本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種重組載體及其應(yīng)用，具體涉及一種基于pCDH的熒光素酶的重組載體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

熒光素酶(Luciferase)是生物體內(nèi)催化熒光素或脂肪醛氧化發(fā)光的一類(lèi)酶的總稱(chēng)。由于熒光素酶檢測(cè)簡(jiǎn)便、靈敏、快速，因此目前熒光素酶基因在基因工程方面已成為廣泛使用的報(bào)告基因。近年來(lái)，光學(xué)報(bào)告基因成像因具有靈敏度高、無(wú)放射性、成像迅速且可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)等諸多優(yōu)點(diǎn)，成為分子影像學(xué)研究中的熱點(diǎn)，并因此成為體內(nèi)示蹤細(xì)胞的理想成像方法。光學(xué)報(bào)告基因成像技術(shù)主要包括生物發(fā)光成像和熒光成像兩大類(lèi)。

Raji細(xì)胞為人B淋巴瘤白血病細(xì)胞，該細(xì)胞系最初來(lái)源于一名黑人男性Burkitt淋巴瘤患者的左上頜骨，由R.J.v.Pulvertaft在1963年建立；為B淋巴細(xì)胞來(lái)源，表達(dá)B系相關(guān)表型，呈淋巴母細(xì)胞形態(tài)；2倍體核型，EBV(+)；體外培養(yǎng)呈懸浮生長(zhǎng)。CD19為B細(xì)胞表面分化抗原，只在正常和惡性B細(xì)胞表達(dá)，幾乎不在其他組織表達(dá)。

到目前為止，淋巴瘤的治療以化療為主，但大部化療藥物均有局限性，且對(duì)病人的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生很大的損害，療效往往不盡人意。因此副作用小，治愈率高的靶向性生物治療給患者帶來(lái)了希望，成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。

CN 103468730A公開(kāi)了一種基于豬CD163基因的雙熒光素酶報(bào)告基因載體的構(gòu)建及應(yīng)用，其可用于檢測(cè)候選microRNAs對(duì)豬CD163基因表達(dá)的調(diào)控活性及用于篩選抑制豬CD163基因表達(dá)的microRNAs等。但目前的熒光素酶基因并沒(méi)有相關(guān)報(bào)道與pCDH載體相連，也沒(méi)有將熒光素酶基因用于CD19的追蹤。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種基于pCDH的熒光素酶的重組載體及其應(yīng)用，通過(guò)該重組載體介導(dǎo)的熒光素酶基因在raji細(xì)胞中表達(dá)熒光素酶，利用酶催化底物反應(yīng)原理，應(yīng)用于模式動(dòng)物活體成像研究中CD19的追蹤，從而評(píng)判CAR-T細(xì)胞的靶向殺傷效果。

為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一方面，本發(fā)明提供一種基于pCDH的熒光素酶的重組載體(pCDH-Luc)，所述重組載體由慢病毒載體pCDH和熒光素酶基因串聯(lián)構(gòu)成，所述重組載體的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本發(fā)明中，所述慢病毒載體pCDH可用現(xiàn)有技術(shù)中存在的慢病毒載體pCDH即可。

所述SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列見(jiàn)序列表。

優(yōu)選地，所述熒光素酶基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述SEQ ID NO.2的氨基酸序列如下：

MADAKNIKKGPAPFYPLEDGTAGEQLHKAMKRYALVPGTIAFTDAHIEVDITYAEYFEMSVRLAEAMKRYGLNTNHRIVVCSENSLQFFMPVLGALFIGVAVAPANDIYNERELLNSMGISQPTVVFVSKKGLQKILNVQKKLPIIQKIIIMDSKTDYQGFQSMYTFVTSHLPPGFNEYDFVPESFDRDKTIALIMNSSGSTGLPKGVALPHRTACVRFSHARDPIFGNQIIPDTAILSVVPFHHGFGMFTTLGYLICGFRVVLMYRFEEELFLRSLQDYKIQSALLVPTLFSFFAKSTLIDKYDLSNLHEIASGGAPLSKEVGEAVAKRFHLPGIRQGYGLTETTSAILITPEGDDKPGAVGKVVPFFEAKVVDLDTGKTLGVNQRGELCVRGPMIMSGYVNNPEATNALIDKDGWLHSGDIAYWDEDEHFFIVDRLKSLIKYKGYQVAPAELESILLQHPNIFDAGVAGLPDDDAGELPAAVVVLEHGKTMTEKEIVDYVASQVTTAKKLRGGVVFVDEVPKGLTGKLDARKIREILIKAKKGGKIAV.

優(yōu)選地，所述熒光素酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO3所示。

所述SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列見(jiàn)序列表。

第二方面，本發(fā)明提供一種如第一方面所述的重組載體的制備方法，包括如下步驟：

(1)根據(jù)序列設(shè)計(jì)引物，以pET28-Luc為模板進(jìn)行擴(kuò)增，得到一個(gè)替換了酶切位點(diǎn)的基因片段；

(2)將步驟(1)擴(kuò)增得到的基因片段連接到pCDH載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒；

(3)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽(yáng)性克隆。

優(yōu)選地，步驟(1)所述引物為SEQ ID NO.4-5所示的核苷酸序列；

所述SEQ ID NO.4-5所示的核苷酸序列如下：

SEQ ID NO.4：CGCGGATCCATGGCCTTACCAGTGACCGCTCCGGT；

SEQ ID NO.5：CCAGCGGCCGCAATCGCTCCCCCGTCCCGGA。

優(yōu)選地，步驟(3)所述將擴(kuò)增得到的基因片段連接到pCDH載體的BamHI和NotI克隆位點(diǎn)。

第三方面，本發(fā)明提供一種重組慢病毒，如第一方面所述的重組載體與pFUGW表達(dá)載體及包膜載體pVSV-G載體進(jìn)行共轉(zhuǎn)染哺乳細(xì)胞得到的重組慢病毒。

第四方面，本發(fā)明提供一種宿主細(xì)胞，包括如第一方面所述的重組載體或如第三方面所述的重組慢病毒。

優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞為293T、293FT或293LTV中的任意一種或至少兩種的組合，優(yōu)選為293T細(xì)胞。

第五方面，本發(fā)明提供一種如第一方面所述的重組載體，如第三方面所述的重組慢病毒或如第四方面所述的宿主細(xì)胞用于模式動(dòng)物活體成像研究中CD19的追蹤。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明中熒光素酶報(bào)告基因是生物發(fā)光成像的報(bào)告基因，生物發(fā)光成像較熒光成像具有更高的靈敏度，無(wú)明顯自發(fā)熒光，背景噪聲低，圖像信噪比更高；將慢病毒表達(dá)載體pCDH作為活體成像示蹤載體，具有高感染力的特點(diǎn)，可有效地感染各種類(lèi)型的細(xì)胞，尤其是一些難感染的細(xì)胞，比如表達(dá)CD19的Raji細(xì)胞，而熒光素酶在生物體內(nèi)具有高度催化熒光反應(yīng)的功能，兩者結(jié)合構(gòu)建的重組載體有兩方面優(yōu)勢(shì)：一是容易制得大量重組載體pCDH-Luc，二是可精準(zhǔn)直觀的示蹤生物體內(nèi)CD19⁺細(xì)胞的變化。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明pCDH-Luc質(zhì)粒圖譜；

圖2為本發(fā)明pET28-Luc質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果圖；

圖3為本發(fā)明pCDH質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果圖；

圖4為本發(fā)明pCDH-Luc質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果圖；

圖5為本發(fā)明pCDH-Luc重組載體序列鑒定結(jié)果。

具體實(shí)施方式

為更進(jìn)一步闡述本發(fā)明所采取的技術(shù)手段及其效果，以下結(jié)合附圖并通過(guò)具體實(shí)施方式來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明并非局限在實(shí)施例范圍內(nèi)。

實(shí)施例1：構(gòu)建pCDH-CAR19慢病毒載體

pCDH-Luc慢病毒載體，如圖1所示：

(1)根據(jù)已知pET28-Luc為模板進(jìn)行酶切位點(diǎn)引物更換設(shè)計(jì)引物如下：

上游引物：CGCGGATCCATGGCCTTACCAGTGACCGCTCCGGT(BamHI-Luc-A)；

下游引物：CCAGCGGCCGCAATCGCTCCCCCGTCCCGGA(Luc-NotI-S)；

為了方便構(gòu)建重組載體pCDH-Luc，我們?cè)诤铣蒐uc時(shí)人為的加入了載體構(gòu)建時(shí)所需的酶切位點(diǎn)BamHI和NotI。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：

其中，一組以水為樣本的陰性對(duì)照。

反應(yīng)條件如下：

獲得PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定并用膠回收試劑盒回收純化，加入NotI和BamHI進(jìn)行酶切反應(yīng)，得到的Luc片段與pCDH進(jìn)行連接反應(yīng)，反應(yīng)體系如下：

37℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)3h，酶切產(chǎn)物經(jīng)膠純化回收，酶切電泳結(jié)果圖如圖2-3所示。

將酶切后的載體與基因進(jìn)行連接，反應(yīng)體系如下：

輕輕混勻組分，置于16℃水浴鍋反應(yīng)2h，得到重組載體。

(2)將重組載體轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行酶切測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果如圖4-5所示，克隆序列與原始序列完全一致。

實(shí)施例2：pCDH-Luc質(zhì)粒大量提取

從-80℃取出相應(yīng)的菌株，進(jìn)行平板劃線，培養(yǎng)過(guò)夜(12-24h)；次日挑取單克隆(2-4個(gè))，進(jìn)行小體積(5ml)搖菌(6-8h)；從小搖的體系中取菌液，按體積比1:100轉(zhuǎn)大搖；然后進(jìn)行質(zhì)粒大提：

首先確認(rèn)在Solution1中是否已經(jīng)加入了RNaseA(加入RNaseA后4℃保存)；DNAWashBuffer中是否已經(jīng)加入了無(wú)水乙醇。

實(shí)驗(yàn)操作前可先將BufferN3置于冰中預(yù)冷后使用；Solution1若非首次使用，需將其從4℃中取出在室溫下平衡。

(1)取適量的菌液置于新的50mL的離心管中，在室溫條件下以4900g進(jìn)行離心10min，棄上清后繼續(xù)加入適量菌液至菌液全部離心得到沉淀；

(2)加入10mL的Solution1/RNaseA于離心后的菌體沉淀中，于振蕩器上進(jìn)行重懸；

(3)繼加入10mL的Solution2溶液，之后進(jìn)行上下顛倒10-15次后置于室溫下2min；

(4)繼加入5mL的BufferN3溶液，之后進(jìn)行顛倒后置于室溫下2min；

(5)將4中得到的溶液移入帶濾膜的注射器中，將溶液壓置于另一個(gè)新的50mL的離心管中；

(6)在5中得到的溶液中加入0.1體積的ETR溶液，上下顛倒7-10次混勻后置于冰中10-20min，之后轉(zhuǎn)至42℃水浴中放置5min(可同時(shí)做步驟7)之后以4900g離心5min，之后將上層溶液移至新的50mL的離心管中，避免吸入下層藍(lán)色液體；

(7)準(zhǔn)備HiBindMaxiColumn，加入5mL的BufferGPS于上層濾管中，室溫下靜置3-10min，之后以4900g離心5min，棄濾液，濾管備用；

(8)在步驟6中得到的上清溶液中加入0.5體積的無(wú)水乙醇，混勻后室溫下放置2min；

(9)將步驟8中的液體用步驟7中備用的濾管以4900g離心4min，棄濾液直至全部通過(guò)濾膜；

(10)濾管中加入10mL的BufferHB，以4900g離心4min，棄濾液；

(11)再次加入15mL的DNAWashBuffer，以4900g離心4min，棄濾液；

(12)再次加入10mL的DNAWashBuffer，以4900g離心4min，棄濾液；

(13)將上步的濾管以5900g離心10-15min，之后將濾管轉(zhuǎn)移至新的50mL的離心管中；

(14)向上步得到的濾膜中加入1-3mL的Endotoxin-FreeElutionBuffer，室溫靜置2min后以5900g離心5min以收集DNA溶液。

實(shí)施例4：慢病毒的包裝和細(xì)胞轉(zhuǎn)染

慢病毒包裝：用構(gòu)建的慢病毒表達(dá)載體和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝病毒，病毒液收集和濃縮，儲(chǔ)存和稀釋?zhuān)⑦M(jìn)行滴度檢測(cè)和MOI值的測(cè)定，滴度>1.00E+08TU/mL，MOI值在5-10之間。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染：(1)轉(zhuǎn)染前24h，用胰蛋白酶(0.125％)消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞(細(xì)胞融合度為85％-95％)，以含完全培養(yǎng)基(DMEM：4.5g/Lglucose,含NaHCO₃或丙酮酸鈉+5％或10％血清+1mg/ml雙抗)調(diào)整細(xì)胞密度(1:4-5)傳代，重新接種于培養(yǎng)器皿(T75瓶或d15培養(yǎng)皿)培養(yǎng)(37℃、5％CO2、飽和濕度)；

(2)24h后轉(zhuǎn)染，細(xì)胞融合度密度達(dá)45-65％；

(3)轉(zhuǎn)染前0.5-1.5h將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為新鮮純培養(yǎng)，DMEM:4.5g/Lglucose,含NaHCO₃或丙酮酸鈉+無(wú)血清+無(wú)雙抗；

(4)向一滅菌離心管中加入所制備的各DNA溶液，與相應(yīng)體積的CaCl₂混合均勻，在室溫下溫育5min，構(gòu)成DNA-氯化鈣溶液；

(5)將DNA-氯化鈣溶液(緩慢逐滴吹泡)加入BBS液混勻(不要振蕩)；室溫孵育10-20min，構(gòu)成DNA-氯化鈣-BBS溶液；

(6)將DNA-氯化鈣-BBS溶液平均并均勻滴加于293T細(xì)胞的培養(yǎng)液中(盡量不要晃動(dòng)培養(yǎng)器皿)，培養(yǎng)(37℃、5％CO₂、飽和濕度)4-16h(一般為8-10h)。棄去含磷酸鈣沉淀的培養(yǎng)液(輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)板數(shù)次以充分懸浮磷酸鈣鈣沉淀)，換新鮮完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)；

(7)24或36h觀察轉(zhuǎn)染效果90％以上48h-54h后可進(jìn)行病毒的收集。

從轉(zhuǎn)染結(jié)果可以看出，轉(zhuǎn)染效率85％以上，細(xì)胞狀態(tài)良好。

申請(qǐng)人聲明，本發(fā)明通過(guò)上述實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的詳細(xì)方法，但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)方法，即不意味著本發(fā)明必須依賴(lài)上述詳細(xì)方法才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)，對(duì)本發(fā)明產(chǎn)品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開(kāi)范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南省華隆生物技術(shù)有限公司

<120> 一種基于pCDH的熒光素酶的重組載體及其應(yīng)用

<130> 2016

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 9037

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 1

acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 60

acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 120

cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 180

attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc 240

tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 300

agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 360

ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 420

cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct 480

tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 540

gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag 600

aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt 660

aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt 720

agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg 780

atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag 840

gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag 900

taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg 960

acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag 1020

cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag 1080

ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcc tcaatgacgc 1140

tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga 1200

gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc 1260

aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg 1320

gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata 1380

aatctctgga acagattgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa 1440

ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 1500

acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1560

ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1620

agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1680

tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 1740

tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtatcggtt 1800

aacttttaaa agaaaagggg ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat 1860

aatagcaaca gacatacaaa ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaat tcaaaatttt 1920

atcgatacta gtattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 1980

tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc 2040

gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga 2100

gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat 2160

tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggttta tataagcaga gctcgtttag 2220

tgaaccgtca gatcgcctgg agacgccatc cacgctgttt tgacctccat agaagattct 2280

agagctagcg aattcgaatt taaatcggat ccatggccga tgctaagaac attaagaagg 2340

gccctgctcc cttctaccct ctggaggatg gcaccgctgg cgagcagctg cacaaggcca 2400

tgaagaggta tgccctggtg cctggcacca ttgccttcac cgatgcccac attgaggtgg 2460

acatcaccta tgccgagtac ttcgagatgt ctgtgcgcct ggccgaggcc atgaagaggt 2520

acggcctgaa caccaaccac cgcatcgtgg tgtgctctga gaactctctg cagttcttca 2580

tgccagtgct gggcgccctg ttcatcggag tggccgtggc ccctgctaac gacatttaca 2640

acgagcgcga gctgctgaac agcatgggca tttctcagcc taccgtggtg ttcgtgtcta 2700

agaagggcct gcagaagatc ctgaacgtgc agaagaagct gcctatcatc cagaagatca 2760

tcatcatgga ctctaagacc gactaccagg gcttccagag catgtacaca ttcgtgacat 2820

ctcatctgcc tcctggcttc aacgagtacg acttcgtgcc agagtctttc gacagggaca 2880

aaaccattgc cctgatcatg aacagctctg ggtctaccgg cctgcctaag ggcgtggccc 2940

tgcctcatcg caccgcctgt gtgcgcttct ctcacgcccg cgaccctatt ttcggcaacc 3000

agatcatccc cgacaccgct attctgagcg tggtgccatt ccaccacggc ttcggcatgt 3060

tcaccaccct gggctacctg atttgcggct ttcgggtggt gctgatgtac cgcttcgagg 3120

aggagctgtt cctgcgcagc ctgcaagact acaaaattca gtctgccctg ctggtgccaa 3180

ccctgttcag cttcttcgct aagagcaccc tgatcgacaa gtacgacctg tctaacctgc 3240

acgagattgc ctctggcggc gccccactgt ctaaggaggt gggcgaagcc gtggccaagc 3300

gctttcatct gccaggcatc cgccagggct acggcctgac cgagacaacc agcgccattc 3360

tgattacccc agagggcgac gacaagcctg gcgccgtggg caaggtggtg ccattcttcg 3420

aggccaaggt ggtggacctg gacaccggca agaccctggg agtgaaccag cgcggcgagc 3480

tgtgtgtgcg cggccctatg attatgtccg gctacgtgaa taaccctgag gccacaaacg 3540

ccctgatcga caaggacggc tggctgcact ctggcgacat tgcctactgg gacgaggacg 3600

agcacttctt catcgtggac cgcctgaagt ctctgatcaa gtacaagggc taccaggtgg 3660

ccccagccga gctggagtct atcctgctgc agcaccctaa cattttcgac gccggagtgg 3720

ccggcctgcc cgacgacgat gccggcgagc tgcctgccgc cgtcgtcgtg ctggaacacg 3780

gcaagaccat gaccgagaag gagatcgtgg actatgtggc cagccaggtg acaaccgcca 3840

agaagctgcg cggcggagtg gtgttcgtgg acgaggtgcc caagggcctg accggcaagc 3900

tggacgcccg caagatccgc gagatcctga tcaaggctaa gaaaggcggc aagatcgccg 3960

tgtaagcggc cgcgaaggat ctgcgatcgc tccggtgccc gtcagtgggc agagcgcaca 4020

tcgcccacag tccccgagaa gttgggggga ggggtcggca attgaacggg tgcctagaga 4080

aggtggcgcg gggtaaactg ggaaagtgat gtcgtgtact ggctccgcct ttttcccgag 4140

ggtgggggag aaccgtatat aagtgcagta gtcgccgtga acgttctttt tcgcaacggg 4200

tttgccgcca gaacacagct gaagcttcga ggggctcgca tctctccttc acgcgcccgc 4260

cgccctacct gaggccgcca tccacgccgg ttgagtcgcg ttctgccgcc tcccgcctgt 4320

ggtgcctcct gaactgcgtc cgccgtctag gtaagtttaa agctcaggtc gagaccgggc 4380

ctttgtccgg cgctcccttg gagcctacct agactcagcc ggctctccac gctttgcctg 4440

accctgcttg ctcaactcta cgtctttgtt tcgttttctg ttctgcgccg ttacagatcc 4500

aagctgtgac cggcgcctac gctagatgac cgagtacaag cccacggtgc gcctcgccac 4560

ccgcgacgac gtccccaggg ccgtacgcac cctcgccgcc gcgttcgccg actaccccgc 4620

cacgcgccac accgtcgatc cggaccgcca catcgagcgg gtcaccgagc tgcaagaact 4680

cttcctcacg cgcgtcgggc tcgacatcgg caaggtgtgg gtcgcggacg acggcgccgc 4740

ggtggcggtc tggaccacgc cggagagcgt cgaagcgggg gcggtgttcg ccgagatcgg 4800

cccgcgcatg gccgagttga gcggttcccg gctggccgcg cagcaacaga tggaaggcct 4860

cctggcgccg caccggccca aggagcccgc gtggttcctg gccaccgtcg gcgtctcgcc 4920

cgaccaccag ggcaagggtc tgggcagcgc cgtcgtgctc cccggagtgg aggcggccga 4980

gcgcgccggg gtgcccgcct tcctggagac ctccgcgccc cgcaacctcc ccttctacga 5040

gcggctcggc ttcaccgtca ccgccgacgt cgaggtgccc gaaggaccgc gcacctggtg 5100

catgacccgc aagcccggtg cctgagtcga caatcaacct ctggattaca aaatttgtga 5160

aagattgact ggtattctta actatgttgc tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt 5220

aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg tatggctttc attttctcct ccttgtataa 5280

atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt gtggcccgtt gtcaggcaac gtggcgtggt 5340

gtgcactgtg tttgctgacg caacccccac tggttggggc attgccacca cctgtcagct 5400

cctttccggg actttcgctt tccccctccc tattgccacg gcggaactca tcgccgcctg 5460

ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct gttgggcact gacaattccg tggtgttgtc 5520

ggggaaatca tcgtcctttc cttggctgct cgcctgtgtt gccacctgga ttctgcgcgg 5580

gacgtccttc tgctacgtcc cttcggccct caatccagcg gaccttcctt cccgcggcct 5640

gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct tcgccttcgc cctcagacga gtcggatctc 5700

cctttgggcc gcctccccgc ctggtacctt taagaccaat gacttacaag gcagctgtag 5760

atcttagcca ctttttaaaa gaaaaggggg gactggaagg gctaattcac tcccaacgaa 5820

aataagatct gctttttgct tgtactgggt ctctctggtt agaccagatc tgagcctggg 5880

agctctctgg ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca ataaagcttg ccttgagtgc 5940

ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa ctagagatcc ctcagaccct 6000

tttagtcagt gtggaaaatc tctagcagta gtagttcatg tcatcttatt attcagtatt 6060

tataacttgc aaagaaatga atatcagaga gtgagaggaa cttgtttatt gcagcttata 6120

atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc 6180

attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg ctctagctat 6240

cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc catggctgac taattttttt 6300

tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg 6360

cttttttgga ggcctagact tttgcagaga cggcccaaat tcgtaatcat ggtcatagct 6420

gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat 6480

aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc 6540

actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg 6600

cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct 6660

gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt 6720

atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc 6780

caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga 6840

gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata 6900

ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac 6960

cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg 7020

taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc 7080

cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag 7140

acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt 7200

aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt 7260

atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg 7320

atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac 7380

gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca 7440

gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac 7500

ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac 7560

ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt 7620

tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt 7680

accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt 7740

atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc 7800

cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa 7860

tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg 7920

tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt 7980

gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc 8040

agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt 8100

aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg 8160

gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac 8220

tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc 8280

gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt 8340

tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg 8400

aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag 8460

catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa 8520

acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat 8580

tattatcatg acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc gtctcgcgcg 8640

tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg 8700

tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg 8760

gtgtcggggc tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag tgcaccatat 8820

gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gccattcgcc 8880

attcaggctg cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca 8940

gctggcgaaa gggggatgtg ctgcaaggcg attaagttgg gtaacgccag ggttttccca 9000

gtcacgacgt tgtaaaacga cggccagtgc caagctg 9037

<210> 2

<211> 550

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 2

Met Ala Asp Ala Lys Asn Ile Lys Lys Gly Pro Ala Pro Phe Tyr Pro

1 5 10 15

Leu Glu Asp Gly Thr Ala Gly Glu Gln Leu His Lys Ala Met Lys Arg

20 25 30

Tyr Ala Leu Val Pro Gly Thr Ile Ala Phe Thr Asp Ala His Ile Glu

35 40 45

Val Asp Ile Thr Tyr Ala Glu Tyr Phe Glu Met Ser Val Arg Leu Ala

50 55 60

Glu Ala Met Lys Arg Tyr Gly Leu Asn Thr Asn His Arg Ile Val Val

65 70 75 80

Cys Ser Glu Asn Ser Leu Gln Phe Phe Met Pro Val Leu Gly Ala Leu

85 90 95

Phe Ile Gly Val Ala Val Ala Pro Ala Asn Asp Ile Tyr Asn Glu Arg

100 105 110

Glu Leu Leu Asn Ser Met Gly Ile Ser Gln Pro Thr Val Val Phe Val

115 120 125

Ser Lys Lys Gly Leu Gln Lys Ile Leu Asn Val Gln Lys Lys Leu Pro

130 135 140

Ile Ile Gln Lys Ile Ile Ile Met Asp Ser Lys Thr Asp Tyr Gln Gly

145 150 155 160

Phe Gln Ser Met Tyr Thr Phe Val Thr Ser His Leu Pro Pro Gly Phe

165 170 175

Asn Glu Tyr Asp Phe Val Pro Glu Ser Phe Asp Arg Asp Lys Thr Ile

180 185 190

Ala Leu Ile Met Asn Ser Ser Gly Ser Thr Gly Leu Pro Lys Gly Val

195 200 205

Ala Leu Pro His Arg Thr Ala Cys Val Arg Phe Ser His Ala Arg Asp

210 215 220

Pro Ile Phe Gly Asn Gln Ile Ile Pro Asp Thr Ala Ile Leu Ser Val

225 230 235 240

Val Pro Phe His His Gly Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Gly Tyr Leu

245 250 255

Ile Cys Gly Phe Arg Val Val Leu Met Tyr Arg Phe Glu Glu Glu Leu

260 265 270

Phe Leu Arg Ser Leu Gln Asp Tyr Lys Ile Gln Ser Ala Leu Leu Val

275 280 285

Pro Thr Leu Phe Ser Phe Phe Ala Lys Ser Thr Leu Ile Asp Lys Tyr

290 295 300

Asp Leu Ser Asn Leu His Glu Ile Ala Ser Gly Gly Ala Pro Leu Ser

305 310 315 320

Lys Glu Val Gly Glu Ala Val Ala Lys Arg Phe His Leu Pro Gly Ile

325 330 335

Arg Gln Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Thr Ser Ala Ile Leu Ile Thr

340 345 350

Pro Glu Gly Asp Asp Lys Pro Gly Ala Val Gly Lys Val Val Pro Phe

355 360 365

Phe Glu Ala Lys Val Val Asp Leu Asp Thr Gly Lys Thr Leu Gly Val

370 375 380

Asn Gln Arg Gly Glu Leu Cys Val Arg Gly Pro Met Ile Met Ser Gly

385 390 395 400

Tyr Val Asn Asn Pro Glu Ala Thr Asn Ala Leu Ile Asp Lys Asp Gly

405 410 415

Trp Leu His Ser Gly Asp Ile Ala Tyr Trp Asp Glu Asp Glu His Phe

420 425 430

Phe Ile Val Asp Arg Leu Lys Ser Leu Ile Lys Tyr Lys Gly Tyr Gln

435 440 445

Val Ala Pro Ala Glu Leu Glu Ser Ile Leu Leu Gln His Pro Asn Ile

450 455 460

Phe Asp Ala Gly Val Ala Gly Leu Pro Asp Asp Asp Ala Gly Glu Leu

465 470 475 480

Pro Ala Ala Val Val Val Leu Glu His Gly Lys Thr Met Thr Glu Lys

485 490 495

Glu Ile Val Asp Tyr Val Ala Ser Gln Val Thr Thr Ala Lys Lys Leu

500 505 510

Arg Gly Gly Val Val Phe Val Asp Glu Val Pro Lys Gly Leu Thr Gly

515 520 525

Lys Leu Asp Ala Arg Lys Ile Arg Glu Ile Leu Ile Lys Ala Lys Lys

530 535 540

Gly Gly Lys Ile Ala Val

545 550

<210> 3

<211> 4955

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 3

ggtaccgagt ttctagacgg agtactgtcc tccgagcgga gtactgtcct ccgactcgag 60

cggagtactg tcctccgatc ggagtactgt cctccgcgaa ttccggagta ctgtcctccg 120

aagacgctag cggggggcta taaaaggggg tgggggcgtt cgtcctcact ctagatctgc 180

gatctaagta agcttggcat tccggtactg ttggtaaagc caccatggaa gacgccaaaa 240

acataaagaa aggcccggcg ccattctatc cgctggaaga tggaaccgct ggagagcaac 300

tgcataaggc tatgaagaga tacgccctgg ttcctggaac aattgctttt acagatgcac 360

atatcgaggt ggacatcact tacgctgagt acttcgaaat gtccgttcgg ttggcagaag 420

ctatgaaacg atatgggctg aatacaaatc acagaatcgt cgtatgcagt gaaaactctc 480

ttcaattctt tatgccggtg ttgggcgcgt tatttatcgg agttgcagtt gcgcccgcga 540

acgacattta taatgaacgt gaattgctca acagtatggg catttcgcag cctaccgtgg 600

tgttcgtttc caaaaagggg ttgcaaaaaa ttttgaacgt gcaaaaaaag ctcccaatca 660

tccaaaaaat tattatcatg gattctaaaa cggattacca gggatttcag tcgatgtaca 720

cgttcgtcac atctcatcta cctcccggtt ttaatgaata cgattttgtg ccagagtcct 780

tcgataggga caagacaatt gcactgatca tgaactcctc tggatctact ggtctgccta 840

aaggtgtcgc tctgcctcat agaactgcct gcgtgagatt ctcgcatgcc agagatccta 900

tttttggcaa tcaaatcatt ccggatactg cgattttaag tgttgttcca ttccatcacg 960

gttttggaat gtttactaca ctcggatatt tgatatgtgg atttcgagtc gtcttaatgt 1020

atagatttga agaagagctg tttctgagga gccttcagga ttacaagatt caaagtgcgc 1080

tgctggtgcc aaccctattc tccttcttcg ccaaaagcac tctgattgac aaatacgatt 1140

tatctaattt acacgaaatt gcttctggtg gcgctcccct ctctaaggaa gtcggggaag 1200

cggttgccaa gaggttccat ctgccaggta tcaggcaagg atatgggctc actgagacta 1260

catcagctat tctgattaca cccgaggggg atgataaacc gggcgcggtc ggtaaagttg 1320

ttccattttt tgaagcgaag gttgtggatc tggataccgg gaaaacgctg ggcgttaatc 1380

aaagaggcga actgtgtgtg agaggtccta tgattatgtc cggttatgta aacaatccgg 1440

aagcgaccaa cgccttgatt gacaaggatg gatggctaca ttctggagac atagcttact 1500

gggacgaaga cgaacacttc ttcatcgttg accgcctgaa gtctctgatt aagtacaaag 1560

gctatcaggt ggctcccgct gaattggaat ccatcttgct ccaacacccc aacatcttcg 1620

acgcaggtgt cgcaggtctt cccgacgatg acgccggtga acttcccgcc gccgttgttg 1680

ttttggagca cggaaagacg atgacggaaa aagagatcgt ggattacgtc gccagtcaag 1740

taacaaccgc gaaaaagttg cgcggaggag ttgtgtttgt ggacgaagta ccgaaaggtc 1800

ttaccggaaa actcgacgca agaaaaatca gagagatcct cataaaggcc aagaagggcg 1860

gaaagatcgc cgtgtaattc tagagtcggg gcggccggcc gcttcgagca gacatgataa 1920

gatacattga tgagtttgga caaaccacaa ctagaatgca gtgaaaaaaa tgctttattt 1980

gtgaaatttg tgatgctatt gctttatttg taaccattat aagctgcaat aaacaagtta 2040

acaacaacaa ttgcattcat tttatgtttc aggttcaggg ggaggtgtgg gaggtttttt 2100

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ttgagagcct tcaacccagt cagctccttc cggtgggcgc ggggcatgac tatcgtcgcc 2220

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cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc 2340

tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat 2400

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aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc 2580

tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt 2640

ggcgctttct caatgctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa 2700

gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta 2760

tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa 2820

caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa 2880

ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt 2940

cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt 3000

ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat 3060

cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat 3120

gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc 3180

aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc 3240

acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta 3300

gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga 3360

cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg 3420

cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc 3480

tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat 3540

cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag 3600

gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat 3660

cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa 3720

ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa 3780

gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga 3840

taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg 3900

gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc 3960

acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg 4020

aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact 4080

cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat 4140

atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt 4200

gccacctgac gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag 4260

cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt 4320

tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt 4380

ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg 4440

tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt 4500

taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt 4560

tgatttataa gggattttgc cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca 4620

aaaatttaac gcgaatttta acaaaatatt aacgtttaca atttcccatt cgccattcag 4680

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gctaccatga taagtaagta atattaaggt acgggaggta cttggagcgg ccgcaataaa 4800

atatctttat tttcattaca tctgtgtgtt ggttttttgt gtgaatcgat agtactaaca 4860

tacgctctcc atcaaaacaa aacgaaacaa aacaaactag caaaataggc tgtccccagt 4920

gcaagtgcag gtgccagaac atttctctat cgata 4955

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 4

cgcggatcca tggccttacc agtgaccgct ccggt 35

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 5

ccagcggccg caatcgctcc cccgtcccgg a 31