130.04,126.95,124.04,123.34,117.62,115.02,113.59,101.10,79.35,67.14,55.13,32.69,27.99,27.81,18.53.HR-MS(ESI):Calcd.C₂₉H₃₅N₂O₆S₂,[M+H]⁺m/z:571.1940,found:571.1937.

I-9：產(chǎn)率85％.白色固體.Mp:143～144℃.¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.41(s,1H),8.02(d,J＝8.9Hz,1H),7.53(d,J＝8.7Hz,2H),7.15(d,J＝2.2Hz,1H),7.07(dd,J＝8.9,2.2Hz,1H),7.00(d,J＝8.8Hz,2H),4.23(s,2H),4.16(t,J＝5.8Hz,2H),3.94(s,2H),3.51–3.42(m,4H),1.95–1.76(m,4H),1.42(s,9H).¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ196.13,175.10,163.47,159.48,157.89,154.18,153.92,130.54,127.41,124.55,123.83,118.01,115.51,114.09,101.51,79.86,68.48,55.62,36.24,28.49,28.09,25.55.HR-MS(ESI):Calcd.C₃₀H₃₇N₂O₆S₂,[M+H]⁺m/z:585.2096,found:585.2093.

上述化合物的抗腫瘤活性測(cè)定：

1.實(shí)驗(yàn)方法：

篩選所用化合物均是由本發(fā)明合成、純化而得；樣品儲(chǔ)備液：稱取1-2mg樣品置于1.5mL EP管中，然后用DMSO配制成濃度是128×10³μg/mL的溶液，4℃保存放置，實(shí)驗(yàn)時(shí)根據(jù)所需濃度利用培養(yǎng)基稀釋。

2.初篩

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，消化計(jì)數(shù)后，用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度，接種至96孔板中，培養(yǎng)24h后，棄去培養(yǎng)基，加入用培養(yǎng)基稀釋好的藥物(50μg/mL、100μg/mL)，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，另設(shè)空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組。藥物作用48h后，每孔加入20μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸去液體，加入150mL的DMSO，振蕩均勻，酶標(biāo)儀490nm處檢測(cè)吸光度值，計(jì)算抑制率，計(jì)算公式如下：

抑制率(％)＝(1-給藥組吸光度值/空白組吸光度值)×100％

3、細(xì)篩

50μg/mL時(shí)抑制率大于50％的樣品，重新設(shè)置濃度進(jìn)行細(xì)篩。即將待測(cè)樣品以0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL濃度加入96孔板中，培養(yǎng)48h后，檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS軟件計(jì)算IC₅₀值和相關(guān)系數(shù)。

4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

表1上述化合物對(duì)三種腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤活性評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)：

^a人類胃癌細(xì)胞^b人類食管癌細(xì)胞^c人類前列腺癌細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明所提供的含氨基二硫代甲酸酯的刺芒柄花素衍生物對(duì)EC109，MGC-803和PC-3三種腫瘤細(xì)胞具有一定的抑制作用。其中化合物I8的體外抗前列腺腫瘤活性約為刺芒柄花素的28倍，可作為進(jìn)一步開發(fā)的候選或者先導(dǎo)化合物，應(yīng)用于制備抗腫瘤藥物。

進(jìn)一步對(duì)活性較好的化合物I-8進(jìn)行了抗前列腺癌機(jī)制研究，發(fā)現(xiàn)I-8能阻斷前列腺癌細(xì)胞細(xì)胞周期于G1期。相應(yīng)結(jié)果見(jiàn)附圖1。