本發(fā)明涉及一株枯草芽孢桿菌及其培養(yǎng)方法與應用，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

枯草芽孢桿菌，屬芽孢桿菌屬。革蘭氏陽性菌，單個細胞0.7～0.8×2～3微米，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色至淡黃色，需氧菌。

D-阿洛酮糖是一種重要的稀有糖，在自然界中極少量地存在于甘蔗糖蜜、水果干、糖制品、小麥和鼠刺屬植物中。其名稱起源于從抗菌素阿洛酮糖腺苷中也可以分離到少量的D-阿洛酮糖。D-阿洛酮糖在人體內(nèi)是通過小腸吸收進入血液循環(huán)中，在小腸吸收后不會被代謝成能量，且對于腸道微生物具有較低的發(fā)酵利用度。D-阿洛酮糖具有多種重要的生理功能：神經(jīng)保護作用，將血糖、減脂，清除活性氧簇，抗氧化，抑制癌細胞增殖，低卡路里甜味劑等。

D-阿洛酮糖是D-果糖的C-3差向異構(gòu)體，早期的D-阿洛酮糖合成方法是通過多級化學轉(zhuǎn)化普通單糖或非糖的前體物質(zhì)，但多次的保護和脫保護操作會導致收率偏低，且合成過程繁雜，存在很大的局限性。目前，已有以D-果糖為原料，可通過生物轉(zhuǎn)化法制備D-阿洛酮糖，但是目前已報道的微生物，產(chǎn)生的D-阿洛酮糖差向異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化能力較差，且分離純化過程較難。

中國專利文獻CN105602879A(申請?zhí)?01610051547.3)公開了一株高效分泌D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的基因工程菌株及其構(gòu)建方法。該發(fā)明通過利用由瘤胃菌Ruminococcus sp.5_1_39B_FAA來源的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶基因rdpe構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pMA5-RDPE，然后轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，實現(xiàn)了RDPE在枯草芽孢桿菌中組成型分泌表達。通過比較三個糖誘導型啟動子，得到最優(yōu)誘導型啟動子PxylA，并明顯提高了RDPE的分泌水平。通過敲除木糖利用基因xylAB(xylA和xylB)，阻斷了枯草芽孢桿菌的木糖代謝途徑，進一步提高了RDPE的分泌量，并使誘導劑木糖的最優(yōu)誘導濃度由4.0％降低為0.5％。最終，采用分批補料方式，在7.5L發(fā)酵罐中對工程菌株1A751SD-XR進行評價，RDPE的分泌水平最高可以達到95U/mL和2.6g/L。但該酶的酶活仍然較低，無法滿足實際生產(chǎn)的需要。

因此，尋找一種高轉(zhuǎn)化率的D-阿洛酮糖差向異構(gòu)酶生產(chǎn)菌株成為解決D-阿洛酮糖大規(guī)模生產(chǎn)應用的關(guān)鍵。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一株枯草芽孢桿菌及其培養(yǎng)方法與應用。該枯草芽孢桿菌具有高轉(zhuǎn)化D-果糖生成D-阿洛酮糖的能力，可顯著降低生產(chǎn)成本。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BLCY-005，2016年10月26日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC No.13152，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所。

本發(fā)明所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BLCY-005的原始菌株分離于山東德州百龍創(chuàng)園研發(fā)中試車間附近的土壤，并經(jīng)過誘變后獲得。該菌株在LB培養(yǎng)基上形成的菌落呈污白色，半透明，菌落邊緣不規(guī)整，呈波浪狀，中心高凸。經(jīng)顯微鏡觀察，該菌株長約1.0～1.5微米，寬約0.6～0.9微米，無莢膜，不產(chǎn)鞭毛，芽孢位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后具體不膨大。該菌株可高產(chǎn)D-阿洛酮糖差向異構(gòu)酶，產(chǎn)生的D-阿洛酮差向異構(gòu)酶為胞內(nèi)酶，經(jīng)簡單的離心、洗滌、滅菌、干燥即可得到干酶制劑，該酶酶活達到143U/ml，最適pH值為5.5～6.5，較傳統(tǒng)D-阿洛酮糖差向異構(gòu)酶活提高50％以上，可以顯著降低D-阿洛酮糖的生產(chǎn)成本。

上述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BLCY-005的培養(yǎng)方法，步驟如下：

(1)取枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BLCY-005接種于固體培養(yǎng)基中，在30～38℃的條件下，活化培養(yǎng)6～12h，制得活化菌株；

(2)取步驟(1)制得的活化菌株，接種于種子培養(yǎng)基中，在30～38℃的條件下，增殖培養(yǎng)6～12h，制得種子液；

(3)取步驟(2)制得的種子液，按體積比1～10％的比例接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30～38℃，擴大培養(yǎng)30～48h，即得菌體發(fā)酵液。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中的種子培養(yǎng)基組分如下，均為重量百分比：

蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，氯化鈉1％，無水硫酸鎂0.01％，磷酸二氫鉀0.02％，余量水，pH6.0～7.0；

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中的發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下，均為重量百分比：

酵母浸粉3％，玉米漿粉2％，葡萄糖1％，無水硫酸鎂0.01％，磷酸氫二銨0.02％，硫酸銨0.02％，余量水，pH6.0～7.0。

所述步驟(1)中的固體培養(yǎng)基為本領(lǐng)域常規(guī)固體培養(yǎng)基，如LB培養(yǎng)基等。

上述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BLCY-005在制備D-阿洛酮糖差向異構(gòu)酶中的應用。

上述應用，步驟如下：

(a)取上述制備的菌體發(fā)酵液經(jīng)離心分離，洗滌菌體，二次離心，保留沉淀物，即為粗酶制劑；

(b)將步驟(a)制得的粗酶制劑置于50～60℃水浴中熱變性40～60min，再用真空冷凍干燥機，于-40～-60℃，-20～-60kpa工作壓力下干燥，即制得D-阿洛酮糖差向異構(gòu)酶干粉。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(a)的洗滌菌體采用pH 8.0、濃度50mmol/L的Tris-HCl緩沖液，然后經(jīng)離心分離，保留沉淀，制得粗酶制劑。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(a)、(b)中的離心分離均為在4℃、10000r/min條件下，離心10min。

上述制備的D-阿洛酮糖轉(zhuǎn)移酶在制備D-阿洛酮糖中的應用。

有益效果

1、本發(fā)明首次獲得的高產(chǎn)D-阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的枯草芽孢桿菌BLCY-005，其發(fā)酵液中的D-阿洛酮糖差向異構(gòu)酶酶活可達到143U/ml，較傳統(tǒng)D-阿洛酮糖差向異構(gòu)酶活提高50％以上，顯著降低生產(chǎn)成本，最適pH值為5.5～6.5，與傳統(tǒng)菌株產(chǎn)D-阿洛酮糖差向異構(gòu)酶最適pH偏中性相比，有利于生產(chǎn)中對污染的控制；

2、本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌BLCY-005，產(chǎn)生的D-阿洛酮糖差向異構(gòu)酶為胞內(nèi)酶，分離工藝簡單，經(jīng)簡單的離心、洗滌、滅活、干燥即可得到干粉酶制劑，節(jié)約了生產(chǎn)成本，降低了動力損耗；

3、本發(fā)明擯棄了傳統(tǒng)的發(fā)酵液直接轉(zhuǎn)化D-果糖的方法，通過簡便的分離步驟，就可以獲得干粉酶制劑，極大地降低后續(xù)D-阿洛酮糖提純的難度和成本，并可以顯著提高D-阿洛酮糖成品的質(zhì)量。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步闡述，但本發(fā)明所保護范圍不限于此。

實施例1

一株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BLCY-005，2016年10月26日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC No.13152，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所。

上述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis))BLCY-005的篩選過程如下：

富集培養(yǎng)

選取山東德州百龍創(chuàng)園研發(fā)中試車間附近的土壤，用小鏟子除去表土，取離地面5～15cm處的土壤約10g，用無菌水稀釋10倍，加入LB培養(yǎng)基進行富集培養(yǎng)，30～38℃培養(yǎng)24h。

純種分離

采用劃線分離法，取一支盛有5ml無菌水的大試管，取步驟(1)中富集培養(yǎng)后的菌液2ml放入其中稀釋，充分振蕩分散，用接種環(huán)以無菌操作挑取稀釋液一環(huán)先在平板培養(yǎng)基一邊做第一次平行劃線3～4條，再轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿約60度角，將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后同一次劃線方法做第二次劃線，同法依次做第三次和第四次劃線。劃線完畢，蓋上皿蓋，將培養(yǎng)皿倒置，28～38℃培養(yǎng)24h后，挑取單個菌落接種于10個斜面培養(yǎng)基上，分別編號01～10。

將01～10斜面種子接種于搖瓶培養(yǎng)基中培養(yǎng)28～38℃培養(yǎng)24h，對01～10搖瓶發(fā)酵液進行D-阿洛酮糖對D-果糖的酶活測定，06號搖瓶酶活最高，達到75U/ml。

所述平板培養(yǎng)基組分如下，均為重量百分比：

蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，氯化鈉1％，余量水，pH自然；

所述斜面培養(yǎng)基組分如下，均為重量百分比：

蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，氯化鈉1％，瓊脂粉1％，余量水，pH自然；

所述搖瓶培養(yǎng)基組分如下，均為重量百分比：

酵母浸粉3％，玉米漿粉2％，葡萄糖1％，無水硫酸鎂0.01％，磷酸氫二銨0.02％，硫酸銨0.02％，余量水，pH 6.0～7.0；

誘變篩選

對06號菌種進行紫外線誘變，紫外線誘變采用15W紫外線燈20cm照射，照射時間為120s，得到的高產(chǎn)菌種再進行亞硝基胍誘變處理，最終得到高轉(zhuǎn)化率D-阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的產(chǎn)生菌株命名為BLCY-005，其產(chǎn)D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶在最適條件下，酶活達到143U/ml。

酶活測定方法：1ml的反應體系中，加入800μl反應底物溶液，反應底物溶液為由50ml磷酸鹽緩沖液(pH7.0)溶解D-果糖制得D-果糖濃度為100g/L的溶液，200μl的發(fā)酵液，55℃保溫10min，然后煮沸10min，終止酶反應。

用HPLC檢測D-阿洛酮糖的生產(chǎn)量，計算酶活。酶活單位(U)：每分鐘催化產(chǎn)生1μmol D-psicose所需要的酶的量。

實施例2

實施例1所述的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BLCY-005的培養(yǎng)方法，步驟如下：

(1)取枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BLCY-005接種于LB培養(yǎng)基中，在35℃的條件下，活化培養(yǎng)12h，制得活化菌株；

(2)取步驟(1)制得的活化菌株，接種于種子培養(yǎng)基中，在35℃的條件下，增殖培養(yǎng)12h，制得種子液；

所述種子培養(yǎng)基組分如下，均為重量百分比：

蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，氯化鈉1％，無水硫酸鎂0.01％，磷酸二氫鉀0.02％，余量水，pH6.8；

(3)取步驟(2)制得的種子液，按體積比5％的比例接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在35℃，擴大培養(yǎng)48h，即得菌體發(fā)酵液；

所述發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下，均為重量百分比：

酵母浸粉3％，玉米漿粉2％，葡萄糖1％，無水硫酸鎂0.01％，磷酸氫二銨0.02％，硫酸銨0.02％，余量水，pH6.8。

經(jīng)離心、洗滌、滅菌、干燥后制得干酶制劑，在最適pH值為5.5～6.5的條件下，測定其酶活為143U/ml，該酶活遠高于原始菌株的75U/ml。

對比例1

實施例1所述的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BLCY-005的培養(yǎng)方法，步驟如下：

(1)取枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BLCY-005接種于LB培養(yǎng)基中，在28℃的條件下，活化培養(yǎng)12h，制得活化菌株；

(2)取步驟(1)制得的活化菌株，接種于種子培養(yǎng)基中，在28℃的條件下，增殖培養(yǎng)12h，制得種子液；

所述種子培養(yǎng)基組分如下，均為重量百分比：

蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，氯化鈉1％，無水硫酸鎂0.01％，磷酸二氫鉀0.02％，余量水，pH5.0。

(3)取步驟(2)制得的種子液，按體積比5％的比例接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28℃，擴大培養(yǎng)48h，即得菌體發(fā)酵液；

所述發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下，均為重量百分比：

酵母浸粉3％，玉米漿粉2％，葡萄糖1％，無水硫酸鎂0.01％，磷酸氫二銨0.02％，硫酸銨0.02％，余量水，pH5.0。

經(jīng)離心、洗滌、滅活、干燥后制得干酶制劑在最適pH值為5.5～6.5的條件下，測定其酶活為107U/ml。

由上述結(jié)果可以看出，培養(yǎng)條件不在本發(fā)明所述權(quán)利要求范圍內(nèi)時，D-阿洛酮糖的的轉(zhuǎn)化率大幅降低。