本發(fā)明屬于細(xì)胞分選用器械及其細(xì)胞分選方法，特別是針對(duì)循環(huán)血中腫瘤細(xì)胞的分選器械及分選方法，具體涉及為一種循環(huán)血腫瘤細(xì)胞的聯(lián)合分選純化裝置及分選檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

腫瘤轉(zhuǎn)移是造成腫瘤患者死亡的重要原因之一，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤患者循環(huán)血中腫瘤細(xì)胞(CTC)與患者轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。對(duì)CTC的分選有助于腫瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)和判斷、為疾病提供重要的預(yù)后信息及個(gè)體化治療。故從循環(huán)血中去除血細(xì)胞，分離純度高的CTC已成為診斷腫瘤、判斷預(yù)后的關(guān)鍵。但由于CTC在外周血中數(shù)目極少，而且入血呈現(xiàn)不連續(xù)性，并有很強(qiáng)的異質(zhì)性，CTC分選具有一定挑戰(zhàn)。

現(xiàn)有的CTC分選、檢測(cè)方法主要基于腫瘤細(xì)胞與其他血細(xì)胞在物理性質(zhì)(密度和大小)、特異性抗原表達(dá)等方面的差異進(jìn)行?；谔禺愋钥乖磉_(dá)的免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的CellSearch分選富集系統(tǒng)，針對(duì)腫瘤細(xì)胞表面上皮細(xì)胞粘附分子(epithelialcelladhesionmolecule，EpCAM)進(jìn)行CTC分選，該系統(tǒng)已被美國FDA批準(zhǔn)用于檢測(cè)乳腺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌CTC。但由于EpCAM局限于上皮來源腫瘤細(xì)胞，此外腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移過程中可能發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，EpCAM和CK表達(dá)下調(diào)，也會(huì)造成捕獲率下降。因此以上缺陷限制了CellSearch系統(tǒng)CTC的檢測(cè)能力。此外該系統(tǒng)價(jià)格昂貴，難以在臨床上廣泛使用?；谖锢硇再|(zhì)分選富集具有操作簡便，成本低的特點(diǎn)，但靈敏度相對(duì)不足，進(jìn)行存在特異度、敏感度差，操作繁瑣等問題。

免疫磁珠分選技術(shù)是一種新的細(xì)胞分離技術(shù)，是基于細(xì)胞表面抗原能與磁珠表面包被具有免疫原性的抗體特異性結(jié)合，在外加磁場(chǎng)中，通過抗體與磁珠相連的細(xì)胞吸附聚集，無該種表面抗原的細(xì)胞由于不能與磁珠特異性結(jié)合而不具有磁性，從而將細(xì)胞分離。除此之外，免疫磁珠體積小，在細(xì)胞培養(yǎng)中能生物降解而無需進(jìn)行專門的去除，并不影響細(xì)胞活性。而且現(xiàn)有的微流控芯片技術(shù)可以初步實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的分選。如果能將微流控芯片技術(shù)及免疫磁珠分選技術(shù)合理聯(lián)合定能為檢測(cè)CTC提供一種更為高效的方法。

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的CTC分選純化技術(shù)成本高，靈敏度低，特異性差等問題，將微流控芯片技術(shù)與免疫磁珠分選技術(shù)進(jìn)行聯(lián)合，提供一種循環(huán)血腫瘤細(xì)胞的聯(lián)合分選純化裝置及分選檢測(cè)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的CTC分選純化技術(shù)成本高，靈敏度低，特異性差等問題，本發(fā)明將微流控芯片技術(shù)與免疫磁珠分選技術(shù)進(jìn)行聯(lián)合提供一種循環(huán)血腫瘤細(xì)胞的聯(lián)合分選純化裝置及其循環(huán)血腫瘤細(xì)的檢測(cè)方法。

一種循環(huán)血腫瘤細(xì)胞的聯(lián)合分選純化裝置，包括分選結(jié)構(gòu)、純化結(jié)構(gòu)及控制結(jié)構(gòu)；其特征在于，所述控制結(jié)構(gòu)伸出導(dǎo)線連接分選結(jié)構(gòu)及純化結(jié)構(gòu)；控制結(jié)構(gòu)控制分選結(jié)構(gòu)及純化結(jié)構(gòu)，所述分選結(jié)構(gòu)包括微流控芯片，雙噴氣壓泵、氮?dú)夤蕖@微鏡，各部分連接構(gòu)建自動(dòng)化氣壓泵壓力驅(qū)動(dòng)微流控芯片系統(tǒng)；所述微流控芯片內(nèi)包含一到數(shù)列陣列通道；所述陣列通道包括兩側(cè)微陣列柱形成的小細(xì)胞過道，及兩側(cè)微柱陣列中間的大細(xì)胞過道，小細(xì)胞過道匯集一個(gè)出口，大細(xì)胞過道匯集一個(gè)出口；所述純化結(jié)構(gòu)包括純化芯片，永磁鐵，供永磁鐵運(yùn)動(dòng)的兩個(gè)帶軌道的步進(jìn)電機(jī)，永磁鐵設(shè)置于純化芯片下方，兩個(gè)步進(jìn)電機(jī)垂直設(shè)置，且一個(gè)步進(jìn)電機(jī)設(shè)置在另一個(gè)步進(jìn)電機(jī)上；永磁鐵設(shè)置于一個(gè)步進(jìn)電機(jī)上，控制結(jié)構(gòu)控制步進(jìn)電機(jī)的運(yùn)動(dòng)；微流控芯片通過管狀結(jié)構(gòu)連接純化芯片，控制結(jié)構(gòu)包括電源，控制單元，電路板。本裝置的小細(xì)胞過道通過的是白細(xì)胞等小細(xì)胞，大細(xì)胞過道通過的是腫瘤細(xì)胞及少量白細(xì)胞。本裝置可以實(shí)現(xiàn)微陣列芯片及免疫磁珠技術(shù)的結(jié)合，將通過微陣列的大細(xì)胞過道的循環(huán)血細(xì)胞移入純化芯片，并通過在純化芯片內(nèi)加入免疫磁珠，兩步進(jìn)電機(jī)帶動(dòng)永磁鐵運(yùn)動(dòng)，達(dá)到充分混合的目的，最后通過固定永磁鐵將白細(xì)胞吸附于底部，在上清液中得到純化的腫瘤細(xì)胞。

進(jìn)一步，所述分選結(jié)構(gòu)還包括支撐件，支撐件支撐微流控芯片。用于支撐微流控芯片到一定高度，支撐件支撐微流控芯片可以更好的穩(wěn)定微流控芯片。

進(jìn)一步，陣列通道兩側(cè)微陣列柱可以為任意形狀的微陣列柱，如平行四邊形，正方形，三角形等；其中優(yōu)選的微陣列柱為正三角形微陣列柱，正三角形微陣列柱之間形成小細(xì)胞過道，及微陣列柱中間為大細(xì)胞過道。

進(jìn)一步，正三角形微柱的邊長為25um，柱子水平的間距為30um，垂直間距為20um，陣列的前斜角為3.2°。

進(jìn)一步，微流控芯片與純化芯片水平高度相同。

進(jìn)一步，一個(gè)步進(jìn)電機(jī)上設(shè)置永磁鐵，永磁鐵通過設(shè)置在軌道上的滑塊設(shè)置在步進(jìn)電機(jī)軌道上；而設(shè)置永磁鐵的步進(jìn)電機(jī)通過另一個(gè)步進(jìn)電機(jī)軌道上的支撐塊設(shè)置在另一步進(jìn)電機(jī)軌道上。

進(jìn)一步，所述純化芯片包括三層結(jié)構(gòu)，為底板層，凹槽層及入口出口設(shè)置層；底板層位于最下方，凹槽層位于中間，入口出口設(shè)置層設(shè)置在最上方，凹槽層的凹槽圍成反應(yīng)室；入口出口層上對(duì)應(yīng)反應(yīng)室的位置設(shè)置入口與出口。

進(jìn)一步，所述純化芯片可設(shè)置任意適合大小，其中優(yōu)選大小50mm×40mm，入口出口設(shè)置層上入口出口的優(yōu)選孔徑為1.5mm，反應(yīng)室的容積可設(shè)置任意合理的范圍，其中優(yōu)選反應(yīng)室尺寸11mm×7mm×3mm或者20mm×10mm×3mm。

進(jìn)一步，所述微流控芯片包括底層與芯片層，芯片層上設(shè)置一到數(shù)個(gè)列陣列通道及出入口。

進(jìn)一步，所述微流控芯片長70-80mm，寬20-30mm。

進(jìn)一步，所述單個(gè)陣列通道長68mm，寬3.5mm，高50um。

進(jìn)一步，所述永磁鐵形狀為圓柱形，其設(shè)置于純化芯片反應(yīng)室的下方。

進(jìn)一步，所述單個(gè)陣列通道設(shè)置兩個(gè)入口，兩個(gè)出口；兩入口一個(gè)為分選細(xì)胞入口，另一個(gè)為緩沖液入口；兩個(gè)出口一個(gè)為需純化細(xì)胞出口，及一個(gè)廢液出口，廢液出口連通小細(xì)胞過道，需純化細(xì)胞出口連通大細(xì)胞過道。

進(jìn)一步，各陣列通道的分選細(xì)胞入口相通，緩沖液入口相通，廢液出口相桶，各需純化出口相通，但不同名稱的出入口并不相通；最終在微流控芯片表層匯成兩個(gè)入口一個(gè)為總分選細(xì)胞入口，另一個(gè)為總緩沖液入口，兩個(gè)出口分別為總廢液出口及總需純化細(xì)胞出口。

進(jìn)一步，所述總需純化細(xì)胞出口通過管狀結(jié)構(gòu)連接純化芯片上的入口。

進(jìn)一步，所述分選細(xì)胞為含腫瘤細(xì)胞的血液；所述需純化細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞及白細(xì)胞。

進(jìn)一步，所述微流控芯片采用PDMS材料及軟光刻技術(shù)制備。

進(jìn)一步，所述純化芯片由PMMA材料制成。

進(jìn)一步，所述管狀結(jié)構(gòu)為軟管6。

本發(fā)明還公開了上述循環(huán)血腫瘤細(xì)胞的聯(lián)合分選純化裝置的制備方法：

分選結(jié)構(gòu)的制備：

1)微流控芯片的制備：設(shè)計(jì)正三角形微陣列柱結(jié)構(gòu)，采用PDMS材料及軟光刻技術(shù)進(jìn)行芯片制作；按照設(shè)計(jì)的圖形制作掩膜；

2)將雙噴氣壓泵、氮?dú)夤?、制作好的DLD芯片，控制結(jié)構(gòu)和顯微鏡連接起來，構(gòu)建自動(dòng)化的氣壓泵壓力驅(qū)動(dòng)微流控芯片系統(tǒng)。

純化結(jié)構(gòu)的制備：

1)純化芯片的制備：選擇聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)材料，通過注塑成型方法制作而成的。應(yīng)用激光雕刻機(jī)對(duì)芯片的反應(yīng)室，入口及出口進(jìn)行激光刻蝕。將三層制備好的單層芯片通過熱壓法鍵和。

2)將步進(jìn)電機(jī)，支撐結(jié)構(gòu)，純化芯片及控制結(jié)構(gòu)組裝。

最后，將分選結(jié)構(gòu)、純化結(jié)構(gòu)與控制結(jié)構(gòu)連接，并通過管狀結(jié)構(gòu)將微流控芯片與純化芯片連接。

本發(fā)明還公開了一種分選檢測(cè)循環(huán)血腫瘤細(xì)胞的方法，具體包括：

1)將帶腫瘤細(xì)胞的外周血及緩沖液引入微流控芯片內(nèi)；

2)打開控制結(jié)構(gòu)的開關(guān)，分選細(xì)胞通過大細(xì)胞過道與小細(xì)胞過道進(jìn)行分選；

3)通過大細(xì)胞過道的需純化細(xì)胞通過微流控芯片上的總需純化細(xì)胞出口經(jīng)管狀結(jié)構(gòu)進(jìn)入純化芯片入口，經(jīng)過小細(xì)胞過道的細(xì)胞被廢棄；

4)在純化芯片的反應(yīng)室內(nèi)加入免疫磁珠；

5)啟動(dòng)純化裝置的步進(jìn)電機(jī)，帶動(dòng)永磁鐵運(yùn)動(dòng)，使免疫磁珠與白細(xì)胞充分混合一定時(shí)間，并有效結(jié)合，使其下部在永磁鐵的吸引作用下位于反應(yīng)室下方，上清液中的細(xì)胞即為腫瘤細(xì)胞；

6)將上清液取出放入培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)并進(jìn)行鑒定。

7)通過免疫抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)，最后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的不同顯色情況，進(jìn)而將CTC與白細(xì)胞鑒定。

進(jìn)一步，所述緩沖液為PBS緩沖液。

進(jìn)一步，將帶腫瘤細(xì)胞的外周血通過微流控芯片上的分選細(xì)胞入口進(jìn)入芯片，所述PBS緩沖液通過緩沖液入口進(jìn)入芯片內(nèi)，由氣壓泵控制液體的流速。

進(jìn)一步，所述管狀結(jié)構(gòu)為設(shè)置于微流控芯片需純化細(xì)胞出口及純化芯片入口之間的軟管結(jié)構(gòu)，軟管結(jié)構(gòu)為用于運(yùn)輸?shù)墓艿澜Y(jié)構(gòu)。

進(jìn)一步，所述的免疫磁珠為CD45免疫磁珠。

進(jìn)一步，所述培養(yǎng)基為鼠尾膠原蛋白培養(yǎng)基。

進(jìn)一步，免疫磁珠與白細(xì)胞充分混合20min，免疫磁珠與白細(xì)胞混合比例為10:1。

進(jìn)一步，步驟7中免疫抗原抗體反應(yīng)中使用的試劑是EpCAM抗體、CK抗體、CD45抗體及DAPI標(biāo)記細(xì)胞核。CTC表達(dá)EpCAM+/CK+/CD45-/DAPI+,白細(xì)胞表達(dá)EpCAM-/CK-/CD45+/DAPI+。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明循環(huán)血腫瘤細(xì)胞的聯(lián)合分選純化裝置可以很好的實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的分選與純化，合理的將微流控芯片技術(shù)，免疫磁珠技術(shù)及細(xì)胞免疫熒光反應(yīng)組合。為有效檢測(cè)分選處腫瘤細(xì)胞提供了更為有效的方式。另外裝置具備用時(shí)短(總分選時(shí)間約為30min)，cellsearch為4h，價(jià)格低(500VS5000RMB)，樣本需求量小(3-4mlVS7.5ml)，裝置小、便捷等優(yōu)勢(shì)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明整體結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為本發(fā)明整體上視結(jié)構(gòu)透視圖；

圖3為本發(fā)明純化結(jié)構(gòu)示意圖；

圖4為本發(fā)明微流控芯片與純化芯片連接示意圖；

圖5為本發(fā)明純化芯片構(gòu)示意圖；

圖6為本發(fā)明微流控芯片結(jié)構(gòu)示意圖；

圖7為本發(fā)明正三角形陣列局部放大結(jié)構(gòu)示意圖；

圖中，11、微流控芯片；111、底層；112、芯片層；12、陣列通道；13、正三角形微陣列柱；14、小細(xì)胞過道；15、大細(xì)胞過道；16、總分選細(xì)胞入口；17、總緩沖液入口；18、總廢液出口；19、總需純化細(xì)胞出口；21、純化芯片；211、底板層；212、凹槽層；213、入口出口設(shè)置層；214、反應(yīng)室；215、純化芯片入口；216、純化芯片出口；22、永磁鐵；23、步進(jìn)電機(jī)；24、滑塊；25、支撐塊；3、控制結(jié)構(gòu)；4、支撐件；5、支撐桿；6、軟管。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1一種循環(huán)血腫瘤細(xì)胞的聯(lián)合分選純化裝置

一種循環(huán)血腫瘤細(xì)胞的聯(lián)合分選純化裝置，包括分選結(jié)構(gòu)、純化結(jié)構(gòu)及控制結(jié)構(gòu)3；其中，控制結(jié)構(gòu)3伸出導(dǎo)線連接分選結(jié)構(gòu)及純化結(jié)構(gòu)；控制結(jié)構(gòu)3控制分選結(jié)構(gòu)及純化結(jié)構(gòu)；

分選結(jié)構(gòu)包括微流控芯片11，雙噴氣壓泵、氮?dú)夤蕖@微鏡，各部分連接構(gòu)建自動(dòng)化氣壓泵壓力驅(qū)動(dòng)微流控芯片11系統(tǒng)；芯片總體大小25.4*76.2mm。其包括底層111與芯片層112，芯片層112上設(shè)置一到4個(gè)列陣列通道12及兩個(gè)出口及兩個(gè)入口，單個(gè)陣列通道12長68mm，寬3.5mm，高50um，陣列通道12兩側(cè)設(shè)置正三角形微陣列柱13，正三角形微陣列柱13之間形成小細(xì)胞過道14，及正三角形微陣列柱13中間為大細(xì)胞過道15；正三角形微柱的邊長為25um，柱子水平的間距為30um，垂直間距為20um，陣列的前斜角為3.2°。小細(xì)胞過道14匯集廢液出口，大細(xì)胞過道15匯集需純化細(xì)胞出口；陣列通道12還包括兩個(gè)入口，一個(gè)為分選細(xì)胞入口，另一個(gè)為緩沖液入口；各陣列通道12的分選細(xì)胞入口相通最終匯聚到芯片層112表層的總分選細(xì)胞入口16，緩沖液入口相通最終匯聚到芯片層112表層的總緩沖液細(xì)胞入口，廢液出口相桶最終匯聚到芯片層112表層的總廢液出口18，各需純化出口相通最終匯聚到芯片層112表層的總需純化細(xì)胞出口19。分選結(jié)構(gòu)還包括一個(gè)支撐件4，支撐件4支撐微流控芯片11。用于支撐微流控芯片11到一定高度。微流控芯片11采用PDMS材料及軟光刻技術(shù)制備。

純化結(jié)構(gòu)包括純化芯片21，永磁鐵22，供永磁鐵22運(yùn)動(dòng)的兩個(gè)帶軌道的步進(jìn)電機(jī)23，永磁鐵22設(shè)置于純化芯片21下方，兩個(gè)步進(jìn)電機(jī)23垂直設(shè)置，一個(gè)步進(jìn)電機(jī)23上設(shè)置永磁鐵22，永磁鐵22通過設(shè)置在軌道上的滑塊24設(shè)置在步進(jìn)電機(jī)23軌道上；而設(shè)置永磁鐵22的步進(jìn)電機(jī)23通過另一個(gè)步進(jìn)電機(jī)23軌道上的支撐塊25設(shè)置在另一步進(jìn)電機(jī)23軌道上?？刂平Y(jié)構(gòu)3控制步進(jìn)電機(jī)23的運(yùn)動(dòng)；純化芯片21包括三層結(jié)構(gòu)，為底板層211，凹槽層212及入口出口設(shè)置層213；底板層211位于最下方，凹槽層212位于中間，入口出口設(shè)置層213設(shè)置在最上方，凹槽層212的凹槽圍成反應(yīng)室214；入口出口設(shè)置層213上對(duì)應(yīng)反應(yīng)室214的位置設(shè)置純化芯片入口215與純化芯片出口216。純化芯片大小50mm×40mm，入口出口設(shè)置層213上入口出口的孔徑為1.5mm，反應(yīng)室尺寸11mm×7mm×3mm或者20mm×10mm×3mm。純化芯片21由PMMA材料制成。純化芯片21下設(shè)置支撐桿5使純化芯片21與微流控芯片11水平高度相同。

總需純化細(xì)胞出口19通過軟管6連接純化芯片入口215，控制結(jié)構(gòu)3包括電源，控制單元，電路板。永磁鐵22形狀為圓柱形，其設(shè)置于純化芯片21反應(yīng)室214的下方。

本裝置可以實(shí)現(xiàn)微陣列芯片及免疫磁珠技術(shù)的結(jié)合，將通過微陣列的大細(xì)胞過道15的循環(huán)血細(xì)胞移入純化芯片21，并通過在純化芯片21內(nèi)加入免疫磁珠，兩步進(jìn)電機(jī)23帶動(dòng)永磁鐵22運(yùn)動(dòng)，達(dá)到充分混合的目的，最后通過固定永磁鐵22將白細(xì)胞吸附于底部，將上清液中得到純化的腫瘤細(xì)胞。

實(shí)施例2一種循環(huán)血腫瘤細(xì)胞的聯(lián)合分選純化裝置的制備方法

一種循環(huán)血腫瘤細(xì)胞的聯(lián)合分選純化裝置的制備方法

分選結(jié)構(gòu)的制備：

1)微流控芯片11的制備：設(shè)計(jì)正三角形微陣列柱13結(jié)構(gòu)，采用PDMS材料及軟光刻技術(shù)進(jìn)行芯片制作；按照設(shè)計(jì)的圖形制作掩膜；芯片制作選擇聚二甲基硅演烷(PDMS)材料；將PDMS與固化劑按照1:10比例混勻、真空排泡，倒入模板中抽真空排氣泡，放入烤箱80℃烘烤1小時(shí)，取出后按芯片設(shè)計(jì)大小切割打孔。取清潔干凈的玻片并用氮?dú)獯蹈蓛?，與切割好的PDMS一起進(jìn)行等離子清洗、鍵合，置于烤箱80℃烘烤30分鐘。

2)將雙噴氣壓泵、氮?dú)夤蕖⒅谱骱玫腄LD芯片，控制結(jié)構(gòu)3和顯微鏡連接起來，構(gòu)建自動(dòng)化的氣壓泵壓力驅(qū)動(dòng)微流控芯片11系統(tǒng)。

純化結(jié)構(gòu)的制備：

1)純化芯片21的制備：選擇聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)材料，通過注塑成型方法制作而成的。應(yīng)用激光雕刻機(jī)對(duì)芯片的反應(yīng)室214，入口及出口進(jìn)行激光刻蝕。將三層制備好的單層芯片通過熱壓法鍵和，熱壓鍵合工藝的參數(shù)主要有鍵合壓力、鍵合溫度和鍵合時(shí)間，鍵和壓力應(yīng)在0.5～1.5MPa，鍵和溫度在90℃左右，鍵和時(shí)間為10min。

2)將步進(jìn)電機(jī)23，支撐結(jié)構(gòu)，純化芯片21及控制結(jié)構(gòu)3組裝。

最后，將分選結(jié)構(gòu)、純化結(jié)構(gòu)與控制結(jié)構(gòu)連接，并通過軟管將微流控芯片的總需純化細(xì)胞出口與純化芯片入口連接。

實(shí)施例3一種循環(huán)血腫瘤細(xì)胞的分選方法

利用實(shí)施例1中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的聯(lián)合檢測(cè)裝置分析帶腫瘤細(xì)胞的血樣，具體為：

首先取健康人外周血加入示蹤的腫瘤細(xì)胞構(gòu)成樣本，濃度分別為101/ml，102/ml，103/ml，104/ml，105/ml為計(jì)算整體裝置的分選率和分選純度。

將血樣通過DLD芯片的總分選細(xì)胞入口16，同時(shí)將PBS加入芯片的總緩沖液入口17，通過控制結(jié)構(gòu)3控制氣壓泵進(jìn)而達(dá)到控制液體的流速的目的，壓力泵為OB1PressureController(ELVEFLOW，F(xiàn)rance)。血樣流速為1ml/min，在收集口處，幾乎全部的紅細(xì)胞及90％的白細(xì)胞都從總廢液出口18流出，而示蹤的腫瘤細(xì)胞(CTC)及約10％的白細(xì)胞由總需純化細(xì)胞出口19導(dǎo)入純化芯片21的入口，進(jìn)而流入反應(yīng)室214。

后通過純化芯片21的出口加入CD45免疫磁珠，接通控制結(jié)構(gòu)3上電源及電路板上的開關(guān)，永磁鐵22會(huì)在反應(yīng)室214的底部拖動(dòng)CD45磁珠與白細(xì)胞充分混合，混合時(shí)間為20min，CD45磁珠與白細(xì)胞混合比例10:1，之后將永磁鐵22放在反應(yīng)室214底部，從出口吸出上清液，即包含CTC及極少量的白細(xì)胞(約占總白細(xì)胞的1％)。

再將上清液放在由鼠尾膠原蛋白包被的培養(yǎng)皿中，進(jìn)行下一步的鑒定。

實(shí)施例4一種循環(huán)血腫瘤細(xì)胞的分選結(jié)果的鑒定使用

1分選率的鑒定實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)材料：實(shí)施例3分選純化后的細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)方法：通過免疫抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)，使用的試劑是EpCAM抗體、CK抗體、CD45抗體及DAPI標(biāo)記細(xì)胞核。CTC表達(dá)EpCAM+/CK+/CD45-/DAPI+,白細(xì)胞表達(dá)EpCAM-/CK-/CD45+/DAPI+，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的不同顯色情況，進(jìn)而將CTC與白細(xì)胞鑒定。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，我們得出裝置的總體分選率分別為77.8％，91.7％，89.2％，91.2％and 89.5％，對(duì)應(yīng)的濃度為101/ml，102/ml，103/ml，104/ml，105/ml?？梢娧b置的分選率接近90％，分選效果很好。

2細(xì)胞活性鑒定實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)材料：實(shí)施例3分選純化后的細(xì)胞及未經(jīng)處理的培養(yǎng)箱中的細(xì)胞(對(duì)照組)

實(shí)驗(yàn)方法：分別向?qū)嶒?yàn)組、對(duì)照組中加入Hochest、PI兩種試劑，進(jìn)而在熒光顯微鏡下將正常細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞區(qū)別開來。正常細(xì)胞為低藍(lán)色(Hoechst+)，凋亡細(xì)胞為高藍(lán)色(Hoechst++)，壞死細(xì)胞為高紅色(PI++)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：對(duì)細(xì)胞活性進(jìn)行了Hochest/PI檢測(cè)，細(xì)胞活性可達(dá)90％，與正常培養(yǎng)，未經(jīng)分選的細(xì)胞無差異。因此得出，該裝置對(duì)細(xì)胞活性無影響。

2臨床效果鑒定實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)材料：肺腺癌14例(III、IV期)、乳腺癌8例(I-IV期)、結(jié)腸癌4例(III、IV期)、骨髓瘤2例(IV期)、胸腺瘤1例(IV期)、膀胱癌1例(III期)

實(shí)驗(yàn)方法：取臨床患者的循環(huán)血，分別采用實(shí)施例3的方法及臨床分選的金標(biāo)準(zhǔn)Cellsearchsystem進(jìn)行腫瘤細(xì)胞的分選純化。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：與CTC的分選金標(biāo)準(zhǔn)Cellsearchsystem進(jìn)一步對(duì)比，得出在分選性能上，與之無明顯差異。

上述實(shí)施例的說明只是用于理解本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)，這些改進(jìn)也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。