根據(jù)35U.S.C.§119(e)，本申請要求2013年12月20日遞交的美國臨時申請No.61/918,816和2014年2月10日遞交的美國臨時申請No.61/937,883的權(quán)益，以引用的方式將其內(nèi)容整體并入本文。

政府支持

本發(fā)明是在由國立衛(wèi)生研究院授予的基金號2R01CA129933的聯(lián)邦基金的支持下完成。美國政府對本發(fā)明享有一定的權(quán)利。

技術(shù)領(lǐng)域

本文所述的技術(shù)涉及癌癥的診斷和治療。

背景技術(shù)：

循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)從原發(fā)腫瘤脫落進入血流，介導癌癥向遠端器官的擴散(轉(zhuǎn)移)。因此，血流中存在的循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)最終導致癌癥擴散至遠端器官。然而，CTCs極為罕見，估計每毫升血液的一百億正常血細胞中有1到10個腫瘤細胞。就這一點而言，循環(huán)腫瘤細胞的分離和分子分析產(chǎn)生了明顯的技術(shù)挑戰(zhàn)(Pantel等，Nat Rev Cancer 2008 8：329-340；Yu等，J Cell Biol 2011 192：373-382)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

如本文所述，本發(fā)明人識別了大量基因，該基因的表達為CTCs所特有的。具體而言，這些基因的表達區(qū)別了CTCs與原發(fā)腫瘤細胞。因此，本文提供了與CTCs的檢測相關(guān)的方法和測定法(assays)，包括診斷和預(yù)后的方法和測定法。進而，本文提供了靶向這些CTCs標記(例如用來抑制轉(zhuǎn)移)來對癌癥進行的治療。

在一個方面，本文所述的為檢測樣本中的循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)的方法，所述方法包括：測量所述樣本中的PC-CTC標記基因表達產(chǎn)物的水平；以及，如果檢測到的所述標記基因表達產(chǎn)物的水平高于參比水平，則確定存在PC-CTCs。在一些實施方式中，所述CTCs為胰腺癌CTCs。在一些實施方式中，所述方法進一步包括從所述樣本中分離所述CTCs的第一步驟。在一些實施方式中，所述表達產(chǎn)物為核酸。在一些實施方式中，利用選自于由如下所組成的組中的方法對所述表達產(chǎn)物的水平進行確定：RT-PCR；定量RT-PCR；Northern印跡；基于微陣列的表達分析；下一代測序以及RNA原位雜交。在一些實施方式中，所述表達產(chǎn)物為多肽。在一些實施方式中，利用選自于由如下所組成的組中的方法對所述表達產(chǎn)物的水平進行確定：Western印跡；免疫沉淀；酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)；放射性免疫測定法(RIA)；夾心測定法；熒光原位雜交(FISH)；免疫組織學染色；放射性免疫分析測定法；免疫熒光測定法；質(zhì)譜法；FACS以及免疫電泳測定法。在一些實施方式中，所述CTC標記基因選自表7或表8。在一些實施方式中，所述CTC標記基因選自于由如下所組成的組：ABI3BP；ADAMTS5；ADAMTSL1；ANG；ARSA；C1RL；C3；C4A；C4B；CCDC80；CD109；CHI3L1；CLEC3B；CMTM3；CMTM7；COL14A1；COL1A2；COL3A1；COL4A6；CSF1；DAG1；DCN；DMKN；FBLN1；FGF1；FMOD；GPC3；GPC4；HMGB1；IFNAR2；IGFBP5；IL16；LAMA4；LTBP4；MFAP1A；NID2；OGN；PDAP1；PF4；PLAT；PODN；PRELP；RSPO1；SERPING1；SLURP1；SOD3；SPARC；SPOCK2；SPON2；SULF1；SULF2；TGFB2；TGM2；THBD；THBS1；THSD4；TIMP2；TNXB；TPT1；TWSG1和WNT4。在一些實施方式中，所述CTC標記基因選自于由如下所組成的組：ALDH1A1；ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；DCN；SPARC；WNT；TGFB2；VEGF；COL1A2；COL3A1和TIMP2。在一些實施方式中，所述CTC標記基因選自于由如下所組成的組：ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；DCN和SPARC。

在一個方面，本文所述的為對受試者中的癌癥進行治療的方法，所述方法包括：向受試者給予治療有效量的CTC標記基因靶向治療劑(therapy)。在一些實施方式中，所述癌癥為胰腺癌。在一些實施方式中，所述CTC標記基因靶向治療劑包括CTC標記基因的抑制劑。在一些實施方式中，所述抑制劑為抗體試劑。在一些實施方式中，所述抑制劑為抑制性核酸試劑。在一些實施方式中，所述CTC標記基因靶向治療劑包括CTC標記基因結(jié)合抗體試劑和化療劑。在一些實施方式中，所述受試者為被確定具有升高水平的存在于血液和/或癌間質(zhì)中的CTC標記基因和/或升高水平的CTCs的受試者。

在一個方面，本文所述的為確定受試者是否有可能對CTC標記基因靶向治療劑的治療作出響應(yīng)的方法，所述方法包括：對存在于血液和/或癌間質(zhì)中的CTC標記基因表達產(chǎn)物的水平進行測量；以及如果與參比水平相比，所述表達產(chǎn)物的水平升高，則確定受試者有可能對所述治療作出響應(yīng)。在一些實施方式中，所述方法進一步包括從所述樣本中分離所述CTCs的第一步驟。在一些實施方式中，所述癌癥為胰腺癌。在一些實施方式中，所述表達產(chǎn)物為核酸。在一些實施方式中，利用選自于由如下所組成的組中的方法對所述表達產(chǎn)物的水平進行確定：RT-PCR；定量RT-PCR；Northern印跡；基于微陣列的表達分析；下一代測序以及RNA原位雜交。在一些實施方式中，所述表達產(chǎn)物為多肽。在一些實施方式中，利用選自于由如下所組成的組中的方法對所述表達產(chǎn)物的水平進行確定：Western印跡；免疫沉淀；酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)；放射性免疫測定法(RIA)；夾心測定法；熒光原位雜交(FISH)；免疫組織學染色；放射性免疫分析測定法；免疫熒光測定法；質(zhì)譜法；FACS以及免疫電泳測定法。在一些實施方式中，所述PC-CTC標記基因選自表7或表8。在一些實施方式中，所述CTC標記基因選自于由如下所組成的組：ABI3BP；ADAMTS5；ADAMTSL1；ANG；ARSA；C1RL；C3；C4A；C4B；CCDC80；CD109；CHI3L1；CLEC3B；CMTM3；CMTM7；COL14A1；COL1A2；COL3A1；COL4A6；CSF1；DAG1；DCN；DMKN；FBLN1；FGF1；FMOD；GPC3；GPC4；HMGB1；IFNAR2；IGFBP5；IL16；LAMA4；LTBP4；MFAP1A；NID2；OGN；PDAP1；PF4；PLAT；PODN；PRELP；RSPO1；SERPING1；SLURP1；SOD3；SPARC；SPOCK2；SPON2；SULF1；SULF2；TGFB2；TGM2；THBD；THBS1；THSD4；TIMP2；TNXB；TPT1；TWSG1和WNT4。在一些實施方式中，所述CTC標記基因選自于由如下所組成的組：ALDH1A1；ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；DCN；SPARC；WNT；TGFB2；VEGF；COL1A2；COL3A1和TIMP2。在一些實施方式中，所述CTC標記基因選自于由如下所組成的組：ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；DCN和SPARC。

在一個方面，本文所述的為監(jiān)測對受試者進行的治療的方法，所述方法包括：向有需要的受試者給予癌癥治療劑；對存在于血液和/或癌間質(zhì)中的CTC標記基因表達產(chǎn)物的水平進行測量；以及如果與參比水平相比，CTC標記基因表達產(chǎn)物的水平降低，則確定受試者作出響應(yīng)，而如果與參比水平相比，CTC標記基因表達產(chǎn)物未降低，則確定受試者不對所述治療作出響應(yīng)。在一些實施方式中，所述癌癥為胰腺癌。在一些實施方式中，所述參比水平為給予步驟之前的患者中的所述基因表達產(chǎn)物的水平。在一些實施方式中，所述方法進一步包括從所述樣本中分離所述CTCs的第一步驟。在一些實施方式中，所述表達產(chǎn)物為核酸。在一些實施方式中，利用選自于由如下所組成的組中的方法對所述表達產(chǎn)物的水平進行確定：RT-PCR；定量RT-PCR；Northern印跡；基于微陣列的表達分析；下一代測序以及RNA原位雜交。在一些實施方式中，所述表達產(chǎn)物為多肽。在一些實施方式中，利用選自于由如下所組成的組中的方法對所述表達產(chǎn)物的水平進行確定：Western印跡；免疫沉淀；酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)；放射性免疫測定法(RIA)；夾心測定法；熒光原位雜交(FISH)；免疫組織學染色；放射性免疫分析測定法；免疫熒光測定法；質(zhì)譜法；FACS以及免疫電泳測定法。在一些實施方式中，所述PC-CTC標記基因選自表7或表8。在一些實施方式中，所述CTC標記基因選自于由如下所組成的組：ABI3BP；ADAMTS5；ADAMTSL1；ANG；ARSA；C1RL；C3；C4A；C4B；CCDC80；CD109；CHI3L1；CLEC3B；CMTM3；CMTM7；COL14A1；COL1A2；COL3A1；COL4A6；CSF1；DAG1；DCN；DMKN；FBLN1；FGF1；FMOD；GPC3；GPC4；HMGB1；IFNAR2；IGFBP5；IL16；LAMA4；LTBP4；MFAP1A；NID2；OGN；PDAP1；PF4；PLAT；PODN；PRELP；RSPO1；SERPING1；SLURP1；SOD3；SPARC；SPOCK2；SPON2；SULF1；SULF2；TGFB2；TGM2；THBD；THBS1；THSD4；TIMP2；TNXB；TPT1；TWSG1和WNT4。在一些實施方式中，所述CTC標記基因選自于由如下所組成的組：ALDH1A1；ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；DCN；SPARC；WNT；TGFB2；VEGF；COL1A2；COL3A1和TIMP2。在一些實施方式中，所述CTC標記基因選自于由如下所組成的組：ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；DCN和SPARC。

附圖說明

圖1A-圖1C展示了CTCs的分離和表征。圖1A描繪了CTC-iChip負IFD系統(tǒng)的示意圖。圖1B描繪了正常小鼠和癌癥小鼠模型之間的小鼠WBC耗竭(depletion)的一致性的圖。WBC耗竭以log10示出。圖1C描繪了借助免疫熒光染色(CK+/CD45-/DAPI+)從正常小鼠和KPC小鼠計算的CTC的圖表。

圖2描繪了單細胞樣本的主成分分析的示意圖。

圖3A-3B展示了上皮、間充質(zhì)和干細胞基因在CTC-c細胞vs腫瘤中的差異化表達。描繪了在CTC-c細胞vs腫瘤中下調(diào)(圖3A)和上調(diào)(圖3B)的基因的箱形圖。條＝中位值，箱形線＝四分位數(shù)，標度以log10(rpm)計。

圖4A-圖4C展示了CTC-iChip表征。圖4A描繪了偏轉(zhuǎn)的WBC的百分數(shù)(y軸)作為每WBC的抗-CD45珠的數(shù)量(x軸)的函數(shù)的圖表。圖4B描繪了加入正常的小鼠血液中的小鼠PDAC細胞系NB508的回收的圖(示出4個獨立實驗)。圖4C描繪了來自使用NB508細胞系的同基因型(syngeneic)正位PDAC腫瘤的所捕獲的CTCs/mL血液的圖。

圖5A描繪了KPC小鼠的基因型和表征的表。圖5B描繪了細胞系(NB508、MEF)、CTCs、WBC和來自匹配的原發(fā)腫瘤的經(jīng)稀釋的塊狀RNA(bulk RNA)的總的特有的比對(alignment)，以及具有經(jīng)比對的讀數(shù)的百分比(％)的單細胞測序的質(zhì)量度量學的圖表。圖5C描繪了使用單細胞原發(fā)腫瘤(TuGMP3)、癌細胞系(NB508)和全部的CTCs(簇1、3、4、5和9)之間的以及各簇(右側(cè))的平均的簇內(nèi)相關(guān)系數(shù)的單細胞異質(zhì)性的圖表。圓圈＝平均值，范圍＝95％CI。

圖6描繪了與塊狀原發(fā)腫瘤(bulk primary tumors)和單細胞原發(fā)腫瘤相比，CTC-c中富集的ECM蛋白基因的箱形圖。條＝中位數(shù)，箱形線-四分位數(shù)，標度以log10(rpm)計。

圖7描繪了來自3個患者的人胰腺CTCs表達譜熱圖。利用上皮基因定義CTCs，并示出富集的胞外蛋白。以log10標度示出表達。

圖8描繪了人胰腺癌細胞系中的SPARC表達的定量RT-PCR的圖表。

圖9描繪了侵襲測定法。觀察到具有針對SPARC的shRNA(ShF1和ShF3)的PDAC2和PDAC3細胞系侵襲穿過基底膠(Matrigel)減少。shNT＝非靶標shRNA。

圖10描繪了通過非靶標shRNA(NT)和SPARC shRNA(SHF1)的體內(nèi)熒光素酶成像而具有可檢測轉(zhuǎn)移的小鼠的數(shù)量的圖表。

圖11描繪了確定CTC異質(zhì)性的過程的示意圖。

圖12A-圖12C展示了在原發(fā)腫瘤的上皮和間質(zhì)組分中發(fā)現(xiàn)的CTC富集的基因。描繪的是Aldh1a2干細胞(圖12A)和CTC高度富集的基因Klf4(圖12B)和Igfbp5基因(圖12C)的表達箱形圖。條＝中位數(shù)，箱形線＝四分位數(shù)，標度以log10(rpm)計。

圖13展示了跨過不同的上皮癌的人和小鼠CTCs表達高水平的ECM蛋白基因。描繪了在人PDAC CTC、乳腺(br)CTC和前列腺(pr)CTC等中高度表達的ecm基因的表達箱形圖。條，中位數(shù)；箱形線，四分位數(shù)；標度以log10(rpm)計。經(jīng)holm校正的p值<0.05(*)、0.01(**)、0.001(***)。

圖14A-圖14E展示了人PDAC中的SPARC的表達增強了侵襲和轉(zhuǎn)移。圖14A描繪了通過MTT確定的PDAC3細胞系增殖的圖表。圖14B描繪了每43個視野中計數(shù)的PDAC3shNT vs shSPARC中的腫瘤球的圖表(誤差棒表示SD)。圖14C描繪了通過每203個視野的核的數(shù)目定量的shSPARC和shNT細胞系的侵襲的圖。p值<0.01(**)、0.001(***)、0.0001(****)。誤差棒表示SD。圖14D描繪了尾靜脈接種PDAC3細胞系3周后通過體內(nèi)熒光素酶成像而可檢測的肺轉(zhuǎn)移的百分數(shù)的圖。示出Fisher精確檢驗的p值。圖14E描繪了具有來自PDAC3細胞系的正位(orthotopic)胰腺腫瘤的小鼠中的歸一化的轉(zhuǎn)移負荷的圖表。誤差棒表示SD(*p<0.05)。

圖15描繪了胰腺CTCs在轉(zhuǎn)移級聯(lián)中的作用的簡要模型。示出了胰腺CTCs的異質(zhì)性子類，并關(guān)注最顯著的典型CTC群體，所述典型CTC群體被富集用于上皮(角蛋白)和間質(zhì)(Sparc)基因的共表達。

圖16A描繪了借助qRT-PCR的PDAC2shRNA細胞系的圖表。平均值隨著最大和最小RQ(誤差棒)示出。圖16B描繪了shNT和shSPARC穩(wěn)定品系之間的借助MTT測定法的在PDAC2細胞系方面類似的增殖率的圖表。圖16C描繪了shNT和shSPARC細胞系之間在2周時形成的腫瘤球侵襲測定(誤差棒＝STD)類似的圖表。在4×放大視野下進行定量(誤差棒＝SD)。通過在48小時時的侵襲測定法確定經(jīng)由shSPARC_1和3降低的遷移行為(圖16D)。

具體實施方式

如本文所述，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)的特征在于一些基因(即，CTC標記基因)的表達。這些CTC標記基因的發(fā)現(xiàn)使得能夠有用于對CTC水平(例如，來自受試者的樣本中的CTC水平)進行測量和/或檢測的方法和測定法。這些方法和測定法可提供在CTC水平的測量方面改進的速度和精確度。進而，由于這些標記基因的表達將CTCs與其它細胞相區(qū)別(例如，其它循環(huán)細胞和/或正常腫瘤細胞)，治療劑可通過結(jié)合至和/或抑制這些標記基因表達產(chǎn)物來降低CTCs的轉(zhuǎn)移潛力和/或水平，從而被靶向針對CTCs。

本文所使用的“循環(huán)腫瘤細胞”或“CTC”是指從腫瘤脫落并在血液中(即在循環(huán)中)存在的腫瘤細胞?？捎糜趶难旱钠渌煞种凶R別和/或分離CTCs的細胞標記(例如標記基因)在下文中加以描述。在一些實施方式中，CTC可為胰腺癌CTC。

在一個方面，本文所述的為檢測樣本中的循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)的方法，所述方法包括：測量樣本中的CTC標記基因的表達產(chǎn)物水平；以及如果檢測到的所述標記基因表達產(chǎn)物的水平高于參比水平，則確定存在CTCs。

如本文所述，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在CTCs中大量基因被差異化地調(diào)控(例如，與非循環(huán)腫瘤細胞相比)。因此，本文提供的方法和測定法涉及CTC水平的測定。升高的CTC水平可表明不良預(yù)后，例如升高的轉(zhuǎn)移風險。因此，本文所提供的是涉及患有癌癥的受試者的治療、預(yù)后和風險評價的方法和測定法。在一些實施方式中，方法和測定法涉及對受試者的生物樣本中的基因產(chǎn)物(例如蛋白和/或基因轉(zhuǎn)錄物如mRNA)的表達水平進行確定和/或測量。在一些實施方式中，測定法和方法涉及確定受試者的生物樣本中的至少兩種基因的基因產(chǎn)物的表達水平(即，選自如本文所述的表7、表8和/或表14的至少2種基因、至少3種基因、至少4種基因、至少5種基因、至少6種基因、至少7種基因、至少8種基因、至少9種基因、至少10種基因…至少15種基因…至少25種基因…至少30種基因或更多基因，或任意數(shù)量的基因)。

在一些實施方式中，所述標記基因選自于由如下所組成的組：ABI3BP；ADAMTS5；ADAMTSL1；ANG；ARSA；C1RL；C3；C4A；C4B；CCDC80；CD109；CHI3L1；CLEC3B；CMTM3；CMTM7；COL14A1；COL1A2；COL3A1；COL4A6；CSF1；DAG1；DCN；DMKN；FBLN1；FGF1；FMOD；GPC3；GPC4；HMGB1；IFNAR2；IGFBP5；IL16；LAMA4；LTBP4；MFAP1A；NID2；OGN；PDAP1；PF4；PLAT；PODN；PRELP；RSPO1；SERPING1；SLURP1；SOD3；SPARC；SPOCK2；SPON2；SULF1；SULF2；TGFB2；TGM2；THBD；THBS1；THSD4；TIMP2；TNXB；TPT1；TWSG1和WNT4。在一些實施方式中，本文所述的測定法、方法和系統(tǒng)涉及確定受試者的生物樣本中的至少兩種基因的基因產(chǎn)物的表達水平，例如至少2種基因、或至少3種基因、或至少4種基因、或例如如下的全部基因：ABI3BP；ADAMTS5；ADAMTSL1；ANG；ARSA；C1RL；C3；C4A；C4B；CCDC80；CD109；CHI3L1；CLEC3B；CMTM3；CMTM7；COL14A1；COL1A2；COL3A1；COL4A6；CSF1；DAG1；DCN；DMKN；FBLN1；FGF1；FMOD；GPC3；GPC4；HMGB1；IFNAR2；IGFBP5；IL16；LAMA4；LTBP4；MFAP1A；NID2；OGN；PDAP1；PF4；PLAT；PODN；PRELP；RSPO1；SERPING1；SLURP1；SOD3；SPARC；SPOCK2；SPON2；SULF1；SULF2；TGFB2；TGM2；THBD；THBS1；THSD4；TIMP2；TNXB；TPT1；TWSG1和WNT4。

在一些實施方式中，所述標記基因選自于由如下所組成的組：ALDH1A1；ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；DCN；SPARC；WNT；TGFB2；VEGF；COL1A2；COL3A1和TIMP2。在一些實施方式中，本文所述的測定法、方法和系統(tǒng)涉及確定受試者的生物樣本中的至少兩種基因的基因產(chǎn)物的表達水平，例如至少2種基因、或至少3種基因、或至少4種基因、或例如如下的全部基因：ALDH1A1；ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；DCN；SPARC；WNT；TGFB2；VEGF；COL1A2；COL3A1和TIMP2。

在一些實施方式中，所述標記基因選自于由如下所組成的組：ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；DCN和SPARC。在一些實施方式中，本文所述的測定法、方法和系統(tǒng)涉及確定受試者的生物樣本中的至少兩種基因的基因產(chǎn)物的表達水平，例如至少2種基因、或至少3種基因、或至少4種基因、或例如如下的全部基因：ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；DCN和SPARC。

在一些實施方式中，所述標記基因選自于由如下所組成的組：ALDH1A2；IGFBP5；KLF4和DCN。在一些實施方式中，本文所述的測定法、方法和系統(tǒng)涉及確定受試者的生物樣本中的至少兩種基因的基因產(chǎn)物的表達水平，例如至少2種基因、或至少3種基因、或例如如下的全部基因：ALDH1A2；IGFBP5；KLF4和DCN。

在一些實施方式中，所述標記基因選自于由如下所組成的組：TPT1；HMGB1；SPON 2；SPARC和ARSA。在一些實施方式中，本文所述的測定法、方法和系統(tǒng)涉及確定受試者的生物樣本中的至種兩個基因的基因產(chǎn)物的表達水平，例如至少2種基因、或至少3種基因、或至少4種基因、或例如如下的全部基因：TPT1；HMGB1；SPON 2；SPARC和ARSA。

在一些實施方式中，所述標記基因選自于由如下所組成的組：IL6ST；ARSA；TIMP2；CD55；SULF2；ITGA6；SDC4；CDON和SV2A。在一些實施方式中，本文所述的測定法、方法和系統(tǒng)涉及確定受試者的生物樣本中的至少兩種基因的基因產(chǎn)物的表達水平，例如至少2種基因、或至少3種基因、或至少4種基因、或至少5種基因、或至少6種基因、或至少7種基因、或至少8種基因、或例如如下的全部基因：IL6ST；ARSA；TIMP2；CD55；SULF2；ITGA6；SDC4；CDON和SV2A。在一些實施方式中，如本文所述，例如由于細胞表面蛋白的RNA水平低于多肽水平，對選自于由如下所組成的組中的標記基因的多肽表達產(chǎn)物的水平進行確定：IL6ST；ARSA；TIMP2；CD55；SULF2；ITGA6；SDC4；CDON和SV2A。

表7：示例性的小鼠標記基因

表8：示例性的人類標記基因

表7和表8中列出的基因名稱為慣用名稱。表7或表8中列出的各基因的NCBI基因ID號可通過使用慣用名稱作為查詢物檢索NCBI“基因”數(shù)據(jù)庫(可在萬維網(wǎng)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/上得到)并選擇首個返回的智人(Homo sapiens)基因(對于表8中的基因)或小鼠(Mus musculus)基因(對于表7中的基因)而獲得?？墒褂肬CSC基因組瀏覽器(可在萬維網(wǎng)http://genome.ucsc.edu上得到)的基因分選器功能獲得其它基因。可易于識別小鼠基因的人類同源物，例如在NCBI數(shù)據(jù)庫或通過查詢數(shù)據(jù)庫(例如BLAST)識別的同源物。在一些實施方式中，標記基因選自表7、表8或表14中列出的基因。

在CTC中，表7、表8或表14中列出的標記基因可被上調(diào)，例如，對于表7、表8或表14中列出的標記基因而言，如果與標記基因表達的參比水平相比，在細胞或樣本中測得的標記基因表達較高，則所述細胞被識別為CTC和/或樣品被識別為包含CTCs。優(yōu)選地，一度關(guān)注的是統(tǒng)計學上顯著的改變。然而，即便組中的少數(shù)基因并未與正常的不同，如果組的整體改變表現(xiàn)為顯著的改變、優(yōu)選統(tǒng)計學上顯著的改變，則樣本可被識別為包含CTCs。在本文考慮之列的是兩種以上的所指出的標記的全部可能組合。

表7、表8或表14中的標記基因的基因表達產(chǎn)物水平比起所述標記基因的參比水平更高，比起參比量更高至少約10％、至少約20％、至少約30％、至少約40％、至少約50％、至少約80％、至少約100％、至少約200％、至少約300％、至少約500％或至少約1000％或更多，則指示存在CTC。

在一些實施方式中，參比可為在不為CTCs的細胞群體或細胞中的標記基因產(chǎn)物的表達水平，例如非循環(huán)腫瘤細胞和/或不為癌細胞的循環(huán)細胞中的平均水平。在一些實施方式中，參比也可為對照樣本、對照個體的匯集樣本中的標記基因產(chǎn)物的表達水平，或者具有相同基礎(chǔ)的數(shù)值或數(shù)值范圍。

在一些實施方式中，本文所述的方法和測定法包括：(a)將基因表達產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為可檢測的基因靶標；(b)測量所述可檢測的基因靶標的量；以及(c)將可檢測的基因靶標的量與參比的量進行對比，如果所述可檢測基因靶標的量與所述參比水平的量具有統(tǒng)計學上顯著的差別，則確定CTCs的存在和/或水平。在一些實施方式中，如果所述可檢測基因靶標的量與所述參比水平的量相比不存在統(tǒng)計學上顯著的差別，所述樣本被識別為不包含CTCs。

本文中所使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化”(transforming或transformation)是指將對象或物質(zhì)(例如，生物樣本、核酸或蛋白)轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪晃镔|(zhì)。該轉(zhuǎn)化可以是物理的、生物的或化學的。示例性的物理轉(zhuǎn)化包括但不限于：生物樣本的預(yù)處理，例如，通過差速離心從全血轉(zhuǎn)化為血清。生物/化學轉(zhuǎn)化可以涉及反應(yīng)中的至少一種酶和/或化學試劑。例如，DNA樣本可以通過一種或多種限制性酶消化成為片段、或可以用連接酶將外源性分子連接至片段化的DNA樣本。在一些實施方式中，DNA樣本可以通過例如聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)進行酶促復制。

用于測量與本文所述的標記基因相關(guān)的基因表達產(chǎn)物的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。此類用于測量基因表達產(chǎn)物(例如蛋白水平)的方法包括ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定法)、western印跡、FACS、放射性免疫測定法(RIA)；夾心測定法；熒光原位雜交(FISH)；免疫組織學染色；免疫電泳；使用檢測試劑(例如抗體或蛋白結(jié)合試劑)的免疫熒光以及免疫沉淀?；蛘撸梢酝ㄟ^向受試者中引入經(jīng)標記的抗肽抗體和其它類型的檢測試劑來測定受試者中的肽。例如，抗體可用放射性標記物標記，受試者中的放射性標記物的存在和位置通過標準的成像技術(shù)檢測。

例如，用于本文所述的標記基因的多肽表達產(chǎn)物的抗體是可商購得到的并可用于本發(fā)明的目的以測量蛋白表達水平，例如抗IGFBP5(Cat.No.4255；Abcam；Cambridge，MA)?；蛘?，由于用于本文所述的標記基因的氨基酸序列已知并在NCBI網(wǎng)站上公開可得，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以針對用于本發(fā)明目的的感興趣的這些蛋白產(chǎn)生它們特有的抗體。本文所述的標記基因的氨基酸序列對于不同的物種(例如人、小鼠和大鼠)分配有NCBI登記號。

在一些實施方式中，可以使用免疫組織化學(“IHC”)和免疫細胞化學(“ICC”)技術(shù)。IHC是將免疫化學應(yīng)用于組織切片；而ICC是將免疫化學應(yīng)用于經(jīng)過特定的細胞學制劑(例如基于液體的制劑)處理之后的細胞或組織印記。免疫化學是基于抗體的使用的技術(shù)家族，其中，抗體被用于特異性靶向胞內(nèi)分子或細胞表面的分子?？贵w通常包含標記物，標記物將進行生化反應(yīng)，從而在遇到靶向分子時經(jīng)歷顏色改變。在一些實例中，信號放大可以被整合到特定的方案中，其中，在使用特異性的一抗之后使用包含標記物染色或標記物信號的二抗。

在一些實施方式中，所述測定法可以是Western印跡分析。或者，可以通過二維凝膠電泳系統(tǒng)將蛋白分離。二維凝膠電泳在本領(lǐng)域中是公知的，通常涉及沿第一維度的等電聚焦以及隨后的沿第二維度的SDS-PAGE電泳。這些方法也需要相當大量的細胞材料。2D SDS-PAGE凝膠的分析可以通過確定凝膠上的蛋白斑的強度進行、或可采用免疫測定進行。在其它實施方式中，可以借助質(zhì)譜分析蛋白樣本。

免疫學測試可以與本文所述的方法和測定法一起使用，并且所述免疫學測試包括例如使用下述技術(shù)的競爭性和非競爭性檢測系統(tǒng)，例如：Western印跡、放射性免疫測定法(RIA)、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定法)、“夾心”免疫測定法、免疫沉淀測定法、免疫擴散測定法、凝集測定法如乳膠凝集、補體結(jié)合測定法、免疫放射測定法、熒光免疫測定法如FIA(熒光偶聯(lián)免疫測定法)、化學發(fā)光免疫測定法(CLIA)、電化學發(fā)光免疫測定法(ECLIA)、計數(shù)免疫測定法(CIA)、側(cè)流測試或側(cè)流免疫測定法(LFIA)、磁性免疫測定法(MIA)和蛋白A免疫測定法。只要能夠得到合適的抗體試劑，在本領(lǐng)域中已知用于實施此類測定法的方法。在一些實施方式中，免疫測定法可以是定量免疫測定法或半定量免疫測定法。

免疫測定法是生化測試，利用抗體或抗體與其抗原的相互作用來測量生物樣本(通常是流體樣本例如血清)中的物質(zhì)的濃度。該測定法利用抗體與其抗原的高度特異性結(jié)合。對于本文所述的方法和測定法，在免疫測定法中發(fā)生靶多肽與本文所述的各自的蛋白或蛋白片段、分離的肽或融合蛋白的特異性結(jié)合，從而形成靶蛋白/肽復合物。然后，通過本領(lǐng)域已知的各種方法測定復合物。免疫測定法還經(jīng)常涉及檢測抗體的使用。

酶聯(lián)免疫吸附測定法也稱為ELISA、酶免疫測定法或EIA，是主要在免疫學中用來檢測樣本中的抗體或抗原的存在的生化技術(shù)。ELISA已在醫(yī)學和植物病理學中用作診斷工具，并在各種行業(yè)中用于質(zhì)量控制檢查。

在一個實施方式中，還可進行涉及對于特定的期望抗原(即，本文所述的標記基因多肽)而言特異性的至少一種抗體的ELISA。將已知量的樣本和/或抗原固定在固體支持物(通常是聚苯乙烯微滴定板)上。固定化可以是非特異性的(例如，通過吸附至表面)或特異性的(例如，其中利用固定在表面上的另一抗體來捕獲抗原或一抗)。當抗原被固定后，加入檢測抗體，與抗原形成復合物。檢測抗體可與酶共價連接、或者檢測抗體自身可以通過由生物綴合連接到酶的二抗來檢測。在各步驟之間，滴定板通常用溫和的洗滌劑溶液洗滌，以移除非特定結(jié)合的任何蛋白或抗體。在最后的洗滌步驟之后，通過添加酶底物以產(chǎn)生可見的信號對滴定板進行顯影，表明樣本中的抗原的量。老法ELISA(Older ELISAs)利用發(fā)色底物，然而較新的測定法采用具有更高靈敏度的熒光底物。

在另一實施方式中，使用競爭性ELISA。將針對靶多肽或其片段的純化的抗體包被在多孔板的固相上，即綴合至固體表面。還需要不綴合于任何固體支持物上的第二批純化抗體。這些非綴合的純化抗體被標記用于測定目的，例如，用辣根過氧化物酶標記以產(chǎn)生可檢測的信號。將來自受試者的樣本(例如腫瘤、血液、血清或尿液)與已知量的期望抗原(例如含有靶多肽的已知體積或濃度的樣本)以及辣根過氧化物酶標記的抗體混合，然后將混合物加入到經(jīng)包被的孔中以形成競爭性結(jié)合。孵育后，如果樣本中的多肽水平高，將形成經(jīng)標記的抗體試劑-抗原的復合物。這一復合物在溶液中是游離的，可被洗滌掉。洗滌孔將會移除復合物。然后將孔用TMB(3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺)顯色底物孵育，用于定位孔中的辣根過氧化物酶綴合的抗體。如果樣本中的靶多肽水平高，將不存在顏色變化或幾乎不存在顏色變化。如果樣本中幾乎沒有靶多肽存在或沒有靶多肽存在，形成不同的復合物，固體支持物的復合物結(jié)合抗體試劑-靶多肽。這一復合物被固定在板上，且在洗滌步驟中不會被洗滌掉。隨后用TMB孵育將會產(chǎn)生一些顏色變化。此類競爭性ELISA測試是特異性的、敏感的、可再現(xiàn)的和易于操作的。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的是，存在其它的不同形式的ELISA。本領(lǐng)域中已知的ELISA標準技術(shù)在“Methods in Immunodiagnosis”，第2版，Rose和Bigazzi編，John Wiley&Sons，1980；以及Oellerich，M.，1984，J.Clin.Chem.Clin.Biochem.22:895-904中描述。由此以引用的方式將這些參考文獻整體并入本文。

在一個實施方式中，可以通過側(cè)流免疫測定法測試(LFIA)對樣本中的多肽的水平進行檢測，所述側(cè)流免疫測定法測試也被稱為免疫層析測定法或條帶測試。LFIA是旨在檢測流體樣本中的抗原(例如多肽)的存在(或不存在)的簡單的裝置。目前有許多LFIA測試被用于醫(yī)療診斷，其目的在于家庭測試、即時檢驗或?qū)嶒炇覒?yīng)用。LFIA測試是免疫測定法的一種形式，其中，測試樣本借助毛細作用流經(jīng)固體底物。在將樣本施加至測試條帶之后，樣本遇見結(jié)合至微粒的有色試劑(通常包含對于測試靶抗原而言特異性的抗體)，該有色試劑與樣本混合并且轉(zhuǎn)移至用另一抗體或抗原預(yù)處理的底物相遇線或區(qū)帶。根據(jù)存在于樣本中的靶多肽的水平，有色試劑可以被捕獲，并在測試線或區(qū)帶處結(jié)合。LFIA本質(zhì)上是適合于沿單軸操作以適應(yīng)測試條帶形式或浸量條帶(dipstick)形式的免疫檢測。條帶測試是極其多用途的，并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易地進行修飾以用于測定來自流體樣本(如尿液、血液、水)和/或均質(zhì)化腫瘤樣本等的大范圍的抗原。條帶測試也被稱為浸量條帶測試，其名稱來自于將測試條帶“浸漬”入待測試的流體樣本的字面作用。LFIA條帶測試很容易使用，需要最少的培訓，并可以容易地被包括作為待用于現(xiàn)場實地的即時檢驗(point-of-care test，POCT)診斷的組分。LFIA測試可作為競爭性或夾心測定法進行操作。夾心LFIA類似于夾心ELISA。樣本首先接觸用針對靶抗原產(chǎn)生的抗體標記的有色顆粒。測試線還將含有針對相同靶點的抗體，雖然它可以結(jié)合至抗原上的不同表位。在陽性樣本中，測試線將顯示為有色帶。在一些實施方式中，側(cè)流免疫測定法可以是雙抗體夾心測定法、競爭性測定法、定量測定法或它們的變型。競爭性LFIA類似于競爭性ELISA。樣本首先接觸用靶抗原或類似物標記的有色顆粒。測試線包含針對靶點/其類似物的抗體。樣本中的未標記的抗原將會阻斷抗體上的結(jié)合位點，防止吸收有色顆粒。在陰性樣本中，測試線將顯示為有色帶。存在大量側(cè)流技術(shù)的變型。也可以利用多個捕獲區(qū)以創(chuàng)建多元測試。

“浸量條帶”或LFIA測試條帶和其它固體支持物的使用已在本領(lǐng)域中大量抗原生物標記物的免疫測定法的上下文中描述。美國專利號4,943,522、6,485,982、6,187,598、5,770,460、5,622,871、6,565,808；美國專利申請系列號10/278,676、美國專利申請系列號09/579,673和美國專利申請系列號10/717,082(以引用的方式將其整體并入本文)是此類側(cè)流測試裝置的非限制性實例。描述使用“浸量條帶”技術(shù)以通過免疫化學測定法檢測可溶性抗原的專利的實例包括但不限于美國專利號4,444,880、4,305,924和4,135,884，以引用的方式將其整體并入本文。這三項專利的設(shè)備和方法大體上描述了：在測定條帶上的成分-抗原復合物之前，將第一成分固定至“浸量條帶”上的固體表面，所述“浸量條帶”暴露至含有可溶性抗原的溶液，所述可溶性抗原結(jié)合固定在“浸量條帶”上的成分。對于對這一“浸量條帶”技術(shù)進行修飾用于利用本文所述的抗體試劑測定多肽的教導是在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)范圍之內(nèi)。

其它技術(shù)可用于檢測樣本中的多肽的水平。此類技術(shù)中的一種是斑點印跡法，所述斑點印跡法為Western印跡的改編版(Towbin等，Proc.Nat.Acad.Sci.76:4350(1979))。在Western印跡中，多肽或其片段可用洗滌劑和加熱進行解離，并在被轉(zhuǎn)移到固體支持物(如硝酸纖維素膜或PVDF膜)之前在SDS-PAGE凝膠上進行分離。用對靶多肽或其片段具有特異性的抗體試劑孵育該膜。然后，將膜進行洗滌，以移除未結(jié)合的蛋白和具有非特異性結(jié)合的蛋白。然后，可檢測的經(jīng)標記的酶聯(lián)二抗或檢測抗體可被用于檢測和評價所測試的樣本中的多肽的量。來自可檢測標簽的信號強度對應(yīng)于所存在的酶的量，并因此對應(yīng)于多肽的量。可以例如通過光密度法對所述水平進行量化。

流式細胞術(shù)是用于分析和分選懸浮在流體流中的細胞(或其它小顆粒)的公知技術(shù)。該技術(shù)使得能夠?qū)α鹘?jīng)光學、電子或磁檢測裝置的單細胞的物理和/或化學特征同時進行分析。用于FACS時，流式細胞儀由流動池組成，所述流動池運輸流體流中的細胞，使其單行通過激發(fā)經(jīng)熒光標記的檢測標記物(例如抗體試劑)的光源，并測量細胞的熒光特征。隨后，將流體流噴射穿過噴嘴和充電環(huán)(charging ring)，在壓力下將流體破碎為液滴。對流動池裝置和流體流進行校準，使得單個細胞或細胞結(jié)合組之間存在相對大的間距，從而使得任何液滴包含多于一個單細胞或細胞結(jié)合組的概率小。充電環(huán)基于液滴中包含的細胞的熒光特征對液滴充電。隨后通過靜電充電偏轉(zhuǎn)系統(tǒng)(electrostatically-charged deflection system)將帶電液滴偏轉(zhuǎn)，所述靜電充電偏轉(zhuǎn)系統(tǒng)基于液滴的電荷(與細胞的熒光強度相關(guān))將液滴轉(zhuǎn)移至多個容器中。FACS系統(tǒng)(例如FACSARIA^TM流式細胞儀(BD Biosciences)和FLOWJO^TM7.6.4版本(TreeStar))能夠檢測并記錄總細胞數(shù)以及展示出一種或多種熒光特征的細胞的數(shù)量，例如被一種或多種對于CTC標記基因而言特異性的抗體試劑結(jié)合的細胞的總數(shù)。

在一些實施方式中，可替代性地通過確定與本文所述的標記基因相關(guān)的基因的信使RNA(mRNA)的表達水平來確定本文所述的基因表達產(chǎn)物。此類分子可以從生物樣本(如腫瘤活檢物)中分離、衍生或擴增。mRNA表達的檢測對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，并且包括例如但不限于：PCR程序、RT-PCR、定量PCR或RT-PCR、Northern印跡分析、差異基因表達、RNA保護測定法、微陣列分析、雜交方法、下一代測序等。下一代測序技術(shù)的非限制性的實例可以包括：Ion Torrent、Illumina、SOLiD、454；大規(guī)模平行簽名測序固相、可逆性染色-終止子測序；以及DNA納米球測序。

通常，PCR程序描述了基因擴增的方法，所述方法包括：(i)引物與核酸樣本或文庫內(nèi)的特定基因或序列進行序列特異性雜交；(ii)后續(xù)擴增，涉及使用耐熱DNA聚合酶進行的退火、延伸和變性的多個循環(huán)；以及(iii)篩查對于具有正確大小的帶而言的PCR產(chǎn)物。所使用的引物是寡核苷酸，所述寡核苷酸具有足夠的長度和適當?shù)男蛄幸蕴峁┚酆献饔玫钠鹗?，即各引物是專門設(shè)計為互補于待擴增的基因組基因座的鏈。在替代的實施方式中，本文所述的基因表達產(chǎn)物的mRNA水平可以通過逆轉(zhuǎn)錄(RT)PCR以及通過定量RT-PCR(QRT-PCR)或?qū)崟rPCR方法加以確定。RT-PCR和QRT-PCR的方法在本領(lǐng)域中是公知的。本文所述的標記基因的核酸序列對于不同的物種(例如人、小鼠和大鼠)分配有NCBI登記號。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以基于已知序列設(shè)計合適的引物以確定相應(yīng)基因的mRNA水平。

可以使用本領(lǐng)域所公知的大量程序中的任何一個從特定的生物學樣本中分離核酸和核糖核酸(RNA)分子，所選擇的特定的分離程序適合于特定的生物學樣本。例如，凍融和堿裂解程序可以用于從固體材料中獲得核酸分子；加熱和堿裂解程序可用于從尿中獲得核酸分子；以及蛋白酶K提取可以用來從血液中獲得核酸(Roiff，A等，PCR:Clinical Diagnostics and Research，Springer(1994))。

通常，PCR程序描述了基因擴增的方法，所述方法包括：(i)引物與核酸樣本或文庫內(nèi)的特定基因進行序列特異性雜交；(ii)后續(xù)擴增，涉及使用DNA聚合酶進行的退火、延伸和變性的多個循環(huán)；以及(iii)篩查對于具有正確大小的帶而言的PCR產(chǎn)物。所使用的引物是寡核苷酸，所述寡核苷酸具有足夠的長度和適當?shù)男蛄幸蕴峁┚酆献饔玫钠鹗?，即各引物是專門設(shè)計為互補于待擴增的核酸分子的各條鏈。

在另一實施方式中，本文所述的基因表達產(chǎn)物的mRNA水平可以通過逆轉(zhuǎn)錄(RT)PCR、以及通過定量RT-PCR(QRT-PCR)或?qū)崟rPCR方法加以確定。RT-PCR和QRT-PCR的方法在本領(lǐng)域中是公知的。

在一些實施方式中，本文所述的一種或多種試劑(例如，抗體試劑和/或核酸探針)可包括可檢測的標記物和/或包括產(chǎn)生可檢測信號的能力(例如，通過催化反應(yīng)將化合物轉(zhuǎn)化為可檢測的產(chǎn)物)?？蓹z測標記物可以包括例如：吸光染料、熒光染料或放射性標記物?？蓹z測標記物、檢測可檢測標記物的方法以及將可檢測標記物納入試劑(例如，抗體和核酸探針)中的方法在本領(lǐng)域中是公知的。

在一些實施方式中，可檢測標記物可以包括可通過如下測定的標記物：光譜手段；光化學手段；生物化學手段；免疫化學手段；電磁手段；放射化學手段；或化學手段，例如熒光手段、化學熒光手段、或化學發(fā)光手段、或任何其它適當?shù)氖侄?。本文所述的方法中使用的可檢測標記物可以是一級標記物(其中，標記物包含可被直接測定的部分或產(chǎn)生可被直接測定部分的部分)或二級標記物(其中，可檢測標記物結(jié)合至另一部分以產(chǎn)生可測定的信號，例如，如同在免疫標記中使用二抗和三抗一樣常見)。可檢測標記物可通過共價或非共價的手段連接至試劑?；蛘?，可檢測標記物可以例如通過直接標記如下分子而得以偶聯(lián)，該分子通過配體-受體結(jié)合對布置(ligand-receptor binding pair arrangement)或其它的此類特異性識別分子來實現(xiàn)與試劑結(jié)合?？蓹z測標記物可以包括但不限于：放射性同位素、生物發(fā)光化合物、發(fā)色團、抗體、化學發(fā)光化合物、熒光化合物、金屬螯合物和酶。

在其它實施方式中，將檢測試劑用熒光化合物進行標記。當熒光標記的抗體暴露至具有適當波長的光時，由于熒光，熒光標記抗體的存在可以被檢測。在一些實施方式中，可測定的標記物可以是熒光染料分子或熒光團，包括但不限于：熒光素、藻紅蛋白、藻藍蛋白、鄰苯二醛、熒光胺、Cy3^TM、Cy5^TM、別藻藍蛋白(allophycocyanine)、德克薩斯紅、peridenin葉綠素、青色素、串聯(lián)綴合物如藻紅蛋白-Cy5^TM、綠色熒光蛋白、羅丹明、異硫氰酸熒光素(FITC)和Oregon Green^TM、羅丹明及衍生物(例如，德克薩斯紅和四羅丹明異硫氰酸酯(tetrarhodimine isothiocynate，TRITC))、生物素、藻紅蛋白、AMCA、CyDyes^TM、6-羧基熒光素(6-carboxyfhiorescein；通?？s寫為FAM和F)、6-羧基-2’,4’,7’,4,7-六氯熒光素(6-carboxy-2’,4’,7’,4,7-hexachlorofiuorescein，HEX)、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基熒光素(JOE或J)、N,N,N’,N’-四甲基-6羧基羅丹明(TAMRA或T)、6-羧基-X-羅丹明(ROX或R)、5-羧基羅丹明-6G(R6G5或G5)、6-羧基羅丹明-6G(R6G6或G6)和羅丹明110；青色素染料，例如Cy3、Cy5和Cy7染料；香豆素，例如傘形酮；苯甲亞胺染料，例如Hoechst 33258；菲啶染料，例如德克薩斯紅；乙錠染料；吖啶染料；咔唑染料；吩噁嗪染料；卟啉染料；聚甲炔染料，例如青色素染料如Cy3、Cy5等；BODIPY染料和喹啉染料。在一些實施方式中，可測定標記物可以是放射性標記物，包括但不限于：³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C、³²P和³³P。在一些實施方式中，可檢測標記物可以是酶，包括但不限于：辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶。酶標記物可以產(chǎn)生例如化學發(fā)光信號、有色信號或熒光信號。考慮用于可檢測地標記物抗體試劑的酶包括但不限于：蘋果酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、δ-V-類固醇異構(gòu)酶、酵母醇脫氫酶、α-磷酸甘油脫氫酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、過氧化氫酶、葡萄糖-VI-磷酸脫氫酶、葡萄糖淀粉酶和乙酰膽堿酯酶。在一些實施方式中，可檢測標記物是化學發(fā)光標記物，包括但不限于：光澤精、魯米諾、熒光素、異魯米諾、theromatic吖啶酯、咪唑、吖啶鹽和草酸酯。在一些實施方式中，可測定標記物可以是光譜比色標記物，包括但不限于：膠體金或者有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯和乳膠)珠。

在一些實施方式中，檢測試劑還可用可檢測標簽(例如c-Myc、HA、VSV-G、HSV、FLAG、V5、HIS或生物素)進行標記。還可使用其它的檢測系統(tǒng)，例如，生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)。在這一系統(tǒng)中，與感興趣的生物標記具有免疫反應(yīng)性(即，特異性)的抗體是生物素化的。結(jié)合至生物標記的生物素化抗體的量使用鏈霉親和素-過氧化物酶綴合物和顯色底物加以確定。此類鏈霉親和素過氧化物酶檢測試劑盒是可商購得到的，例如，來自DAKO，Carpinteria，CA。試劑還可以使用熒光發(fā)射金屬(例如¹⁵²Eu或鑭系的其它金屬)進行可檢測地標記?？梢允褂媒饘衮匣鶊F將此類金屬連接至試劑，所述金屬螯合基團如二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。

在本文所述的任何方面的一些實施方式中，可以同時確定(例如，多重檢測)或平行確定多于一個基因的表達產(chǎn)物的水平。在一些實施方式中，確定不超過200個其它基因的表達產(chǎn)物的水平。在一些實施方式中，確定不超過100個其它基因的表達產(chǎn)物的水平。在一些實施方式中，確定不超過20個其它基因的表達產(chǎn)物的水平。在一些實施方式中，確定不超過10個其它基因的表達產(chǎn)物的水平。

本文所使用的術(shù)語“樣本”或“測試樣本”是指從生物有機體獲取或分離的樣本，例如來自受試者的腫瘤樣本。示例性的生物樣本包括但不限于：生物流體樣本、血清、血漿、尿液、唾液、腫瘤樣本、腫瘤活檢物和/或組織樣本等。該術(shù)語還包括上述樣本的混合物。術(shù)語“測試樣本”還包括未處理或經(jīng)預(yù)處理的(或經(jīng)預(yù)加工的)生物學樣本。在一些實施方式中，測試樣本可以包括來自受試者的細胞。在一些實施方式中，測試樣本可以是腫瘤細胞測試樣本，例如樣本可以包括癌細胞、來自腫瘤的細胞和/或腫瘤活檢物。在一些實施方式中，測試樣本可以是血液樣本。

測試樣本可通過從受試者中移除細胞樣本而獲得，但也可以通過使用先前分離的細胞(例如，在之前的時間點分離以及由同一人或另一人分離)來完成。此外，測試樣本可以是新鮮采集或以前采集的樣本。

在一些實施方式中，測試樣本可以是未經(jīng)處理的測試樣本。本文所使用的短語“未經(jīng)處理的測試樣本”是指如下測試樣本，所述測試樣本除了稀釋和/或懸浮在溶液中外沒有任何預(yù)先的樣本前處理。用于處理測試樣本的示例性的方法包括但不限于：離心、過濾、超聲、勻漿、加熱、冷凍、融解以及它們的組合。在一些實施方式中，測試樣本可以是冷凍的測試樣本，例如冷凍的組織。在采用本文所述的方法、測定法和系統(tǒng)之前，可將冷凍的樣本融解。融解后，冷凍的樣本可被離心，然后用于本文所述的方法、測定法和系統(tǒng)。在一些實施方式中，測試樣本是澄清的測試樣本，例如，通過離心和采集包含澄清的測試樣本的上清液。在一些實施方式中，測試樣本可以是預(yù)加工的測試樣本，例如，選自于由如下所組成的組中的處理所產(chǎn)生的上清液或濾液：離心、過濾、融解、純化以及它們的任意組合。在一些實施方式中，測試樣本可以用化學和/或生物試劑處理?；瘜W和/或生物試劑可用于在處理過程中保護和/或保持樣本的穩(wěn)定性，所述樣本包括其中的生物分子(例如，核酸和蛋白)。一種示例性的試劑是蛋白酶抑制劑，通常用于在加工過程中保護或保持蛋白的穩(wěn)定性。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知適合對用于確定本文所述的表達產(chǎn)物的水平所需要的生物學樣本進行預(yù)加工的方法和過程。

在一些實施方式中，本文所述的方法、測定法和系統(tǒng)可以進一步包括從受試者獲得測試樣本的步驟。在一些實施方式中，受試者可以是人類受試者。

在一些實施方式中，本文所述的方法和測定法可進一步包括如下步驟：在測量本文所述的一個或多個標記基因的表達產(chǎn)物的水平之前，從樣本中分離CTCs或潛在的CTCs。作為非限制性實例，可通過基于流體動力學的大小的分離和/或存在于血液樣本中的其它細胞類型的免疫耗竭(immunodepletetion)，從例如血液樣本中分離CTCs。本文實施例中描述的CTC-iChip結(jié)合了這兩種方式來分離CTCs。

具有高水平或至少可檢測水平的CTCs的受試者更可能得益于特異性地靶向CTCs的治療劑的治療。由此，本文提供了確定受試者是否有可能對CTC標記基因靶向治療劑的治療作出響應(yīng)的方法，所述方法包括：對存在于血液和/或癌間質(zhì)中的CTC標記基因表達產(chǎn)物的水平進行測量；以及如果與參比水平相比，所述表達產(chǎn)物的水平升高，則確定受試者有可能對所述治療作出響應(yīng)。CTC標記基因靶向治療劑在下文中討論。

在給予治療劑后的CTCs的水平降低可為受試者狀況改善(例如，癌癥的大小、生長和/或轉(zhuǎn)移潛力降低)的指征。由此，本文提供了監(jiān)測對受試者進行的治療的方法，所述方法包括：向有需要的受試者給予癌癥治療劑；對存在于血液和/或癌間質(zhì)中的CTC標記基因表達產(chǎn)物的水平進行測量；以及如果與參比水平相比，CTC標記基因表達產(chǎn)物的水平降低，則確定受試者作出響應(yīng)；如果與參比水平相比，CTC標記基因表達產(chǎn)物未降低，則確定受試者不對所述治療作出響應(yīng)。在一些實施方式中，所述治療劑為化學治療劑、外科手術(shù)治療劑(surgical therapy)和/或放射治療劑。在一些實施方式中，所述治療劑為CTC標記基因靶向治療劑。在一些實施方式中，所述參比水平為在給予步驟之前的患者中的基因表達產(chǎn)物的水平。

本文所述的CTC標記基因可被直接靶向和/或用于物理靶向化療劑，從而降低CTCs的水平和/或致病活性(例如轉(zhuǎn)移活性)。由此，本文所述的為對受試者中的癌癥進行治療的方法，所述方法包括向受試者給予治療有效量的CTC標記基因靶向治療劑。在一些實施方式中，所述受試者為被確定具有升高水平的存在于血液和/或癌間質(zhì)中的CTC標記基因和/或升高水平的CTCs的受試者。

在一些實施方式中，CTC標記基因靶向治療劑可包括CTC標記基因的抑制劑，例如CTC標記基因靶向治療劑可抑制CTC標記基因的水平和/或活性。本文使用的術(shù)語“抑制劑”指的是能夠?qū)⑺邢虻谋磉_產(chǎn)物(例如編碼靶標的mRNA或靶多肽)的表達和/或活性降低例如至少10％以上(例如10％以上、50％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上或98％以上)的試劑。可通過例如測量CTC標記基因的活性和/或表達產(chǎn)物的水平，對CTC標記基因的抑制劑的效力(例如其降低CTC標記基因的水平和/或活性的能力)加以確定。用于測量給定的mRNA和/或多肽的水平的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉，例如可利用RT-PCR用引物確定RNA水平，可利用Western印跡用抗體確定多肽水平?？赏ㄟ^例如使用本領(lǐng)域所知曉和本文其它部分描述的方法對CTCs的存活率和/或水平進行測量，來確定例如CTC標記基因的活性。在一些實施方式中，CTC標記基因的抑制劑可為抑制性核酸、適體、抗體試劑、抗體或小分子。

在一些實施方式中，CTC標記基因的抑制劑可為抗體試劑。無論是衍生自天然產(chǎn)生抗體的任何物種，還是通過重組DNA技術(shù)創(chuàng)建，無論是否分離自血清、B細胞、雜交瘤、轉(zhuǎn)染瘤、酵母或細菌，本文使用的“抗體”是指IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分子或者它們的抗原特異性抗體片段(包括但不限于Fab、F(ab’)₂，F(xiàn)v、二硫鍵連接的Fv、scFv、單域抗體、封閉構(gòu)象多特異性抗體、二硫鍵連接的scfv、雙特異抗體)。

本文所述的“抗原”是通過抗體試劑上的結(jié)合位點結(jié)合的分子。一般，抗原通過抗體配體結(jié)合并能夠引發(fā)體內(nèi)的抗體應(yīng)答?？乖梢允嵌嚯摹⒌鞍?、核酸或其它分子或者它們的部分。術(shù)語“抗原決定簇”是指通過抗原結(jié)合分子、特別是通過所述分子的抗原結(jié)合位點識別的抗原上的表位。

本文所使用的術(shù)語“抗體試劑”是指多肽，所述多肽包含至少一個免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域或免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域序列，并特異性地結(jié)合給定的抗原。抗體試劑可包括抗體或含有抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽。在一些實施方式中，抗體試劑可包括單克隆抗體或含有單克隆抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽。例如，抗體可包含重(H)鏈可變區(qū)(本文中縮寫為VH)以及輕(L)鏈可變區(qū)(本文中縮寫為VL)。在另一實例中，抗體包含兩個重(H)鏈可變區(qū)和兩個輕(L)鏈可變區(qū)。術(shù)語“抗體試劑”涵蓋了抗體的抗原結(jié)合片段(例如單鏈抗體、Fab片段和sFab片段、F(ab’)₂、Fd片段、Fv片段、scFv和結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)片段(參見例如de Wildt等，Eur J.Immunol.1996；26(3):629-39；以引用的方式將其整體并入本文))以及完整抗體。抗體可具有IgA、IgG、IgE、IgD、IgM(以及它們的亞型和它們的組合)的結(jié)構(gòu)特點?？贵w可來自于任何來源，包括小鼠抗體、兔抗體、豬抗體、大鼠抗體和靈長類動物(人和非人靈長類動物)抗體、以及靈長類動物化抗體?？贵w還包括midibodies、人源化抗體、嵌合抗體等。

VH區(qū)和VL區(qū)可進一步細分為高變區(qū)(稱為“互補決定區(qū)”(“CDR”))和穿插的更為保守的區(qū)域(稱為“框架區(qū)”(“FR”))?？蚣軈^(qū)和CDR的范圍已被精確定義(參見Kabat，E.A.等，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242；以及Chothia，C.等(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；以引用的方式將其整體并入本文)。各VH和VL通常由三個CDR和四個FR組成，從氨基末端到羧基末端按照以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。

術(shù)語“抗原結(jié)合片段”或者“抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域”在本文中可互換使用，用于指全長抗體的一個或多個片段，所述片段保留了特異性地結(jié)合至感興趣的靶標的能力。術(shù)語全長抗體的“抗原結(jié)合片段”所涵蓋的結(jié)合片段的實例包括：(i)Fab片段，由VL結(jié)構(gòu)域、VH結(jié)構(gòu)域、CL結(jié)構(gòu)域和CH1結(jié)構(gòu)域組成的單價片段；(ii)F(ab’)₂片段，包含在鉸鏈區(qū)通過二硫橋連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)Fd片段，由VH結(jié)構(gòu)域和CH1結(jié)構(gòu)域組成；(iv)Fv片段，由抗體單臂的VL結(jié)構(gòu)域和VH結(jié)構(gòu)域組成；(v)dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341：544-546；以引用的方式將其整體并入本文)，由VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域組成；以及(vi)保留了特異性的抗原結(jié)合功能的分離的互補決定區(qū)(CDR)。本文所使用的術(shù)語“特異性結(jié)合”是指兩個分子、化合物、細胞和/或顆粒之間的化學相互作用，其中，與第一實體結(jié)合至非靶標的第三實體相比，第一實體以更高的特異性和親和力與第二靶實體結(jié)合。在一些實施方式中，特異性結(jié)合可以指與第一實體對第三非靶標實體的親和力相比，第一實體對第二靶標實體的親和力為至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍或者更高。

此外，如本文所述，用于人的治療的重組人源化抗體可以進一步被優(yōu)化，以降低潛在的免疫原性，同時保持功能活性。在這方面，功能活性是指多肽能夠顯示與本文所述的該多肽的重組抗體或抗體試劑相關(guān)的一種或多種已知的功能活性。此類功能活性包括例如結(jié)合至給定的CRC標記基因的能力。

在一些實施方式中，CTC標記基因的抑制劑可為抑制性核酸試劑。在一些實施方式中，抑制性核酸為抑制性RNA(iRNA)。雙鏈RNA分子(dsRNA)已顯示出以稱為RNA干擾(RNAi)的高度保守的調(diào)控機制阻斷基因表達。本文所述的抑制核酸可以包括具有長度為30個或更少的核苷酸(即，長度為15-30個核苷酸、長度通常為19-24個核苷酸)的區(qū)域的RNA鏈(反義鏈)，該區(qū)域?qū)嵸|(zhì)上與靶向mRNA轉(zhuǎn)錄物的至少一部分互補。使用這些iRNA使得可以靶向降解mRNA轉(zhuǎn)錄物，引起靶標的表達和/或活性降低。

本文所使用的術(shù)語“iRNA”是指含有本文所定義的術(shù)語RNA、并通過RNA誘導的沉默復合物(RISC)通路來介導RNA轉(zhuǎn)錄物的靶向切割的試劑。在一個實施方式中，本文所述的iRNA引起靶mRNA的表達和/或活性的抑制。在一些實施方式中，與不存在iRNA的細胞中發(fā)現(xiàn)的靶mRNA水平相比，用抑制劑(例如iRNA)接觸細胞造成細胞中的靶mRNA水平降低至少約5％、約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約95％、約99％、上至并包括100％。

在一些實施方式中，iRNA可以是dsRNA。dsRNA包括兩條RNA鏈，兩條RNA鏈充分互補，以在使用dsRNA的情況下雜交形成雙鏈結(jié)構(gòu)。dsRNA的一條鏈(反義鏈)包括互補區(qū)域，該區(qū)域與靶序列大體上互補、且通常完全互補。靶序列可以衍生自在靶標的表達過程中形成的mRNA的序列。另一條鏈(正義鏈)包含互補于反義鏈的區(qū)域，從而使得當在適當?shù)臈l件下結(jié)合時，兩條鏈雜交并形成雙鏈結(jié)構(gòu)。通常，雙鏈結(jié)構(gòu)的長度介于15至30個堿基對之間，包括端值；長度更通常在18至25個堿基對之間，包括端值；長度更通常在19至24個堿基對之間，包括端值；并且長度最通常在19至21個堿基對之間，包括端值。類似地，與靶序列互補的區(qū)域的長度介于15至30個核苷酸之間，包括端值；長度更通常在18至25個核苷酸之間，包括端值；長度更通常在19至24個核苷酸之間，包括端值；并且長度最通常在19至21個核苷酸之間，包括端值。在一些實施方式中，dsRNA的長度介于15至20個核苷酸之間，包括端值；在其它實施方式中，dsRNA的長度介于25和30個核苷酸之間，包括端值。正如普通技術(shù)人員會認識到的，靶向用于切割的RNA的靶向區(qū)域最通常是較大的RNA分子(通常是mRNA分子)的一部分。相關(guān)地，mRNA靶標的“部分”是具有足以成為RNAi引導的切割(RNAi-directed cleavage)(即，通過RISC通路切割)的底物的長度的mRNA靶標的連續(xù)序列。在一些情況下，具有短至9個堿基對的雙鏈的dsRNA可以介導RNAi引導的RNA切割。最常見的靶標是至少15個核苷酸的長度、優(yōu)選15-30個核苷酸的長度。

在又一實施方式中，iRNA(例如dsRNA)的RNA為化學修飾的，以增強穩(wěn)定性或其它有益的特性。可以通過本領(lǐng)域完善建立的方法修飾和/或合成作為本發(fā)明特征的核酸，例如描述于“Current protocols in nucleic acid chemistry”，Beaucage，S.L.等(編)，John Wiley&Sons，Inc.，New York，NY，USA中的方法，以引用的方式由此將其并入本文。修飾包括：例如(a)末端修飾，例如5’端修飾(磷酸化、綴合、反向連接等)、3’端修飾(綴合、DNA核苷酸、反向連接等)；(b)堿基修飾，例如，用穩(wěn)定堿基、不穩(wěn)定堿基、或與擴大庫中的伴侶配對的堿基進行的置換；移除堿基(脫堿基核苷酸)或綴合堿基；(c)糖修飾(例如，在2’位或4’位)或糖置換；以及(d)骨架修飾，包括磷酸二酯連接的修飾或置換。用于本文所述的實施方式中的RNA化合物的具體實例包括但不限于含有經(jīng)修飾的骨架或無天然核苷間連接的RNA。其中，具有經(jīng)修飾的骨架的RNA包括在骨架中不具有磷原子的RNA。為了本申請文件的目的，如本領(lǐng)域有時所引用的，在核苷間的骨架中不具有磷原子的經(jīng)修飾的RNA也可以被認為是寡核苷酸。在特定的實施方式中，經(jīng)修飾的RNA將會在其核苷間的骨架中具有磷原子。

經(jīng)修飾的RNA骨架可以包括例如：具有正常的3’-5’連接的boranophosphates、磷硫酰、手性磷硫酰、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯(包括3’-亞烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、亞磷酸酯、氨基磷酸酯(包括3’-氨基磷酸氨基酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫羰氨基磷酸酯(thionophosphoramidates)、硫羰烷基膦酸酯(thionoalkylphosphonates)和硫羰烷基磷酸三酯；它們的2’-5’連接的類似物；以及具有反極性的物質(zhì)(其中，相鄰的核苷單元對以3’-5’至5’-3’或2’-5’至5’-2’連接)。各種鹽、混合鹽和游離酸形式也包括在內(nèi)。教導制備上述含磷連接的代表性的美國專利包括但不限于：美國專利號3,687,808、4,469,863、4,476,301、5,023,243、5,177,195、5,188,897、5,264,423、5,276,019、5,278,302、5,286,717、5,321,131、5,399,676、5,405,939、5,453,496、5,455,233、5,466,677、5,476,925、5,519,126、5,536,821、5,541,316、5,550,111、5,563,253、5,571,799、5,587,361、5,625,050、6,028,188、6,124,445、6,160,109、6,169,170、6,172,209、6,239,265、6,277,603、6,326,199、6,346,614、6,444,423、6,531,590、6,534,639、6,608,035、6,683,167、6,835,826、6,858,715、6,867,289、6,867,294、6,878,805、7,015,315、7,041,816、7,273,933、7,321,029、7,834,171、7,919,612、7,960,360、7,989,603、8,309,707、6,524,681和美國專利RE39464，以引用的方式將其各自并入本文。

在骨架中不包含磷原子的經(jīng)修飾的RNA骨架具有通過如下形成的骨架：短鏈烷基或環(huán)烷基核苷間連接、混合的雜原子和烷基或環(huán)烷基核苷間連接、或者一個或多個短鏈雜原子或雜環(huán)核苷間連接。這些骨架包括：具有嗎啉代連接(部分上由核苷的糖部分形成)的骨架；硅氧烷骨架；硫化物骨架、亞砜骨架或砜骨架；formacetyl骨架和thioformacetyl骨架；methylene formacetyl骨架和methylene thioformacetyl骨架；含烯烴骨架；氨基磺酸酯骨架；亞甲基亞氨基骨架和亞甲基肼基骨架；磺酸酯骨架和磺胺骨架；酰胺骨架；以及其它的具有混合的N、O、S和CH₂組成部分的骨架。教導制備上述寡核苷酸的代表性的美國專利包括但不限于：美國專利號5,034,506、5,166,315、5,185,444、5,214,134、5,216,141、5,235,033、5,64,562、5,264,564、5,405,938、5,434,257、5,466,677、5,470,967、5,489,677、5,541,307、5,561,225、5,596,086、5,602,240、5,608,046、5,610,289、5,618,704、5,623,070、5,663,312、5,633,360、5,677,437和5,677,439，以引用的方式將其各自并入本文。

適于或考慮用于iRNA中的其它RNA模擬物中，核苷酸單元的糖和核苷間連接(即骨架)用新的基團所取代。堿基單元被保留用于與適當?shù)暮怂岚谢衔镫s交。一種此類寡聚化合物(已顯示具有良好的雜交性質(zhì)的RNA模擬物)被稱為肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，RNA的糖骨架被含酰胺骨架(特別是氨基乙基甘氨酸骨架)取代。核堿基保留并且直接或間接地結(jié)合至骨架的酰胺部分的氮雜氮原子。教導制備PNA化合物的代表性的美國專利包括但不限于：美國專利號5,539,082、5,714,331和5,719,262，以引用的方式將其各自并入本文。PNA化合物的進一步教導可例如Nielsen等，Science，1991，254，1497-1500。

本發(fā)明中的一些特色的實施方式包括：具有磷硫酰骨架的RNA和具有雜原子骨架的寡核苷酸，特別是上述引用的美國專利號5,489,677中的--CH₂--NH--CH₂--、--CH₂--N(CH₃)--O--CH₂--[稱為亞甲基(甲基亞氨基)骨架或MMI骨架]、--CH₂--O--N(CH₃)--CH₂--、--CH₂--N(CH₃)--N(CH₃)--CH₂--和--N(CH₃)--CH₂--CH₂--[其中，天然磷酸二酯骨架表示為--O--P--O--CH₂--]；以及上述引用的美國專利號5,602,240中的酰胺骨架。在一些實施方式中，本文的特色的RNA具有上面上述引用的美國專利號5,034,506的嗎啉代骨架結(jié)構(gòu)。

經(jīng)修飾的RNA還可以包含一個或多個取代的糖部分。本文的特色的iRNA(例如dsRNA)在2’位置可以包含如下中的一種：OH；F；O-烷基、S-烷基或N-烷基；O-烯基、S-烯基或N-烯基；O-炔基、S-炔基或N-炔基；或者O-烷基-O-烷基，其中，烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C₁-C₁₀烷基或C₂-C₁₀烯基或C₂-C₁₀炔基。示例性的適當?shù)男揎棸ǎ篛[(CH₂)_nO]_mCH₃、O(CH₂)_nOCH₃、O(CH₂)_nNH₂、O(CH₂)_nCH₃、O(CH₂)_nONH₂和O(CH₂)_nON[(CH₂)_nCH₃)]₂，其中，n和m分別為從1至約10。在其它實施方式中，dsRNA在2’位置包含如下中的一種：C₁-C₁₀低級烷基；取代的低級烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基；SH、SCH₃、OCN、Cl、Br、CN、CF₃、OCF₃、SOCH₃、SO₂CH₃、ONO₂、NO₂、N₃、NH₂；雜環(huán)烷基、雜環(huán)烷芳基、氨基烷氨基、多烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基團、報告子基團、嵌入劑、改善iRNA的藥代動力學性質(zhì)的基團、或改善iRNA的藥效動力學性質(zhì)的基團、以及具有類似性質(zhì)的其它取代基。在一些實施方式中，所述修飾包括2’-甲氧基乙氧基(2’-O--CH₂CH₂OCH₃，也稱為2’-O-(2-甲氧基乙基)或2’-MOE)(Martin等，Helv.Chim.Acta，1995，78:486-504)，即烷氧基-烷氧基基團。另一示例性的修飾是如下文的實施例所述的2’-二甲基氨基氧基乙氧基，即O(CH₂)₂ON(CH₃)₂基團，又稱為2’-DMAOE；以及如下文的實施例所述的2’-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本領(lǐng)域也稱為2’-O-二甲基氨基乙氧基乙基或2’-DMAEOE)，即2’-O--CH₂--O--CH₂--N(CH₂)₂。

其它修飾包括2’-甲氧基(2’-OCH₃)、2’-氨基丙氧基(2’-OCH₂CH₂CH₂NH₂)和2’-氟(2’-F)。類似的修飾也可以在iRNA的RNA上的其它位置進行，特別是2’-5’連接的dsRNA中或3’末端核苷酸上的糖的3’位、以及5’末端核苷酸的5’位置。iRNA也可以具有糖模擬物，例如取代戊呋喃糖的環(huán)丁基部分。教導制備此類經(jīng)修飾的糖結(jié)構(gòu)的代表性的美國專利包括但不限于：美國專利號4,981,957、5,118,800、5,319,080、5,359,044、5,393,878、5,446,137、5,466,786、5,514,785、5,519,134、5,567,811、5,576,427、5,591,722、5,597,909、5,610,300、5,627,053、5,639,873、5,646,265、5,658,873、5,670,633、5,700,920、8,084,600、8,124,745和8,377,644，并以引用的方式將其各自并入本文。

iRNA還可包括核堿基(在本領(lǐng)域通常僅僅稱作“堿基”)修飾或置換。本文所使用的“未修飾的”或“天然的”核堿基包括：嘌呤堿基腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)；以及嘧啶堿基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。經(jīng)修飾的核堿基包括其它合成和天然的核堿基，例如：5-甲基胞嘧啶(5-me-C)；5-羥甲基胞嘧啶；黃嘌呤；次黃嘌呤；2-氨基腺嘌呤；腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基衍生物和其它烷基衍生物；腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基衍生物和其它烷基衍生物；2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶；5-鹵素尿嘧啶和5-鹵素胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶；6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶和6-偶氮胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫尿嘧啶；8-鹵素、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羥基和其它的8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤；5-鹵素(特別是5-溴)、5-三氟甲基和其它的5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶；7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤；8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤；7-脫氮鳥嘌呤和7-脫氮腺嘌呤以及3-脫氮鳥嘌呤和3-脫氮腺嘌呤。進一步的核堿基包括：在美國專利號3,687,808公開的堿基；在Modified Nucleosides in Biochemistry，Biotechnology and Medicine，Herdewijn，P.編，Wiley-VCH，2008中公開的堿基；在The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering，858-859頁，Kroschwitz，J.L編，John Wiley&Sons，1990中公開的堿基；通過Englisch等，Angewandte Chemie，International Edition，1991，30，613公開的堿基；以及通過Sanghvi，Y S.，dsRNA Research and Applications，第15章，289-302頁，Crooke，S.T.和Lebleu，B.編，CRC Press，1993公開的堿基。這些核堿基中的一些對于增高本發(fā)明中的特色的寡聚化合物的結(jié)合親和力是特別有用的。這些核堿基包括：5-取代的嘧啶；6-氮雜嘧啶；以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已表明5-甲基胞嘧啶置換增高了核酸雙鏈穩(wěn)定性0.6-1.2℃(Sanghvi，Y.S.，Crooke，S.T.和Lebleu，B.編，dsRNA Research and Applications，CRC Press，Boca Raton，1993，276-278頁)，并且是示例性的堿基置換，甚至更特別是當與2'-O-甲氧乙基糖修飾組合時。

教導制備一些上述經(jīng)修飾的核堿基以及其它經(jīng)修飾的核堿基的代表性的美國專利包括但不限于上面提到的美國專利號3,687,808，及美國專利號4,845,205、5,130,30、5,134,066、5,175,273、5,367,066、5,432,272、5,457,187、5,459,255、5,484,908、5,502,177、5,525,711、5,552,540、5,587,469、5,594,121、5,596,091、5,614,617、5,681,941、6,015,886、6,147,200、6,166,197、6,222,025、6,235,887、6,380,368、6,528,640、6,639,062、6,617,438、7,045,610、7,427,672和7,495,088，以引用的方式將其各自并入本文；以及美國專利號5,750,692，以引用的方式將其也并入本文。

iRNA的RNA也可以被修飾成包含一個或多個鎖核酸(LNA)。鎖核酸是具有經(jīng)修飾的核糖部分的核苷酸，其中，所述核糖部分包含連接2’位和4’位碳原子的另外的橋。這一結(jié)構(gòu)有效地將核糖“鎖定”在3’-內(nèi)向結(jié)構(gòu)構(gòu)象中。已經(jīng)表明，將鎖核酸添加至siRNA增加了血清中的siRNA的穩(wěn)定性，并降低了脫靶效應(yīng)(Elmen，J.等，(2005)Nucleic Acids Research 33(1):439-447；Mook，OR.等，(2007)Mol Canc Ther 6(3):833-843；Grunweller，A.等，(2003)Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193)。教導制備鎖核酸核苷酸的代表性的美國專利包括但不限于如下：美國專利號6,268,490、6,670,461、6,794,499、6,998,484、7,053,207、7,084,125和7,399,845，以引用的方式將其各自整體并入本文。

本發(fā)明中的特色的iRNA的RNA的另一修飾涉及將一個或多個配體、部分或綴合物在化學上連接至RNA，所述配體、部分或綴合物增強了iRNA的細胞攝取、活性、細胞分布或藥代動力學性質(zhì)。此類部分包括但不限于：脂質(zhì)部分如膽固醇部分(Letsinger等，Proc.Natl.Acid.Sci.USA，1989，86:6553-6556)；膽酸(Manoharan等，Biorg.Med.Chem.Let.，1994，4:1053-1060)；硫醚，例如beryl-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1992，660:306-309；Manoharan等，Biorg.Med.Chem.Let.，1993，3:2765-2770)；硫代膽固醇(Oberhauser等，Nucl.Acids Res.，1992，20:533-538)；脂肪鏈，例如十二烷二醇或十一烷基殘基(Saison-Behmoaras等，EMBO J，1991，10:1111-1118；Kabanov等，F(xiàn)EBS Lett.，1990，259:327-330；Svinarchuk等，Biochimie，1993，75:49-54)；磷脂，例如二-十六烷基-消旋-甘油或三乙基銨1,2-二-O-十六烷基-消旋-甘油-3-磷酸酯(Manoharan等，Tetrahedron Lett.，1995，36:3651-3654；Shea等，Nucl.Acids Res.，1990，18:3777-3783)；聚胺或聚乙二醇鏈(Manoharan等，Nucleosides&Nucleotides，1995，14:969-973)，或金剛烷乙酸(Manoharan等，Tetrahedron Lett.，1995，36:3651-3654)；棕櫚酰部分(Mishra等，Biochim.Biophys.Acta，1995，1264:229-237)；或十八胺或己基氨基-羰基氧基膽固醇部分(Crooke等，J.Pharmacol.Exp.Ther.，1996，277:923-937)。

在一些實施方式中，CTC標記基因靶向治療劑可包括結(jié)合至CTC標記基因表達產(chǎn)物的試劑以及作為化療劑的試劑。在一些實施方式中，CTC標記基因靶向治療劑包括CTC標記基因結(jié)合抗體試劑和化療劑。CTC標記基因結(jié)合抗體試劑可為結(jié)合例如CTC標記基因多肽的抗體試劑。結(jié)合抗體試劑可為抑制劑或其本身不表現(xiàn)出抑制效果的試劑。通過結(jié)合至CTC標記基因，從而結(jié)合CTC，使得化療劑在腫瘤間質(zhì)和/或循環(huán)的CTC細胞處濃縮并局部化，增強效力并減少副作用。

在一些實施方式中，CTC標記基因靶向治療劑包括CTC標記基因結(jié)合抗體試劑，所述CTC標記基因結(jié)合抗體試劑結(jié)合選自表14的標記基因。在一些實施方式中，CTC標記基因靶向治療劑包括CTC標記基因結(jié)合抗體試劑，所述CTC標記基因結(jié)合抗體試劑結(jié)合選自于由IL6ST、SULF2和SV2A所組成的組中的標記基因。

本文所使用的術(shù)語“化療劑”是指在治療特征為異常的細胞生長的疾病中具有治療有效性的任何化學試劑或生物試劑。此類疾病包括腫瘤、贅生物、癌癥以及特征為增生性生長的疾病。這些試劑的作用可在于抑制癌細胞持續(xù)增殖所依賴的細胞活性。在所有的實施方式的一些方面中，化療劑是細胞周期抑制劑或細胞分裂抑制劑。在本發(fā)明的方法中有用的化療劑的類別包括：烷化劑/生物堿劑、抗代謝物、激素或激素類似物、以及各種各樣的抗腫瘤藥物。這些試劑中的大多數(shù)直接或間接地對癌細胞具有毒性。在一個實施方式中，化療劑是放射性分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地識別有用的化療劑(例如參見Slapak和Kufe，Principles of Cancer Therapy，Harrison’s Principles of Internal Medicine中的第86章，第14版；Perry等，Chemotherapy，Abeloff，Clinical Oncology中的第17章，第2版，2000，Churchill Livingstone，Inc；Baltzer L，Berkery R(編)：Oncology Pocket Guide to Chemotherapy，第2版，St.Louis，Mosby-Year Book，1995；Fischer D S，Knobf M F，Durivage H J(編)：The Cancer Chemotherapy Handbook第4版，St.Louis，Mosby-Year Book，1993)。在一些實施方式中，化療劑可以是細胞毒性化療劑。本文所使用的術(shù)語“細胞毒性試劑”是指抑制或防止細胞的功能和/或引起細胞的破壞的物質(zhì)。該術(shù)語旨在包含放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)；化療劑；以及毒素，例如小分子毒素，或細菌、真菌、植物或動物來源的酶活性毒素；包括它們的片段和/或變體。

化療劑的非限制性實例可以包括吉西他濱、順鉑(cisplastin)、紫杉醇、卡鉑(carboplatin)、硼替佐米、AMG479、伏立諾他(vorinostat)、利妥昔單抗、替莫唑胺、雷帕霉素、ABT-737、PI-103；烷化劑，例如噻替哌(thiotepa)和環(huán)磷酰胺；烷基磺酸酯，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，例如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和uredopa；乙撐亞胺和甲基蜜胺(methylamelamines)，包括六甲蜜胺、三乙撐蜜胺、三乙撐磷酰胺、三乙撐硫代磷酰胺和三羥甲基蜜胺；多聚乙酰(特別是布拉它辛(bullatacin)和布拉它辛酮(bullatacinone))；喜樹堿(包括合成類似物拓撲替康(topotecan))；苔蘚蟲素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多來新、卡折來新和比折來新合成類似物)；隱藻素(cryptophycins)(特別是隱藻素1和隱藻素8)；多拉司他汀；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成類似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉堿(pancratistatin)；sarcodictyin；海綿毒素(spongistatin)；氮芥，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、膽磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥、異環(huán)磷酰胺、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、氮氧芥鹽酸鹽、美法侖、新氮芥、苯芥膽甾醇(phenesterine)、潑松龍苯芥、氯乙環(huán)磷酰胺、尿嘧啶氮芥；亞硝基脲(nitrosureas)，例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，例如烯二炔抗生素(例如卡奇霉素，特別是卡奇霉素γlI和卡奇霉素ωIl(參見例如Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.，33:183-186(1994))；dynemicin，包括dynemicin A；雙膦酸鹽，例如氯膦酸鹽；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素發(fā)色團和相關(guān)的色素蛋白烯二炔抗生素發(fā)色團)、aclacinomysins、放線菌素、安曲霉素、重氮絲氨酸、博來霉素、放線菌素C、carabicin、洋紅霉素(caminomycin)、嗜癌素、色霉素(chromomycinis)、放線菌素D、柔紅霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素(包括嗎啉代阿霉素、氰基嗎啉代阿霉素、2-吡咯啉并阿霉素和去氧阿霉素)、表柔比星、依索比星、去甲氧基柔紅霉素、麻西羅霉素、絲裂霉素例如絲裂霉素C、霉酚酸、諾加霉素、橄欖霉素、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三鐵阿霉素、羅多比星、鏈黑菌素、鏈脲佐菌素、殺結(jié)核菌素、烏苯美司、凈司他丁、佐柔比星；抗代謝物，例如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，例如二甲葉酸、氨甲蝶呤、蝶羅呤、曲美沙特；嘌呤類似物，例如氟達拉濱、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，例如安西他濱、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脫氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷；雄激素，例如卡普睪酮、丙酸甲雄烷酮、環(huán)硫雄醇、美雄烷、睪內(nèi)酯；抗腎上腺，例如氨魯米特、米托坦、曲洛司坦；葉酸補充劑，例如亞葉酸(frolinic acid)；乙酰葡醛內(nèi)酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；依達曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛；地吖醌；elformithine；依利醋銨；埃博霉素；依托格魯；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖；氯尼達明(lonidainine)；美登木素(maytansinoids)，例如美登素(maytansine)和安絲菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌達醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；噴司他??；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸乙肼；甲基芐肼；多糖復合物(JHS Natural Products，Eugene，Oreg.)；雷佐生；根霉素；西佐喃(sizofuran)；螺旋鍺；細交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌；2,2’,2”-三氯三乙胺；單端孢霉烯(特別是T-2毒素、疣孢菌素A(verracurin A)、桿孢菌素A和蛇行菌素)；氨基甲酸酯；長春地辛；達卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴衛(wèi)矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)；環(huán)磷酰胺；噻替哌；紫杉烷(taxoids)，例如紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)、Cremophor-free、紫杉醇的白蛋白工程化納米顆粒制劑(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，I11.)和doxetaxel(Rhone-Poulenc Rorer，Antony，法國)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；吉西他濱；6-硫代鳥嘌呤；巰基嘌呤；氨甲蝶呤；鉑類似物，例如順鉑、奧沙利鉑和卡鉑；長春堿；鉑；依托泊苷(VP-16)；異環(huán)磷酰胺；米托蒽醌；長春新堿；NAVELBINE^TM長春瑞濱；鹽酸米托蒽醌；替尼泊苷；依達曲沙；道諾霉素；氨基蝶呤；希羅達；伊班膦酸鹽；伊立替康(Camptosar，CPT-11)(包括伊立替康與5-FU和甲酰四氫葉酸的治療方案)；拓撲異構(gòu)酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；類視黃醇，例如視黃酸；卡培他濱；考布他??；甲酰四氫葉酸(LV)；奧沙利鉑，包括奧沙利鉑治療方案(FOLFOX)；拉帕替尼(Tykerb^TM)；減少細胞增殖的PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR(例如，厄洛替尼)和VEGF-A的抑制劑，以及任何上述物質(zhì)的藥學上可接受的鹽、酸或者衍生物。

在一些實施方式中，結(jié)合抗體試劑和化療劑可彼此直接綴合和/或結(jié)合，例如抗體-藥物綴合物。在一些實施方式中，結(jié)合可為非共價的，例如通過氫鍵、靜電或范德華相互作用，然而，結(jié)合也可為共價的?！熬Y合”意味著至少兩個分子的共價連接。在一些實施方式中，組合物可為抗體-藥物綴合物。

在一些實施方式中，結(jié)合抗體試劑可結(jié)合至和/或綴合至多個化療分子。在一些實施方式中，給定化療分子與結(jié)合抗體試劑分子的比例可為約1:1至約1,000:1，例如單個抗體結(jié)合試劑分子可例如連接、綴合于約1至約1,000個單獨的化療分子。

在一些實施方式中，結(jié)合抗體試劑和化療劑可存在于支架材料中。適用于治療組合物中的支架材料為本領(lǐng)域所知曉，可包括但不限于納米顆粒、基質(zhì)、水凝膠、生物材料、生物相容和/或生物可降解的支架材料。本文使用的術(shù)語“納米顆?！敝傅氖羌s10^-9或十億分之一米量級的顆粒。術(shù)語“納米顆?！卑{米球、納米棒、納米殼以及納米棱柱；并且這些納米顆?？梢允羌{米網(wǎng)絡(luò)的一部分。

術(shù)語“納米顆?！边€涵蓋了具有納米顆粒尺寸的脂質(zhì)體和脂質(zhì)顆粒。本文使用的術(shù)語“基質(zhì)”指的是包含本文所述的組合物組分(例如結(jié)合試劑、激酶抑制劑和/或EGFR抑制劑)的3維結(jié)構(gòu)?；|(zhì)結(jié)構(gòu)的非限制性實例包括泡沫、水凝膠、靜電紡絲纖維、凝膠、纖維墊、海綿、3維支架、無紡布墊、編織材料(woven materials)、針織材料(knit materials)、纖維束、纖維和其它材料形式(參見例如Rockwood等，Nature Protocols 2011 6：1612-1631以及US專利公開2011/0167602；2011/0009960；2012/0296352和U.S.專利號8,172,901，各自以引用的方式將其整體并入本文)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可依賴于組合物的期望應(yīng)用對基質(zhì)的結(jié)構(gòu)進行選擇，例如靜電紡絲基質(zhì)可具有比泡沫更大的表面積。

在一些實施方式中，支架是水凝膠。本文使用的術(shù)語“水凝膠”指的是在水中不可溶、但能夠吸收并保持大量的水從而形成穩(wěn)定、通常柔軟和柔韌的結(jié)構(gòu)的三維聚合物結(jié)構(gòu)。在一些實施方式中，水可滲透入聚合物網(wǎng)絡(luò)的聚合物鏈之間，隨后引起水凝膠的溶脹和形成。一般而言，水凝膠為超強吸收性的。水凝膠具有用于生物醫(yī)療應(yīng)用的多種期望性質(zhì)。例如，它們可制成無毒并與組織相容，并且它們對于水、離子和小分子是高度透過的。水凝膠為超強吸收性的(它們可含有超過99％的水)，并可由天然(例如絲)或合成的聚合物(例如PEG)組成。

本文使用的“生物材料”指的是生物相容且生物可降解的材料。本文使用的術(shù)語“生物相容”指的是對細胞無毒的物質(zhì)。在一些實施方式中，如果在體外將物質(zhì)加入至細胞造成小于或等于約20％的細胞死亡，則認為該物質(zhì)是“生物相容”的。在一些實施方式中，如果在體內(nèi)將物質(zhì)加入至細胞而不引發(fā)體內(nèi)的炎癥和/或其它副作用，則認為該物質(zhì)是“生物相容”的。本文使用的術(shù)語“生物可降解”指的是在生理條件下被降解的物質(zhì)。在一些實施方式中，生物可降解物質(zhì)為被細胞器(cellular machinery)分解的物質(zhì)。在一些實施方式中，生物可降解物質(zhì)為被化學過程分解的物質(zhì)。

在一些實施方式中，本文所述的方法涉及用CTC標記基因靶向治療劑對患有或診斷為患有癌癥的受試者進行治療。在一些實施方式中，所述癌癥為胰腺癌。可通過醫(yī)師使用現(xiàn)有的癌癥診斷方法識別患有癌癥的受試者。表征這些狀況以及輔助診斷的癌癥(例如胰腺癌)的癥狀和/或并發(fā)癥為本領(lǐng)域所熟知的，包括但不限于上腹部疼痛、胃灼熱、惡心、嘔吐、腹瀉、萎靡不振、黃疸、肺栓塞、Trousseau綜合征和糖尿病?？捎兄诶缫认侔┑脑\斷的測試包括但不限于：肝功能測試、CA19-9測試、CT和超聲內(nèi)鏡。胰腺癌的家族史或暴露至胰腺癌的危險因素(例如吸煙或飲酒)也可幫助確定受試者是否有可能患癌癥、或者幫助對癌癥進行診斷。

本文所述的組合物和方法可給予至患有或診斷為患有癌癥(例如胰腺癌)的受試者。在一些實施方式中，本文所述的方法包括將本文所述的有效量的組合物(例如CTC標記基因靶向治療劑)給予至受試者，以緩解癌癥的癥狀。本文所使用的“緩解癌癥的癥狀”是改善與癌癥有關(guān)的任何狀況或癥狀。與同等的未經(jīng)處理的對照相比，此類降低是通過任何標準技術(shù)測量降低至少5％、10％、20％、40％、50％、60％、80％、90％、95％、99％或更多。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知用于將本文所述的組合物給予至受試者的多種手段。此類方法可以包括但不限于：口服給予、胃腸外給予、靜脈內(nèi)給予、肌內(nèi)給予、皮下給予、經(jīng)皮給予、氣道(氣溶膠)給予、肺部給予、皮膚給予、局部給予、注射給予或瘤內(nèi)給予。給予可以是局部的或全身性的。

本文所使用的術(shù)語“有效量”是指緩解疾病或紊亂的至少一種或多種癥狀所需的CTC標記基因靶向治療劑的量，并涉及足以提供期望效果的藥物組合物的量。因此，術(shù)語“治療有效量”是指當給予至典型受試者時，足以提供特定的抗癌效果的CTC標記基因靶向治療劑的量。在各種背景下，本文所使用的有效量也包括足以推遲疾病癥狀進展的量、足以改變疾病癥狀進程(例如但不限于延緩疾病癥狀的進展)的量、或足以逆轉(zhuǎn)疾病癥狀的量。因此，指定確切的“有效量”通常是不實際的。然而，對于任何給定的情況，適當?shù)摹坝行Я俊笨梢杂杀绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員僅使用常規(guī)實驗來確定。

有效量、毒性和治療效果可以通過細胞培養(yǎng)物或?qū)嶒瀯游镏械臉藴仕帉W程序來確定，例如用于確定LD50(使群體50％致死的劑量)和ED50(在群體50％中治療有效的劑量)的藥學程序。劑量可以根據(jù)所采用的劑型和所利用的給予途徑而變化。毒性作用和治療效果之間的劑量比是治療指數(shù)，并可表示為比例LD50/ED50。表現(xiàn)出大的治療指數(shù)的組合物和方法是優(yōu)選的。治療有效劑量可以從細胞培養(yǎng)物檢測初步估算。另外，劑量可在動物模型中制定以達到循環(huán)血漿濃度范圍，所述循環(huán)血漿濃度范圍包括在細胞培養(yǎng)物中或在合適的動物模型中確定的IC50(即，達到癥狀的半數(shù)最大抑制的CTC標記基因靶向治療劑的濃度)。血漿中的水平可以通過例如高效液相色譜法進行測量。任何特定劑量的影響可以通過合適的生物測定法進行監(jiān)測，例如用于其中包括CTC水平的測定法。所述劑量可以由醫(yī)師來確定并在必要時進行調(diào)整，以適合所觀察到的治療效果。

在一些實施方式中，本文描述的技術(shù)涉及包含本文所述的CTC標記基因靶向治療劑以及任選的藥學上可接受的載體的藥物組合物。藥學上可接受的載體和稀釋劑包括鹽水、水性緩沖溶液、溶劑和/或分散媒介。本領(lǐng)域公知此類載體和稀釋劑的使用。可作為藥學上可接受的載體的一些非限制性實例包括：(1)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；(3)纖維素及其衍生物，例如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、乙基纖維素、微晶纖維素和醋酸纖維素；(4)黃蓍膠粉；(5)麥芽；(6)明膠；(7)潤滑劑，例如硬脂酸鎂、十二烷基硫酸鈉和滑石；(8)賦形劑，例如可可脂和栓蠟；(9)油，例如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；(10)二醇，例如丙二醇；(11)多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇(PEG)；(12)酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)瓊脂；(14)緩沖劑，例如氫氧化鎂和氫氧化鋁；(15)海藻酸；(16)無熱原水；(17)等滲鹽水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)pH緩沖溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；(22)填充劑，例如多肽和氨基酸；(23)血清成分，例如血清白蛋白、HDL和LDL；(24)C₂-C₁₂醇，例如乙醇；以及(25)用于藥物制劑中的其它無毒相容物質(zhì)。潤濕劑、著色劑、脫模劑、包衣劑、甜味劑、調(diào)味劑、芳香劑、防腐劑和抗氧化劑也可以存在于制劑中。術(shù)語例如“賦形劑”、“載體”、“藥學上可接受的載體”等在本文中可互換使用。在一些實施方式中，載體抑制活性試劑(例如本文所述的CTC標記基因靶向治療劑)的降解。

在一些實施方式中，包含如本文所述的CTC標記基因靶向治療劑的藥物組合物可以是胃腸外劑型。由于胃腸外劑型的給予通常繞開患者對污染物的天然防御，胃腸外劑型優(yōu)選是無菌的或能夠在給予患者之前滅菌。胃腸外劑型的實例包括但不限于：準備用于注射的溶液劑、待溶解或懸浮于用于注射的藥學上可接受的載體中的干燥產(chǎn)品、準備用于注射的混懸劑、以及乳液。此外，可制備控釋的胃腸外劑型用來給予患者，包括但不限于型劑型和劑量傾瀉(dose-dumping)。

本文中公開的可以用來提供CTC標記基因靶向治療劑的胃腸外劑型的合適的載體對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的。實例包括但不限于：無菌水；USP注射用水；鹽水溶液；葡萄糖溶液；水性載體，例如但不限于氯化鈉注射液、林格氏注射液、右旋糖注射液、右旋糖和氯化鈉注射液、以及乳酸林格氏注射液；與水混溶的載體，例如但不限于乙醇、聚乙二醇和丙二醇；以及非水性載體，例如但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯和苯甲酸芐酯。改變或修飾本文所公開的CTC標記基因靶向治療劑的藥學上可接受的鹽的溶解度的化合物也可以納入本公開內(nèi)容的胃腸外劑型中，包括常規(guī)和控釋的胃腸外劑型。

包含CTC標記基因靶向治療劑的藥物組合物也可以配制成適合于口服給予，例如作為離散劑型，例如但不限于片劑(包括但不限于刻痕片劑或包衣片劑)、丸劑、囊片劑、膠囊劑、咀嚼片劑、粉包劑(powder packets)、扁囊劑、含片、晶片、氣溶膠噴霧劑；或液體劑，例如但不限于糖漿劑、酏劑、在水性液體中的溶液劑或混懸劑、非水性液體、水包油乳液或油包水乳液。此類組合物含有所公開的化合物的預(yù)定量的藥學上可接受的鹽，并可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的藥物學方法制備。通常參見，Remington:The Science and Practice of Pharmacy，第21版，Lippincott，Williams和Wilkins，Philadelphia，PA(2005)。

常規(guī)劑型通常提供藥物從制劑中的快速或立即釋放。根據(jù)藥物的藥理學和藥代動力學，使用常規(guī)劑型可使得患者的血液和其它組織中的藥物濃度的大幅波動。這些波動可能影響許多參數(shù)，例如劑量頻率、起效時間、療效的持續(xù)時間、治療性血液水平的維持、毒性、副作用等。有利的是，控釋制劑可用于控制藥物的起效時間、作用持續(xù)時間、治療窗內(nèi)的血漿水平以及峰值血液水平。特別是，控釋或緩釋(extended-release)劑型或制劑可用于確保實現(xiàn)藥物的最大效果，同時使?jié)撛诘母弊饔煤桶踩[患最小化，副作用和安全隱患可能在藥物的不足量給藥(即，低于最低治療水平)以及超過藥物的毒性水平時出現(xiàn)。在一些實施方式中，CTC標記基因靶向治療劑能夠以持續(xù)釋放(sustained release)制劑給予。

控釋藥物產(chǎn)品具有改進藥物治療高于通過它們的非控釋對應(yīng)物所實現(xiàn)的共同目標。理想的是，在醫(yī)學治療中使用優(yōu)化設(shè)計的控釋制劑的特征在于，使用最少的藥物物質(zhì)在最短時間內(nèi)治愈或控制病情?？蒯屩苿┑膬?yōu)點包括：1)延長藥物活性；2)降低劑量頻率；3)提高患者依從性；4)使用較少的藥物總量；5)減少局部或全身性副作用；6)使藥物累積最小化；7)減少血液水平的波動；8)改善治療功效；9)減少藥物活性的增強作用或損失；以及10)改善疾病或病情的控制速度(Kim，Cherng-ju，Controlled Release Dosage Form Design，2(Technomic Publishing，Lancaster，Pa.:2000))。

大多數(shù)控釋制劑被設(shè)計為最初釋放一定量的藥物(有效成分)，以立即產(chǎn)生期望的治療效果，并逐步且持續(xù)地釋放另外量的藥物以在一段長的時間內(nèi)維持這一水平的治療或預(yù)防作用。為了在體內(nèi)維持藥物的這一恒定水平，藥物必須從劑型中以一定速度釋放以取代藥物從體內(nèi)代謝和排出的量?；钚猿煞值目蒯尶梢允艿蕉喾N條件的刺激，包括但不限于：pH、離子強度、滲透壓、溫度、酶、水以及其它的生理狀況或化合物。

各種已知的控釋或緩釋劑型、制劑和裝置可適于用于本公開所述的鹽和組合物。實例包括但不限于在以如下中描述的實例：美國專利號3,845,770、3,916,899、3,536,809、3,598,123、4,008,719、5,674,533、5,059,595、5,591,767、5,120,548、5,073,543、5,639,476、5,354,556、5,733,566以及6,365,185B1；以引用的方式將其各自并入本文。這些劑型可用于使用例如羥丙基甲基纖維素、其它聚合物基質(zhì)、凝膠、可透膜、滲透系統(tǒng)(如(Alza Corporation，Mountain View，Calif.USA))或它們的組合提供一種或多種活性成分的緩慢釋放或控釋，從而提供期望的不同比例的釋放曲線。

本文所述的方法可以進一步包括向受試者給予第二試劑和/或治療，例如作為組合治療的一部分。第二試劑和/或治療的非限制性實例可以包括如上文所述的放射治療劑、外科手術(shù)治療劑和/或化學治療劑。

在一些實施方式中，包含本文所述的CTC標記基因靶向治療劑的組合物的有效劑量可以一次給予患者。在一些實施方式中，包含CTC標記基因靶向治療劑的組合物的有效劑量可以重復給予患者。對于全身給藥，可以給予患者治療量的包含CTC標記基因靶向治療劑的組合物，例如0.1mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、或更多。

在一些實施方式中，在初始治療方案之后，可以在不太頻繁的基礎(chǔ)上給予治療。例如，在每兩周治療進行三個月后，治療可每月重復一次至六個月或一年或更長時間。根據(jù)本文所述的方法的治療可以降低標記的水平或狀況的癥狀，例如CTC水平降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％或更多。

本文所述的組合物的劑量可以由臨床醫(yī)師確定并在必要時進行調(diào)整，以適應(yīng)觀察到的治療效果。至于治療持續(xù)時間和治療的頻率，一般由熟練的臨床醫(yī)師監(jiān)測受試者以確定何時治療提供治療效果，并確定是否增加或減少劑量、增加或降低給予頻率、不繼續(xù)治療、恢復治療或?qū)χ委煼桨缸鞒銎渌淖儭＝o藥計劃可以每周至每天變化，這取決于許多臨床因素，例如受試者對CTC標記基因靶向治療劑的敏感性?；钚宰饔玫钠谕膭┝炕蛄靠梢淮谓o予或分成亞劑量，例如2-4個亞劑量并在一段時間內(nèi)(例如，以一天內(nèi)的適當時間間隔或其它適當?shù)挠媱?給予。在一些實施方式中，給予可以是長期的，例如在數(shù)周或數(shù)月的時間段內(nèi)每天一次或多次給藥和/或治療。給藥和/或治療計劃的實例是在1周、2周、3周、4周、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月或6個月或更長的時間段內(nèi)，每天給予、每天兩次、每天三次或每天四次或更多次給予。含有CTC標記基因靶向治療劑的組合物可以在一段時間內(nèi)給予，例如在5分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘或25分鐘內(nèi)。

根據(jù)本文所述的方法的CTC標記基因靶向治療劑的給予劑量范圍取決于：例如CTC標記基因靶向治療劑的形式、其效力，以及期望降低的本文所述的狀況的癥狀、標記或指標的程度，例如對CTC水平而言期望的降低百分比。劑量不應(yīng)大到以至于造成不利的副作用。通常，劑量會隨患者的年齡、狀況和性別而變化，并可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員確定。在任何并發(fā)癥的情況下，劑量也可由醫(yī)師個體進行調(diào)整。

CTC標記基因靶向治療劑在例如治療本文所述的狀況方面的效力、或者引起如本文所述的應(yīng)答(如降低CTC水平)的效力可以由熟練的臨床醫(yī)師確定。然而，如同在本文中所使用的術(shù)語，如果本文所述的狀況的一種或多種指征或癥狀以有益的方式改變、其它臨床上接受的癥狀改善或甚至緩解、或誘發(fā)了期望的應(yīng)答(例如，根據(jù)本文所述的方法在治療后改變至少10％)，則治療被認為是“有效的治療”。效力可例如通過測量根據(jù)本文所述的方法處理的標記、指標、癥狀和/或狀況的發(fā)生率或者適當測量任何其它可測量的參數(shù)(例如腫瘤大小和/或生長)進行評估。效力還可通過住院治療或需要醫(yī)學干預(yù)(即，疾病的進展停止)評估個體不再惡化而測量。測量這些指標的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的和/或在本文得以描述。治療包括個體或動物(一些非限制性實例包括人或動物)中的疾病的任何治療，并包括：(1)抑制疾病，例如防止癥狀(例如疼痛或炎癥)的惡化；或(2)緩解疾病的嚴重程度，例如引起癥狀的復原。當該術(shù)語在本文中加以定義時，疾病治療的有效量是指在向有需要的患者給予時，足以對疾病產(chǎn)生有效治療的量。試劑的效力可以通過評估狀況或期望的應(yīng)答的物理指標(例如CTC水平)確定。通過測量此類參數(shù)的任一者或參數(shù)的任何組合來監(jiān)測給予和/或治療的效力完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)?？梢栽诒疚乃龅臓顩r的動物模型中評估效力，例如小鼠模型中的癌癥(例如胰腺癌)的治療。當使用實驗動物模型時，當觀察到標記(例如CTC水平改變)中的統(tǒng)計學上顯著的變化時，治療的效力被證實。

為了方便起見，在說明書、實施例和附加的權(quán)利要求書中使用的一些術(shù)語和短語的含義在如下提供。除非另有說明或從上下文中暗示得到，下列術(shù)語和短語包含下面所提供的含義。提供這些定義以幫助描述特定的實施方式，而并不打算限制所要求保護的發(fā)明，因為本發(fā)明的范圍僅通過權(quán)利要求書加以限定。除非另有定義，本文所使用的所有技術(shù)術(shù)語和科學術(shù)語具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員通常理解的含義相同的含義。如果在本領(lǐng)域中的術(shù)語的使用與本文所提供的定義之間存在明顯的差異，則以本說明書中提供的定義為準。

為了方便起見，本文在說明書、實施例和附加的權(quán)利要求書中使用的一些術(shù)語匯集在此處。

本文所使用的術(shù)語“減少”、“降低的”、“降低”或“抑制”都是指降低統(tǒng)計學上顯著的量。在一些實施方式中，“下降”、“降低”、“減少”或“抑制”通常是指與參照水平(例如，缺少給定的治療)相比減少至少10％，并且可以包括例如減少至少約10％、至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約35％、至少約40％、至少約45％、至少約50％、至少約55％、至少約60％、至少約65％、至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約98％、至少約99％、或更多。如本文所使用的“降低”或“抑制”并未涵蓋與參照水平相比的完全抑制或降低?！巴耆种啤笔桥c參照水平相比的100％的抑制。減少可以優(yōu)選下降至在沒有給定的紊亂的個體的正常范圍內(nèi)接受的水平。

本文所使用的術(shù)語“增加的/增高的”、“增加/增高”、“增強”或“激活/活化”都是指增加統(tǒng)計學上顯著的量。在一些實施方式中，術(shù)語“增加的/增高的”、“增加/增高”、“增強”或“激活/活化”可意味著與參照水平相比增加至少10％，例如增加至少約20％、或至少約30％、或至少約40％、或至少約50％、或至少約60％、或至少約70％、或至少約80％、或至少約90％或上至并包括100％的增加、或與參照水平相比的10-100％之間的任意增加、或者至少約2倍、或至少約3倍、或至少約4倍、或至少約5倍或至少約10倍的增加、或與參照水平相比的2倍至10倍之間的任意增加或更多。在標記或癥狀的語境下，“增加/增高”是以此類水平的統(tǒng)計學上的顯著增加/增高。

本文所使用的“受試者”是指人或動物。通常動物是脊椎動物，例如靈長類動物、嚙齒類動物、家養(yǎng)動物或狩獵動物。靈長類動物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴、以及獼猴例如恒河猴。嚙齒類動物包括小鼠、大鼠、旱獺、雪貂、兔和倉鼠。家養(yǎng)動物和狩獵動物包括奶牛；馬；豬；鹿；野牛；水牛；貓科動物，例如家貓；犬科動物，例如狗、狐貍、狼；鳥類，例如雞、鴯鹋、鴕鳥；以及魚類，例如鱒魚、鯰魚和鮭魚。在一些實施方式中，受試者是哺乳動物，例如靈長類動物，例如人。術(shù)語“個體”、“患者”和“受試者”在本文中可互換使用。

優(yōu)選地，受試者是哺乳動物。所述哺乳動物可以是人、非人靈長類動物、小鼠、大鼠、狗、貓、馬或奶牛，但不限于這些實例。除了人之外的哺乳動物可以有利地用作代表癌癥動物模型的受試者。受試者可以是雄性或雌性。

受試者可以是先前已被診斷或確認為患有或具有需要治療的狀況(例如癌癥)或者具有與此類狀況相關(guān)的一種或多種并發(fā)癥的受試者，并且可選地已經(jīng)接受對癌癥的治療或?qū)εc癌癥相關(guān)的一種或多種并發(fā)癥的治療?；蛘撸茉囌咭部梢允窍惹皼]有被診斷為具有癌癥或與癌癥相關(guān)的一種或多種并發(fā)癥的受試者。例如，受試者可以是顯示出癌癥的一個或多個風險因素或者顯示出與癌癥相關(guān)的一種或多種并發(fā)癥的一個或多個風險因素的受試者、或未顯示風險因素的受試者。

“需要”治療特定狀況的“受試者”可以是具有下述狀況的受試者：診斷為具有該狀況或診斷為具有發(fā)展出該狀況的風險。

本文所使用的術(shù)語“癌癥”或“腫瘤”是指干擾機體器官和系統(tǒng)的正常功能的不受控的細胞生長?；加邪┌Y或腫瘤的受試者是在受試者體內(nèi)存在客觀上可測量的癌細胞的受試者。這一定義中包括的是良性癌癥和惡性癌癥、以及休眠腫瘤或微轉(zhuǎn)移。從它們的起始位置遷移并播撒于要害器官的癌癥可通過受影響器官的功能退化而最終導致受試者死亡。

術(shù)語“試劑”通常是指通常不存在或者不以向細胞、組織或受試者給予的水平存在的任何實體。試劑可以從如下組中選擇，所述組包括但不限于：多核苷酸；多肽；小分子；以及抗體或其抗原結(jié)合片段。多核苷酸可以是RNA或DNA，并且可以是單鏈或雙鏈的，并且可以從如下組中選擇，所述組包括例如：編碼多肽的核酸和核酸類似物。多肽可以是但不限于：天然存在的多肽、突變的多肽或保留了感興趣的功能的多肽片段。試劑的進一步實例包括但不限于：核酸適體、肽-核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)、有機小分子或無機小分子；糖；寡糖；多糖；生物大分子、擬肽；核酸類似物和核酸衍生物；從生物材料如細菌、植物、真菌或者哺乳動物細胞或組織、以及天然存在的成分或合成的成分產(chǎn)生的提取物。試劑可以施用至培養(yǎng)基，在其中它接觸細胞并誘導其效果?；蛘?，試劑可以是胞內(nèi)的作為如下的結(jié)果：將編碼試劑的核酸序列導入細胞中，以及試劑的轉(zhuǎn)錄引起胞內(nèi)的核酸和/或蛋白的環(huán)境刺激的產(chǎn)生。在一些實施方式中，試劑是任何化學的實體或部分，包括但不限于合成和天然存在的非蛋白實體。在一些實施方式中，試劑是具有所選擇的化學部分的小分子，例如選自包含大環(huán)內(nèi)酯、來普霉素和它們的相關(guān)的天然產(chǎn)物或類似物在內(nèi)的未取代或取代的烷基部分、芳基部分或雜環(huán)基部分。試劑可以已知具有期望活性和/或特性、或可以從不同的化合物的庫中選擇。本文所使用的術(shù)語“小分子”可以指“天然產(chǎn)物樣”的化合物，然而，術(shù)語“小分子”并不限于“天然產(chǎn)物樣”化合物。相反，一般小分子的特征在于它含有數(shù)個碳-碳鍵，并具有大于約50道爾頓但小于約5000道爾頓(5kD)的分子量。優(yōu)選小分子具有小于3kD、更優(yōu)選小于2kD、最優(yōu)選小于1kD的分子量。在一些情況下，優(yōu)選小分子具有等于或小于700道爾頓的分子質(zhì)量。

適體是特異性地結(jié)合至各種分子靶標的短的合成的單鏈寡核苷酸，所述分子靶標例如小分子、蛋白、核酸、以及甚至細胞和組織。這些小核酸分子可以形成二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)，能夠特異性地結(jié)合蛋白或其它細胞靶標，并且實質(zhì)上是抗體的化學等價物。適體是高度特異性的，尺寸相當小，并且非免疫原性。適體通常通過稱為SELEX(指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化)的生物淘篩方法(Ellington等，Nature.1990，346(6287):818-822；Tuerk等，Science.1990，249(4968):505-510；Ni等，Curr Med Chem.2011，18(27):4206-14；以引用的方式將其整體并入本文)進行選擇。本領(lǐng)域公知產(chǎn)生對于任何給定靶標而言的適體的方法。在癌癥和HIV的小鼠模型中使用例如適體-siRNA嵌合體和適體靶向納米顆粒療法的臨床前研究非常成功(Ni等，Curr Med Chem.2011，18(27):4206-14)。

本文所使用的術(shù)語“蛋白”和“多肽”在本文中互換使用，以指定一連串的氨基酸殘基，所述氨基酸殘基通過在相鄰殘基的α-氨基基團和羧基基團之間的肽鍵相互連接。無論其大小或功能，術(shù)語“蛋白”和“多肽”是指氨基酸的聚合物，所述氨基酸包括經(jīng)修飾的氨基酸(例如，磷酸化、糖化、糖基化等)和氨基酸類似物?！暗鞍住焙汀岸嚯摹蓖ǔＳ脕碇副容^大的多肽，而術(shù)語“肽”通常用于指小的多肽，但是在本領(lǐng)域中這些術(shù)語的用法重疊。當指基因產(chǎn)物及其片段時，術(shù)語“蛋白”和“多肽”在本文中互換使用。因此，示例性的多肽或蛋白包括基因產(chǎn)物、天然存在的蛋白、同源物、直系同源物、旁系同源物、片段和上述物質(zhì)的其它等同物、變型、片段和類似物。

本文所使用的術(shù)語“核酸”或“核酸序列”是指并入核糖核酸、脫氧核糖核酸或它們的類似物的單元的任何分子，優(yōu)選聚合分子。核酸可以是單鏈或雙鏈的。單鏈核酸可為變性的雙鏈DNA的一條核酸鏈?；蛘撸瑔捂満怂峥蔀椴⒎茄苌匀魏坞p鏈DNA的單鏈核酸。在一個方面，核酸可以是DNA。在另一方面，核酸可以是RNA。合適的核酸分子是DNA、包括基因組DNA或cDNA。其它合適的核酸分子是RNA、包括mRNA。

本文所使用的術(shù)語“治療(treat/treatment/treating)”或“減輕”是指治療劑治療，其中，目的是逆轉(zhuǎn)、緩解、減輕、抑制、減緩或停止與疾病或紊亂(例如癌癥)相關(guān)的狀況的進展或嚴重程度。術(shù)語“治療”包括降低或緩解與癌癥相關(guān)的狀況、疾病或紊亂的至少一種不利影響或癥狀。如果一種或多種癥狀或臨床標記減少，則治療通常是“有效”的?；蛘?，如果疾病的進展減弱或停止，則治療是“有效”的。也就是說，“治療”不僅包括癥狀或標記的改善，還包括與未進行治療時所預(yù)期的情況相比癥狀的進展或惡化中止或至少減緩。有益或期望的臨床結(jié)果(無論可測定或不可測定)包括但不限于：緩解一種或多種癥狀、減小疾病程度、穩(wěn)定疾病狀態(tài)(即，不惡化)、延遲或減緩疾病進展、減輕或減緩疾病狀態(tài)、緩和(部分或全部)、和/或減少死亡率。術(shù)語“治療”疾病還包括提供疾病的癥狀或副作用的舒解(包括姑息治療)。

本文所使用的術(shù)語“藥物組合物”是指與藥學上可接受的載體(例如在制藥工業(yè)中常用的載體)組合的活性試劑。本文采用的短語“藥學上可接受的”是指下述化合物、材料、組合物和/或劑型：在合理的醫(yī)學判斷范圍內(nèi)，適于與人類和動物的組織接觸而無過度的毒性、刺激、過敏反應(yīng)或其它問題或并發(fā)癥，與合理的收益/風險比相匹配。

本文所使用的術(shù)語“給予”是指通過一定的方法或途徑向受試者中放置本文所公開的化合物，使得至少將試劑部分遞送至期望部位。含有本文所公開的化合物的藥物組合物可以通過任何適當?shù)耐緩浇o予，從而在受試者中產(chǎn)生有效的治療。

術(shù)語“統(tǒng)計上顯著”或“顯著地”是指統(tǒng)計顯著性，并且通常是指2個標準差(2SD)或更大的差異。

除了在操作實施例中或另有指示以外，本文所使用的表示成分的量或反應(yīng)條件的所有數(shù)字均應(yīng)理解為在所有情況下均由術(shù)語“約”加以修飾。術(shù)語“約”在與百分比連接使用時可以表示±1％。

本文所使用的術(shù)語“包含”或“包括”是指對于方法或組合物而言必不可少的組成、方法及其各自的成分，對于包含未指定的要素(無論是必要的要素或是非必要的要素)而言也是開放性的。

術(shù)語“由……組成”是指本文所述的組合物、方法及其各自的成分，排除了任何在實施方式的描述中未列舉的要素。

本文所使用的術(shù)語“基本上由……組成”是指對于給定的實施方式而言所需的要素。該術(shù)語允許存在實質(zhì)上不會影響實施方式的基本和新穎的或功能性的特性的要素。

除非上下文另有明確指示，單數(shù)術(shù)語“一/該/所述(a/an/the)”包括復數(shù)的指示對象。類似地，除非上下文另有明確指示，詞語“或”意在包括“和”。盡管與本文描述的相似或相當?shù)姆椒ê筒牧峡捎糜诒竟_的實踐或試驗中，在下文中對合適的方法和材料進行了描述?？s寫“例如(e.g.)”源自拉丁文的例如(exempli gratia)，并且在本文中用于表示非限制性的實例。因此，縮寫“e.g.”與術(shù)語“例如(for example)”同義。

細胞生物學和分子生物學中的常用術(shù)語的定義可以在下述文獻中找到：“The Merck Manual of Diagnosis and Therapy”，第19版，Merck Research Laboratories出版，2006(ISBN 0-911910-19-0)；Robert S.Porter等(編)，The Encyclopedia of Molecular Biology，Blackwell Science Ltd.出版，1994(ISBN 0-632-02182-9)；Benjamin Lewin，Genes X，Jones&Bartlett Publishing出版，2009(ISBN-10：0763766321)；Kendrew等(編)，Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference，VCH Publishers，Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)；以及Current Protocols in Protein Sciences 2009，Wiley Intersciences，Coligan等編。

除非另有說明，本發(fā)明采用在以下文獻中描述的標準程序來實施，例如：Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第4版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，USA(2012)；Davis等，Basic Methods in Molecular Biology，Elsevier Science Publishing Inc.，New York,USA(1995)；或Methods in Enzymology:Guide to Molecular Cloning Techniques 152卷，S.L.Berger和A.R.Kimmel編，Academic Press Inc.，San Diego，USA(1987)；Current Protocols in Protein Science(CPPS)(John E.Coligan等編，John Wiley and Sons，Inc.)；Current Protocols in Cell Biology(CPCB)(Juan S.Bonifacino等編，John Wiley and Sons，Inc.)；以及Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique，R.Ian Freshney著，Wiley-Liss出版，第5版(2005)；Animal Cell Culture Methods(Methods in Cell Biology，57卷，Jennie P.Mather和David Barnes編，Academic Press，第1版，1998)，以引用的方式將其整體并入本文。

本文在對本發(fā)明各個方面的描述中對其它術(shù)語進行定義。

出于描述和公開的目的，將本申請全文中引用的所有專利和其它出版物(包括文字出版物、發(fā)行的專利、公開的專利申請和同時待審的專利申請)以引用的方式明確地并入本文，例如，在此類出版物中描述的可與本文描述的技術(shù)關(guān)聯(lián)使用的方法學。這些出版物僅由于它們的公開早于本申請的申請日而提供。在這一方面，不應(yīng)當視作承認了本發(fā)明人沒有權(quán)利借助于先前的發(fā)明或因為任何其它原因而將此類公開內(nèi)容提前。所有關(guān)于這些文件的日期的聲明或關(guān)于這些文件的內(nèi)容的表述是基于申請人可獲得的信息，并不構(gòu)成關(guān)于這些文件的日期或內(nèi)容的正確性的任何承認。

對本公開的實施方式的描述并非旨在進行窮舉或?qū)⒈竟_限制為所公開的明確的形式。盡管本文中出于說明性目的描述了本公開的具體實施方式和實施例，然而正如相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解的，可在本公開的范圍內(nèi)進行各種等同修改。例如，當在給定的順序中給出了方法步驟或功能時，替代的實施方式能夠以不同的順序執(zhí)行功能、或可以實質(zhì)上同時執(zhí)行功能。本文所提供的本公開的教導可以施用至其它適當?shù)某绦蚧蚍椒ā１疚乃龅母鞣N實施方式可以組合以提供進一步的實施方式。如果需要的話，可對本公開的方面進行修改，以采用上述參考文獻和應(yīng)用的組合、功能和構(gòu)思，從而提供本公開的進一步的實施方式。此外，由于生物功能對等性的考慮，可以在種類或數(shù)量上對蛋白結(jié)構(gòu)進行不影響生物或化學作用的一些改變。根據(jù)詳細的說明書的啟示，可以對本公開作出這些改變和其它改變。所有這些修飾都旨在包含于所附的權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。

可將任何上述實施方式中的特定要素與其它實施方式中的要素組合或置換。此外，盡管在這些實施方式的上下文中已經(jīng)描述了與本公開的一些實施方式相關(guān)的優(yōu)點，然而其它實施方式也可以表現(xiàn)出此類優(yōu)點，并且，并非所有的實施方式都必須表現(xiàn)出這樣的優(yōu)點才能落入本公開的范圍之內(nèi)。

本文所描述的技術(shù)通過以下實施例進行進一步說明，而不應(yīng)被解釋為進行了進一步的限定。

本文所述的技術(shù)的一些實施方式可以根據(jù)下列編號段落的任何一段進行定義：

1.一種檢測樣本中的循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)的方法，所述方法包括：

測量所述樣本中的PC-CTC標記基因表達產(chǎn)物的水平；以及

如果檢測到的所述標記基因表達產(chǎn)物的水平高于參比水平，則確定存在PC-CTCs。

2.如段落1所述的方法，其中，所述CTCs為胰腺癌CTCs。

3.如段落1-2中任一段所述的方法，其中，所述方法進一步包括從所述樣本中分離所述CTCs的第一步驟。

4.如段落1-3中任一段所述的方法，其中，所述表達產(chǎn)物為核酸。

5.如段落4所述的方法，其中，利用選自于由如下所組成的組中的方法對所述表達產(chǎn)物的水平進行確定：RT-PCR；定量RT-PCR；Northern印跡；基于微陣列的表達分析；下一代測序以及RNA原位雜交。

6.如段落1-3中任一段所述的方法，其中，所述表達產(chǎn)物為多肽。

7.如段落6所述的方法，其中，利用選自于由如下所組成的組中的方法對所述表達產(chǎn)物的水平進行確定：Western印跡；免疫沉淀；酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)；放射性免疫測定法(RIA)；夾心測定法；熒光原位雜交(FISH)；免疫組織學染色；放射性免疫分析測定法；免疫熒光測定法；質(zhì)譜法；FACS以及免疫電泳測定法。

8.如段落1-7中任一段所述的方法，其中，所述CTC標記基因選自表7、表8或表14。

9.如段落1-8中任一段所述的方法，其中，所述CTC標記基因選自于由如下所組成的組：ABI3BP；ADAMTS5；ADAMTSL1；ANG；ARSA；C1RL；C3；C4A；C4B；CCDC80；CD109；CHI3L1；CLEC3B；CMTM3；CMTM7；COL14A1；COL1A2；COL3A1；COL4A6；CSF1；DAG1；DCN；DMKN；FBLN1；FGF1；FMOD；GPC3；GPC4；HMGB1；IFNAR2；IGFBP5；IL16；LAMA4；LTBP4；MFAP1A；NID2；OGN；PDAP1；PF4；PLAT；PODN；PRELP；RSPO1；SERPING1；SLURP1；SOD3；SPARC；SPOCK2；SPON2；SULF1；SULF2；TGFB2；TGM2；THBD；THBS1；THSD4；TIMP2；TNXB；TPT1；TWSG1和WNT4。

10.如段落1-8中任一段所述的方法，其中，所述CTC標記基因選自于由如下所組成的組：ALDH1A1；ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；DCN；SPARC；WNT；TGFB2；VEGF；COL1A2；COL3A1和TIMP2。

11.如段落1-9中任一段所述的方法，其中，所述CTC標記基因選自于由如下所組成的組：ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；DCN和SPARC。

12.如段落1-9中任一段所述的方法，其中，所述CTC標記基因選自于由如下所組成的組：ALDH1A2；IGFBP5；KLF4和DCN。

13.如段落1-9中任一段所述的方法，其中，所述CTC標記基因選自于由如下所組成的組：TPT1；HMGB1；SPON 2；SPARC和ARSA。

14.如段落1-9中任一段所述的方法，其中，所述CTC標記基因選自于由如下所組成的組：IL6ST；ARSA；TIMP2；CD55；SULF2；ITGA6；SDC4；CDON和SV2A。

15.一種對受試者中的癌癥進行治療的方法，所述方法包括：向所述受試者給予治療有效量的CTC標記基因靶向治療劑。

16.如段落15所述的方法，其中，所述癌癥為胰腺癌。

17.如段落15-16中任一段所述的方法，其中，所述CTC標記基因靶向治療劑包括CTC標記基因的抑制劑。

18.如段落17所述的方法，其中，所述抑制劑為抗體試劑。

19.如段落17所述的方法，其中，所述抑制劑為抑制性核酸試劑。

20.如段落15-19中任一段所述的方法，其中，所述CTC標記基因靶向治療劑包括CTC標記基因結(jié)合抗體試劑和化療劑。

21.如段落15-20中任一段所述的方法，其中，所述受試者為被確定具有升高水平的存在于血液和/或癌間質(zhì)中的CTC標記基因和/或升高水平的CTCs的受試者。

22.如段落15-21中任一段所述的方法，其中，所述CTC標記基因靶向治療劑包括CTC標記基因結(jié)合抗體試劑，所述CTC標記基因結(jié)合抗體試劑結(jié)合選自于由如下所組成的組中的標記基因：IL6ST、SULF2和SV2A。

23.一種確定受試者是否有可能對CTC標記基因靶向治療劑的治療作出響應(yīng)的方法，所述方法包括：

對存在于血液和/或癌間質(zhì)中的CTC標記基因表達產(chǎn)物的水平進行測量；以及

如果與參比水平相比，所述表達產(chǎn)物的水平升高，則確定受試者有可能對所述治療作出響應(yīng)。

24.如段落23所述的方法，其中，所述方法進一步包括從所述樣本中分離所述CTCs的第一步驟。

25.如段落23-24中任一段所述的方法，其中，所述癌癥為胰腺癌。

26.如段落23-25中任一段所述的方法，其中，所述表達產(chǎn)物為核酸。

27.如段落26所述的方法，其中，利用選自于由如下所組成的組中的方法對所述表達產(chǎn)物的水平進行確定：RT-PCR；定量RT-PCR；Northern印跡；基于微陣列的表達分析；下一代測序以及RNA原位雜交。

28.如段落23-26中任一段所述的方法，其中，所述表達產(chǎn)物為多肽。

29.如段落28所述的方法，其中，利用選自于由如下所組成的組中的方法對所述表達產(chǎn)物的水平進行確定：Western印跡；免疫沉淀；酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)；放射性免疫測定法(RIA)；夾心測定法；熒光原位雜交(FISH)；免疫組織學染色；放射性免疫分析測定法；免疫熒光測定法；質(zhì)譜法；FACS以及免疫電泳測定法。

30.如段落23-29中任一段所述的方法，其中，所述PC-CTC標記基因選自表7、表8或表14。

31.如段落23-30中任一段所述的方法，其中，所述CTC標記基因選自于由如下所組成的組：ABI3BP；ADAMTS5；ADAMTSL1；ANG；ARSA；C1RL；C3；C4A；C4B；CCDC80；CD109；CHI3L1；CLEC3B；CMTM3；CMTM7；COL14A1；COL1A2；COL3A1；COL4A6；CSF1；DAG1；DCN；DMKN；FBLN1；FGF1；FMOD；GPC3；GPC4；HMGB1；IFNAR2；IGFBP5；IL16；LAMA4；LTBP4；MFAP1A；NID2；OGN；PDAP1；PF4；PLAT；PODN；PRELP；RSPO1；SERPING1；SLURP1；SOD3；SPARC；SPOCK2；SPON2；SULF1；SULF2；TGFB2；TGM2；THBD；THBS1；THSD4；TIMP2；TNXB；TPT1；TWSG1和WNT4。

32.如段落23-31中任一段所述的方法，其中，所述CTC標記基因選自于由如下所組成的組：ALDH1A1；ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；DCN；SPARC；WNT；TGFB2；VEGF；COL1A2；COL3A1和TIMP2。

33.如段落23-31中任一段所述的方法，其中，所述CTC標記基因選自于由如下所組成的組：ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；DCN和SPARC。

34.如段落23-31中任一段所述的方法，其中，所述CTC標記基因選自于由如下所組成的組：ALDH1A2；IGFBP5；KLF4和DCN。

35.如段落23-31中任一段所述的方法，其中，所述CTC標記基因選自于由如下所組成的組：TPT1；HMGB1；SPON 2；SPARC和ARSA。

36.如段落23-31中任一段所述的方法，其中，所述CTC標記基因選自于由如下所組成的組：IL6ST；ARSA；TIMP2；CD55；SULF2；ITGA6；SDC4；CDON和SV2A。

37.一種監(jiān)測對受試者進行的治療的方法，所述方法包括：

向有需要的受試者給予癌癥治療劑；

對存在于血液和/或癌間質(zhì)中的CTC標記基因表達產(chǎn)物的水平進行測量；以及

如果與參比水平相比，CTC標記基因表達產(chǎn)物的水平降低，則確定受試者作出響應(yīng)，而如果與參比水平相比，CTC標記基因表達產(chǎn)物未降低，則確定受試者不對所述治療作出響應(yīng)。

38.如段落37所述的方法，其中，所述癌癥為胰腺癌。

39.如段落37-38中任一段所述的方法，其中，所述參比水平為給予步驟之前的患者中的所述基因表達產(chǎn)物的水平。

40.如段落37-39中任一段所述的方法，其中，所述方法進一步包括從所述樣本中分離所述CTCs的第一步驟。

41.如段落37-40中任一段所述的方法，其中，所述表達產(chǎn)物為核酸。

42.如段落41所述的方法，其中，利用選自于由如下所組成的組中的方法對所述表達產(chǎn)物的水平進行確定：RT-PCR；定量RT-PCR；Northern印跡；基于微陣列的表達分析；下一代測序以及RNA原位雜交。

43.如段落37-40中任一段所述的方法，其中，所述表達產(chǎn)物為多肽。

44.如段落43所述的方法，其中，利用選自于由如下所組成的組中的方法對所述表達產(chǎn)物的水平進行確定：Western印跡；免疫沉淀；酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)；放射性免疫測定法(RIA)；夾心測定法；熒光原位雜交(FISH)；免疫組織學染色；放射性免疫分析測定法；免疫熒光測定法；質(zhì)譜法；FACS以及免疫電泳測定法。

45.如段落37-44中任一段所述的方法，其中，所述PC-CTC標記基因選自表7、表8或表14。

46.如段落37-45中任一段所述的方法，其中，所述CTC標記基因選自于由如下所組成的組：ABI3BP；ADAMTS5；ADAMTSL1；ANG；ARSA；C1RL；C3；C4A；C4B；CCDC80；CD109；CHI3L1；CLEC3B；CMTM3；CMTM7；COL14A1；COL1A2；COL3A1；COL4A6；CSF1；DAG1；DCN；DMKN；FBLN1；FGF1；FMOD；GPC3；GPC4；HMGB1；IFNAR2；IGFBP5；IL16；LAMA4；LTBP4；MFAP1A；NID2；OGN；PDAP1；PF4；PLAT；PODN；PRELP；RSPO1；SERPING1；SLURP1；SOD3；SPARC；SPOCK2；SPON2；SULF1；SULF2；TGFB2；TGM2；THBD；THBS1；THSD4；TIMP2；TNXB；TPT1；TWSG1和WNT4。

47.如段落37-46中任一段所述的方法，其中，所述CTC標記基因選自于由如下所組成的組：ALDH1A1；ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；DCN；SPARC；WNT；TGFB2；VEGF；COL1A2；COL3A1和TIMP2。

48.如段落37-46中任一段所述的方法，其中，所述CTC標記基因選自于由如下所組成的組：ALDH1A2；IGFBP5；KLF4；DCN和SPARC。

49.如段落37-46中任一段所述的方法，其中，所述CTC標記基因選自于由如下所組成的組：ALDH1A2；IGFBP5；KLF4和DCN。

50.如段落37-46中任一段所述的方法，其中，所述CTC標記基因選自于由如下所組成的組：TPT1；HMGB1；SPON 2；SPARC和ARSA。

51.如段落37-46中任一段所述的方法，其中，所述CTC標記基因選自于由如下所組成的組：IL6ST；ARSA；TIMP2；CD55；SULF2；ITGA6；SDC4；CDON和SV2A。

實施例

實施例1：小鼠胰腺循環(huán)腫瘤細胞的單細胞RNA測序表明其表達ECM蛋白

循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)從原發(fā)腫瘤脫落進入血流中，介導癌癥血源性擴散至遠端器官。利用胰腺癌小鼠模型，將微流體裝置施用至不依賴于腫瘤表位而分離CTCs，并使CTCs進行單細胞RNA測序。CTC成簇為多個子類，與原發(fā)腫瘤和癌細胞系不同。盡管增殖指征通常較低，然而CTCs富集MAPK以及WNT、TGF-β、神經(jīng)營養(yǎng)因子、Toll樣受體和B細胞受體信號轉(zhuǎn)導通路。CTCs高度富集干細胞相關(guān)基因Aldh1a2的表達。Igfbp5和Klf4的實質(zhì)上普遍的表達與定位至上皮/間質(zhì)邊界的原發(fā)腫瘤細胞的子類相關(guān)，與CTCs中的上皮和間充質(zhì)標記的同時存在相一致。間質(zhì)衍生的胞外基質(zhì)蛋白(包括Dcn和Sprc)的非常高的CTC表達表明微環(huán)境促進轉(zhuǎn)移并識別出預(yù)料不到的治療靶標。

引言

胰腺導管腺癌(PDAC)是美國第四大癌癥死亡誘因，具有6％的五年總存活率(Society，2013)。該癌癥的高死亡率源于腫瘤細胞快速傳播導致的廣泛轉(zhuǎn)移。甚至在早期PDAC中，局部的組織和淋巴侵襲也是明顯的，存在于血流中的循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)最終導致癌癥擴散至遠端器官。CTCs極為罕見，估計1毫升血液的一百億正常血細胞中有1到10個腫瘤細胞。就這一點而言，其分離和分子分析具有明顯的技術(shù)挑戰(zhàn)(Pantel等，2008；Yu等，2011)。鑒于其在血源性轉(zhuǎn)移中的作用，CTC群體可能富集用于轉(zhuǎn)移前體，并且對其分析可識別潛在的治療靶標，且為胰腺癌的早期檢測提供機會。

遺傳學上工程化的小鼠胰腺癌模型為該疾病的進展提供了重要理解。特別地，遺傳學上工程化的LSL-Kras^G12D、Trp53^{flox/flox或+}和Pdx1-Cre(KPC)小鼠模型囊括了從腫瘤發(fā)生前的胰腺內(nèi)上皮瘤樣(Pan1N)病變到侵襲性癌的組織學進展(Bardeesy等，2006)。最近的研究表明，在該模型中上皮-至-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)發(fā)生在早期，可能增強了腫瘤的侵襲性(Rhim等，2012)。在小鼠胰腺CTCs的初始分子表征中，進行CTC富集群體的RNA測序，從而識別出作為復發(fā)事件的非典型WNT信號轉(zhuǎn)導的活化，有可能有助于循環(huán)上皮細胞的抗失巢凋亡(Yu等，2012)。在該研究中，結(jié)合匹配的白細胞RNA讀數(shù)的數(shù)字減影(digital subtraction)，利用單分子RNA測序完成對純化的CTC群體的分析，從而推導出CTC富集的表達指征。然而，此類部分純化的細胞群體的轉(zhuǎn)錄組學分析受限于最大差異化表達的基因的覆蓋深度，并且塊狀CTC群體的此類研究并不能解決此類知之甚少的細胞群體的異質(zhì)性程度。

為了獲得單細胞水平的CTCs的深度RNA測序譜，使用新型慣性聚集增強裝置(inertial focusing-enhanced device)CTC-iChip，該裝置使得能夠?qū)φＱ毎M行高效負性耗竭，在溶液中留下未附著的CTCs，從而在該處能夠?qū)TCs作為單細胞進行選擇和分析(Ozkumur等，2013)。通過避免腫瘤表位特異性捕獲(例如靶向上皮標記EpCAM)，CTC-iChip在分離同時具有上皮和間充質(zhì)特征的癌細胞方面是無偏的。進而，從活的、不帶標簽的CTCs純化高質(zhì)量的RNA特別適用于詳細的轉(zhuǎn)錄組學分析。最后，使用胰腺癌小鼠模型使得能夠?qū)υl(fā)腫瘤和CTCs進行同步研究，而不同動物間的共享的驅(qū)動突變促進了對CTC特異的異質(zhì)性的識別。本文所述的為單細胞水平的CTCs的全面轉(zhuǎn)錄組學分析，表明CTC群體內(nèi)的不同的細胞子類、CTCs中富集的信號轉(zhuǎn)導通路并識別出獨特的CTC標記和診斷靶標。

結(jié)果

小鼠胰腺CTCs的分離。本文所述的實驗中使用被直接施用于全血試樣以分離CTCs的整合的微流體細胞分離平臺CTC-iChip(Ozkumur等，2013)。CTC-iChip將基于初始的流體力學大小的全部有核細胞(白細胞(WBC)和CTCs)與血紅細胞、血小板和血漿的分離結(jié)合隨后的單個流線內(nèi)的有核細胞慣性聚集，以實現(xiàn)高效的線內(nèi)(in-line)磁分選。雖然腫瘤表位是高度可變的，但是WBC細胞表面標記已被完善建立；向這一高通量微流體細胞分離裝置施用磁性綴合的抗WBC抗體能夠由此排除絕大多數(shù)的WBC，以暴露出少量的不帶標簽的CTCs(圖1A)。CTC-iChip被改造用于鼠科造血細胞的耗竭，并施加至KPC胰腺癌小鼠模型。該PDAC模型生成顯著數(shù)量的CTCs(Rhim等，2012；Yu等，2012)。每WBC使用100個抗CD45珠對全血進行標記，實現(xiàn)在正常小鼠、荷載正位腫瘤的小鼠和遺傳學上工程化的KPC小鼠中>10³的耗竭(圖1B和圖4A-圖4C)。

利用加入至小鼠全血的帶有GFP標簽的NB508小鼠胰腺癌細胞，并使其通過CTC-iChip處理，以平均值的95％(±3％std)測量CTC的回收(圖4A-圖4C)。NB508細胞為之前從相同的Kras/Trp53-驅(qū)動的KPC小鼠模型生成的胰腺瘤中產(chǎn)生(Bardeesy等，2006)。作為比較，對于相同細胞，使用基于小鼠CTCs的抗EpCAM捕獲物的替代的微流體平臺僅能實現(xiàn)的35％的回收(Yu等，2012)。在所測試的全部三只小鼠中，對衍生自帶有GFP標簽的NB508細胞胰腺接種的正位腫瘤施用CTC-iChip，產(chǎn)生>1000CTCs/mL(圖4A-圖4C)。最后，用遺傳學上工程化的KPC模型對CTC-iChip進行測試，隨后對分離的細胞進行上皮標記廣譜細胞角蛋白(CK)vs.白細胞標記CD45的雙重免疫熒光染色，顯示出中位數(shù)為118CTCs/mL(平均429CTCs/mL，范圍0-1649)(圖1C)。從7只健康對照小鼠中未分理出CK陽性細胞。在微流體裝置中不能偏轉(zhuǎn)的大部分CD45陽性細胞在其表面保留了一些免疫磁珠。因此，在CTC-iChip產(chǎn)物中易于將CTCs與WBCs進行區(qū)分，使得能夠在不需要對上皮特異性細胞表面表位(例如EpCAM)進行染色的條件下進行單細胞操作。

單CTC RNA測序。五只荷瘤的KPC小鼠產(chǎn)生總共168個單個CTCs，使其經(jīng)受改造的初始cDNA擴增和文庫方案(Tang等，2010)，并對RNA質(zhì)量(Gapdh，Actb)、胰腺標記(Krt8、Krt18、Krt19、Pdx1)的存在和WBC標記(Cd45/Ptprc)的缺乏進行篩選(圖5A-圖5C)。其中，75個(45％)具有足夠進行進一步擴增和文庫構(gòu)建從而實施下一代測序的質(zhì)量。值得注意的是，候選CTCs的大部分(55％)表現(xiàn)出形態(tài)完好，然而具有降解的RNA。這些細胞可能代表血流中喪失活力的腫瘤細胞。鑒于對來自小鼠模型的血液樣本的快速處理，微流體裝置中的最小的剪切條件，以及經(jīng)同樣處理的對照細胞的保留的RNA質(zhì)量，細胞不太可能在體外純化過程中經(jīng)歷此類損傷。為與胰腺CTCs進行比較，還對來自對照小鼠的12個WBCs、來自小鼠NB508胰腺癌細胞系的16個單細胞以及12個小鼠胚胎成纖維細胞(MEFs)進行單細胞RNA測序。來自NB508和MEF培養(yǎng)物的超過90％的單細胞滿足測序質(zhì)量的標準，突出顯示了在相同條件下具有受損的RNA模板的CTCs的高頻率。為了比較CTC譜與CTC分離時收集的匹配的親代腫瘤的譜，將來自各原發(fā)腫瘤的塊狀RNA(bulk RNA)稀釋至1或10細胞當量(10pg或100pg RNA)，并經(jīng)受相同的擴增和RNA測序方案(n＝34；來自4個匹配腫瘤的至少8個重復)。

單細胞RNA測序表現(xiàn)對于全部的經(jīng)分析的樣本而言是可比的，具有平均440-850萬的讀數(shù)，其中平均46％-61％被特有地與基因組比對(圖5A-圖5C)。使用UCSC已知基因轉(zhuǎn)錄組參考對基因組比對的讀數(shù)進行注釋和計數(shù)，并以每百萬讀數(shù)(RPM)進行歸一化。隨后通過非監(jiān)督分級聚類分析經(jīng)歸一化的讀數(shù)(數(shù)據(jù)未示出)。來自MEFs、NB508胰腺癌細胞系和正常的WBCs的單細胞轉(zhuǎn)錄組緊密地成簇，支持了RNA測序策略的分析可靠性。識別出候選CTCs的五個不同的簇，全部與匹配的原發(fā)腫瘤序列以及癌癥衍生的細胞系不同。主成分分析表明這些不同的組的組間關(guān)系和成簇(圖2)。

KPC小鼠模型中的PDAC的一致的遺傳驅(qū)動物使得能夠?qū)ρ苌詡€體小鼠和不同小鼠間的CTCs中的細胞異質(zhì)性進行定量測量。通過計算簇內(nèi)相關(guān)系數(shù)來評估各CTC簇內(nèi)的單細胞異質(zhì)性，其中，較低的相關(guān)系數(shù)反應(yīng)出較高的異質(zhì)性(圖5A-圖5C)。正如所期望的，與從NC508癌細胞系衍生的單細胞(平均0.86，95％CI，0.80-0.91，p值1.2×10^-15)相比，CTC簇顯示出相當高的異質(zhì)性(平均0.42，95％CI，0.36-0.47)。為了評估原發(fā)PDAC內(nèi)的細胞的異質(zhì)性，將條件性Tomato/EGFP(mT/mG)表達標記(Muzumdar等，2007)與KPC小鼠雜交，從而生成帶有品系標簽的小鼠腫瘤(KPC-mT/mG)，可將其用于從污染的間質(zhì)細胞中分離出單個EGFP陽性的原發(fā)腫瘤細胞。將原發(fā)腫瘤(TuGMP3)分解為單細胞懸液，并使20個EGFP陽性細胞接受RNA測序。單個原發(fā)腫瘤細胞被很好地成簇于之前分析的塊狀腫瘤物質(zhì)內(nèi)(數(shù)據(jù)未示出)，并具有類似于CTCs的異質(zhì)性得分(平均0.38，95％CI，0.28-0.47)(p值0.49)。

總之，本文所述的為對無陽性篩選偏倚分離的小鼠胰腺CTCs、親代腫瘤、所建立的基因型匹配的癌細胞系、MEFs和WBCs進行單細胞RNA測序。CTCs與原發(fā)腫瘤(塊狀腫瘤和分離的單細胞均是)以及腫瘤衍生的細胞系分別成簇，CTCs和原發(fā)腫瘤細胞之間具有可相比程度的的細胞間異質(zhì)性。

胰腺CTCs子類的界定。為了對候選CTCs進行識別和分類，向全部的成簇的樣本施加已知的上皮、造血和內(nèi)皮標記的基因集合。如所期望的，上皮標記(Krt7、Krt8、Krt18、Krt19、Epcam、Egfr、Cdh1)在原發(fā)胰腺腫瘤和癌細胞系NB508中高表達，在非上皮的MEFs和正常的WBCs中幾乎不存在(數(shù)據(jù)未示出)。與此相比，造血標記(Ptprc/Cd45、Csf3r/Cd114、Cd14、Fcgr3/Cd16、Itga2b/Cd41、Itgb3/Cd61)存在于正常的WBCs中，而在NB508和MEFs中不存在。在塊狀原發(fā)腫瘤樣品中可檢測到造血標記的一些表達，這與白細胞浸潤的不同程度相一致?；谔卣餍詷擞浀谋磉_(Cdh5/Cd144、Vwf、Thbd/Cd141、Pecam1/Cd31、Mcam/Cd146、Sele/E-選擇蛋白、Cd34)以及上皮和造血標記的不存在，未識別出特異性的內(nèi)皮細胞簇。

使用上皮、造血和內(nèi)皮標記對通過來自荷瘤的小鼠CD45耗竭分離的單細胞進行研究，顯示五個主要的候選CTC群體(簇1、簇3、簇4、簇5和簇9，數(shù)據(jù)未示出)。簇3、簇4和簇5全部為更大群體的一部分，顯示出上皮標記的強力表達，這與“典型”CTCs(標示為CTC-c)相一致。這些細胞的一個子類表達Cd34(其為內(nèi)皮祖細胞標記，也見于包括MEFs在內(nèi)的間充質(zhì)細胞(數(shù)據(jù)未示出)和間質(zhì)細胞中(Krause等，1994))，然而不存在其它特征性的內(nèi)皮系標記。簇1和簇9更復雜，前者值得注意的是血小板標記CD41(Itga2b)和CD61(Itgb3)的富集(因此標示為CTC-plt)；而后者具有突出的細胞增殖指征(CTC-pro)。

為了更好地界定各候選CTC簇的特征，使用包括秩生成(rank product，RP)方法在內(nèi)的非參數(shù)的差異化基因表達分析，所述秩生成(RP)方法適應(yīng)于絕對轉(zhuǎn)錄物水平的改變和代表細胞至細胞間的轉(zhuǎn)錄組方面的差異(Breitling等，2004)。設(shè)定非常嚴格的參數(shù)(FDR≤0.01)，原發(fā)腫瘤vs.WBCs中的對照比較識別出腫瘤中相對過表達的927個基因和WBCs中高表達的293個基因(包括所期望的上皮腫瘤標記角蛋白7、角蛋白8、角蛋白18和角蛋白19相對于白細胞特異性CD45的差異表達(數(shù)據(jù)未示出))?！暗湫汀钡腃TC-c簇與WBCs的比較也顯示出CTCs中的細胞角蛋白18、細胞角蛋白19以及WBCs中的CD45的富集，確證了RP方法對單細胞群體間相對差異化表達的基因的識別。

作為最豐富的CTC簇，CTC-c包含滿足上皮腫瘤細胞建立標準的75個細胞中的41個(55％)(相較于CTC-plt：32％；CTC-pro：13％)。值得注意的是，僅具有多發(fā)性大規(guī)模轉(zhuǎn)移的小鼠(MP7)具有處于該類別內(nèi)的大量的CTCs。與匹配的原發(fā)腫瘤相比，CTC-c細胞具有表達升高的878個轉(zhuǎn)錄物以及表達降低的774個基因(表2)。CTC-c富集的基因的基因本體(GO)分析(表3)表明富集與如下相關(guān)的指征：細胞與環(huán)境信號相互作用(GO:0045785—細胞粘附的正向調(diào)節(jié)；GO:0048584—刺激應(yīng)答的正向調(diào)節(jié))、細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)(GO:0030036—肌動蛋白細胞骨架組建；GO:0060429—上皮細胞發(fā)育)以及轉(zhuǎn)錄狀態(tài)(GO:0045449—轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)；GO:0051276—染色體組建)。為了評估CTC-c細胞中通過外部刺激激活的信號轉(zhuǎn)導通路的貢獻，利用KEGG數(shù)據(jù)庫對富集的基因進行注釋(表1)。類似地，京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路分析顯示出在黏著斑(讓步比[OR]2.7，q值6.7 3 10.4)和肌動蛋白細胞骨架的調(diào)節(jié)(OR 2.4，q值0.005)方面富集。尤其是，在所注釋的KEGG信號通路中，促分裂素原激活的蛋白激酶(MAPK)通路最為富集。最有代表性的是MAPK通路(OR 2.2，q值0.006)；MAPK信號轉(zhuǎn)導已在Kras^G12D驅(qū)動的原發(fā)腫瘤中被激活。然而，雖然與CTCs相比，MSigDB Kras依賴性指征在原發(fā)腫瘤中富集，CTCs具有增高的Braf、Mras和Rras2表達，表明CTCs中的進一步激活MAPK的替代通路。這一發(fā)現(xiàn)與使用基于微陣列的方法識別出MAPK通路在胰腺CTCs中最高度富集的另一研究一致(Sergeant等，2012)。

CTC富集的基因也具有完善建立的涉及轉(zhuǎn)移的信號轉(zhuǎn)導通路的代表，包括TGF-β(Ikushima和Miyazono，2010；Siegel和Massague，2003)、WNT(Anastas和Moon，2013；Clevers和Nusse，2012；Katoh和Katoh，2007)以及VEGF(Carmeliet和Jain，2011；Folkman，1995)。在該胰腺癌CTCs的同期組群中，與原發(fā)腫瘤相比，在CTCs中Wnt4和Tgfb2最高度富集，暗示了自分泌信號轉(zhuǎn)導參與這些主要的通路。除這些完善限定的轉(zhuǎn)移的貢獻因素外，CTC表達分析還表明出乎預(yù)料的信號轉(zhuǎn)導通路的激活，包括神經(jīng)營養(yǎng)因子、toll樣受體和B細胞受體通路。已經(jīng)報道了在胰腺癌中的神經(jīng)營養(yǎng)因子通路活化(特別是與增高的神經(jīng)周圍侵襲相關(guān))(Miknyoczki等，1996；Miknyoczki等，1999；Ohta等，1997；Wang等，2009；Zhang等，2005)。Toll樣受體和B細胞受體通路在CTC讀數(shù)中具有較小的代表性，然而它們表明了免疫調(diào)控信號轉(zhuǎn)導組分的異常活化。最后，CTC衍生的培養(yǎng)物的建立對于這些活化的信號轉(zhuǎn)導通路的功能顯著性測試而言是需要的。

雖然CTC-c簇中的單細胞滿足腫瘤細胞的特征標準，對非典型CTC簇(CTC-plt和CTC-pro)的特性的界定需要額外的分析。與CTC-c相比，CTC-plt簇內(nèi)的單細胞在傷口愈合和止血指征以及MSigDB血小板和巨核細胞表達譜方面具有高的富集(表4)。這表明這些細胞為循環(huán)的巨核細胞/巨血小板或者為覆蓋有粘附的血小板的CTCs。腫瘤細胞特異性品系標簽支持了對作為腫瘤起源的CTC-plt細胞的識別。使來自兩只KPC-mT/mG小鼠的18個帶有EGFP品系標簽的單個CTC接受單細胞RNA測序：使用非監(jiān)督分級聚類，將來自兩只小鼠的總共9個CTCs(7/7CTCs來自小鼠GMP1，2/11來自小鼠GMP2)囊括于CTC-plt中(數(shù)據(jù)未示出)。因此，CTC-plt簇包含表現(xiàn)出強的血小板標記的CTCs，該血小板標記最有可能衍生自通過所粘附的血小板編碼的轉(zhuǎn)錄物。有意思的是，甚至在全部的經(jīng)注釋的血小板轉(zhuǎn)錄物的數(shù)字移除(digital removal)后，CTC-plt細胞維持了其與CTC-c的明確的間隔(數(shù)據(jù)未示出)。如同最近的體外模型實驗所表明的，由此可能的是豐富的血小板的粘附可調(diào)控內(nèi)在的CTC表達譜(Labelle等，2011)。

CTC-pro簇與NB508胰腺癌細胞系和MEFs二者最為相似，當與CTC-c進行比較時，CTC-pro富集細胞增殖標記Mki67。多個品系有可能有助于該復雜分群：來自腫瘤限制的帶有EGFP品系標簽的KPC小鼠的CTCs與CTC-pro成簇(數(shù)據(jù)未示出)，值得注意的是在MSigDB中注釋的細胞周期指征和Mki67的豐富表達(Whitfield等，2002)(數(shù)據(jù)未示出)。在CTC-pro簇內(nèi)的一個單細胞衍生自胰腺癌細胞系NB508，而另一(MP3-2)具有典型CTCs的高的角蛋白/高的E-鈣粘蛋白表達特征(數(shù)據(jù)未示出)。然而，通過其抗原加工和遞呈基因的表達所識別的另一子類包含免疫和樹突細胞(GO:0019886-經(jīng)由II類MHC的外源肽抗原的抗原加工和遞呈；表5)?？傊?，CTC-pro簇看起來代表一群高度增殖的細胞，其子類為腫瘤衍生。

總之，單個胰腺CTCs的無偏分離和RNA測序評估表明這些CTCs中超過一半無活力，其RNA處于降解的不同階段。在剩余的有活力的CTCs中，通過非監(jiān)督聚類區(qū)分了三個主要類群：典型子類(CTC-c)，占55％；第二血小板粘附類群(CTC-plt；32％)以及第三由增殖指征標記的異質(zhì)簇(CTC-pro；13％)。鑒于其最清楚地限定的腫瘤衍生的特征，我們選擇CTC-c簇進行轉(zhuǎn)移相關(guān)通路的詳細分析。

胰腺CTCs共表達上皮、間充質(zhì)和干細胞標記。已通過KPC小鼠模型中的品系跟蹤研究，支持了胰腺癌中的EMT與早期轉(zhuǎn)移的關(guān)聯(lián)(Rhim等，2012)。本發(fā)明人最近報道了人乳腺癌CTCs中的單個CTC內(nèi)的上皮和間充質(zhì)標記的分布，反映出腫瘤組織學以及對不同療法的應(yīng)答或耐受性(Yu等，2013)。為了直接測試小鼠胰腺CTCs中的EMT，使用經(jīng)建立的上皮(E)和間充質(zhì)(M)標記(Kalluri和Weinberg，2009)來評估CTC-c簇內(nèi)的各細胞(數(shù)據(jù)未示出)。與原發(fā)腫瘤相比，CTC-c細胞展示出上皮標記E-鈣粘蛋白(Cdh1)和Muc1的清楚的喪失；而間充質(zhì)轉(zhuǎn)錄物為混合的，一些顯示出增高的表達(Cdh11、Vim)，而其它具有降低的水平(S100a4、Itga5、Sdc1)(圖3A和圖3B)。尤其是，甚至在CTCs中上調(diào)的間充質(zhì)基因顯示出單細胞間的高度的異質(zhì)性表達(數(shù)據(jù)未示出)。與此相比地，上皮標記的喪失(包括E-鈣粘蛋白(Cdh1))在全部典型CTCs中幾乎是普遍存在的。

還認為CTCs在轉(zhuǎn)移前體方面富集，能夠起始轉(zhuǎn)移性腫瘤的沉積(deposit)。正如在識別這些細胞中所建立的干細胞標記的關(guān)聯(lián)性所表明的，此類前體細胞和假定的癌干細胞間的關(guān)系不確定。在單細胞RNA測序讀數(shù)中對推測的胰腺癌干細胞基因(Rasheed和Matsui，2012；Rasheed等，2010)進行評估(圖3B)。在測試的全部候選標記(Aldh1a1、Aldh1a2、Prom1/Cd133、Cd44、Met、EpCAM)中，僅Aldh1a1和Aldh1a2在CTCs中富集。典型的CTCs主要表達Aldh1a2同工型，而CTC-plt細胞富集Aldh1a1，但這些同工型也在一些單個CTCs中共表達。MEFs、NB508胰腺癌細胞和正常的WBCs也表達Aldh1a1，然而不表達Aldh1a2(數(shù)據(jù)未示出)。在單個CTCs中，Aldh1同工型的表達和間充質(zhì)基因Cdh11或Vim的富集之間沒有關(guān)聯(lián)，表明這兩個生物標記并不具內(nèi)在關(guān)聯(lián)性。

鑒于將Aldh1a2識別為CTCs表達的潛在的干細胞樣標記，利用RNA原位雜交(RNA-ISH)測試其在匹配的原發(fā)腫瘤內(nèi)的表達。腫瘤內(nèi)的表達模式為異質(zhì)性的：表達Aldh1a2的細胞主要位于腫瘤的“間質(zhì)”或非上皮(即，角蛋白少)區(qū)室內(nèi)(數(shù)據(jù)未示出)。這些非上皮細胞(其在胰腺癌中特別豐富)的起源可能是混合的。人胰腺癌中的組織學評估和陰性KRAS突變分析(Biankin等，2012；Ogino等，2005)均表明這些細胞中的大部分代表反應(yīng)性成纖維細胞或間質(zhì)，而非是腫瘤起源。然而，最近的KPC小鼠品系跟蹤顯示出，這些被假定為間質(zhì)的細胞的小部分事實上為腫瘤衍生的，并推定發(fā)生EMT從而表現(xiàn)為成纖維細胞(Rhim等，2012)。有意思的是，具有最多轉(zhuǎn)移和最高數(shù)量的Aldh1a2陽性CTCs(MP7)的小鼠也具有最高水平的Aldh1a2的原發(fā)腫瘤。在該情形下，Aldh1a2陽性細胞廣泛地存在于間質(zhì)區(qū)室內(nèi)，并包含了上皮(角蛋白高)組分的小的亞群體(數(shù)據(jù)未示出)。因此，角蛋白高、表達干細胞相關(guān)基因Aldh1a2的典型CTCs在原發(fā)腫瘤中的表達限于間質(zhì)(角蛋白低)區(qū)室，且僅為上皮細胞的小的亞群體。

典型CTCs共享間質(zhì)富集的基因的表達。除了CTCs的明顯多樣性外，認為共享轉(zhuǎn)錄物可能提供關(guān)于其在原發(fā)腫瘤內(nèi)的細胞起源、其侵襲并在血流內(nèi)存活的機制以及CTC特異性治療靶標的最終識別的進一步理解。選擇嚴格的標準來識別最高度富集的CTC轉(zhuǎn)錄物(RP得分<300)，所述CTC轉(zhuǎn)錄物在≥90％的全部典型CTCs中以極高水平表達(>100RPM)。三個基因滿足這些標準：核心蛋白聚糖(Dcn)，在多種不同癌癥的腫瘤間質(zhì)中表達的胞外基質(zhì)蛋白聚糖(Adany等，1990；Bostrom等，2013；Henke等，2012；Hunzelmann等，1995；Iozzo和Cohen，1994；Mu等，2013；Nash等，2002)；胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白5(Igfbp5)，人PDAC中表達的胞外生長因子結(jié)合蛋白，據(jù)報道同時具有增殖性質(zhì)和抗增殖性質(zhì)(Johnson等，2006；Johnson和Haun，2009)；以及Kruppel樣因子4(Klf4)，干細胞(iPS)重編程關(guān)鍵因子之一(Takahashi和Yamanaka，2006)，胰腺癌的發(fā)展牽涉該因子(Brembeck和Rustgi，2000；Prasad等，2005；Wei等，2010)。借助RNA-ISH，Dcn在腫瘤的間質(zhì)要素中廣泛表達(圖6)。引人注目的是，Igfbp5和Klf4均集中且主要地在沿腫瘤的上皮區(qū)室邊緣的表現(xiàn)為間質(zhì)的細胞內(nèi)表達(數(shù)據(jù)未示出)。EGFP品系限制的原發(fā)腫瘤的RNA-ISH證實，上皮/間質(zhì)界面處的Igfbp5陽性細胞為腫瘤起源的(數(shù)據(jù)未示出)。除了該過渡區(qū)外，對該帶有EGFP標簽的腫瘤中的Klf4的分析也發(fā)現(xiàn)其在上皮管(epithelial ducts)的子類中表達(數(shù)據(jù)未示出)。值得注意的是，雖然Igfbp5和Klf4僅在原發(fā)腫瘤細胞的小的子類中表達，在全部的典型CTCs的85％中Igfbp5和Klf4高度共表達。與CTCs中的明顯的混合的上皮/間充質(zhì)標記一起，這些觀察提出了如下可能性：許多CTCs衍生自上皮/間質(zhì)界面處可由Igfbp5和Klf4表達界定的灶點(foci)。

除了三個最高表達的轉(zhuǎn)錄物外，值得注意的是，CTCs高水平表達牽涉間質(zhì)細胞基質(zhì)的基因。對全部的CTC富集的基因的基因本體分析(表3)識別了60個胞外蛋白(GO:0044421，OR 1.7，q值6.4×10^-3)，發(fā)現(xiàn)其中32個為蛋白質(zhì)性質(zhì)的胞外基質(zhì)(ECM)(GO:0005578，OR 2.4，q值4.8×10^-3)。最近的研究強調(diào)了反應(yīng)性間質(zhì)對胰腺癌的發(fā)病機制和轉(zhuǎn)移的重要性(Feig等，2012；Neesse等，2013；Neesse等，2011；Olive等，2009；Provenzano等，2012)，然而，循環(huán)的腫瘤細胞內(nèi)的這些間質(zhì)相關(guān)ECM基因的表達是出乎預(yù)料的。為了識別小鼠胰腺腫瘤模型中的主要的間質(zhì)富集的基因，我們對塊狀腫瘤樣本(代表混合有反應(yīng)性間質(zhì)細胞的腫瘤細胞)與從原發(fā)腫瘤(TuGMP3)純化的帶有EGFP標簽的單細胞進行了RP差異化表達分析。相比于單個原發(fā)腫瘤細胞，在塊狀腫瘤中總共富集了51個蛋白質(zhì)性質(zhì)的ECM基因(GO:0005578，OR 4.8，q值3.4×10^-18)。其中，6個基因(Ccdc80、Col1a2、Col3a1、Dcn、Sparc、Timp2)與之前識別的CTC富集的基因集合共享(數(shù)據(jù)未示出)。如上所指出的，識別出在CTCs中最高度富集的是核心蛋白聚糖(Dcn)(中位數(shù)10,686rpm)，其在98％的CTCs中高水平表達(>100rpm)。第二高度豐富的基因是Sparc(中位數(shù)3,913rpm)，其在88％的CTCs中高表達。這兩個基因在88％的典型CTCs中以高水平共表達。對原發(fā)腫瘤的Dcn(圖6)和Sparc(數(shù)據(jù)未示出)進行的RNA-ISH均證實，這些基因的表達遍布反應(yīng)性間質(zhì)，而不存在于原發(fā)腫瘤的上皮角蛋白富集區(qū)。

間質(zhì)衍生ECM基因的表達為全部的典型CTCs的共有特征，雖然其Kras/p53遺傳驅(qū)動物相同，在這些基因中有明顯的小鼠特異性偏倚。這些小鼠特異性成簇在非監(jiān)督分析中明顯(p值＜2.2×10^-16)。例如，用來自小鼠MP6的單個CTCs代表的亞簇3占比過高，而對于小鼠MP7，亞簇4富集；且對于小鼠MP2，亞簇5富集。通過RP分析，在小鼠MP2和MP7的CTCs之間的差異化表達的68個轉(zhuǎn)錄物中，基因本體表明11個胞外蛋白的顯著富集(GO:0044421，OR 3.8，q值0.06)，其中7個見于蛋白質(zhì)性質(zhì)的ECM中(GO:0005578，OR 6.3，q值0.05)(數(shù)據(jù)未示出)?？傊?，這些數(shù)據(jù)顯示出，小鼠胰腺癌模型衍生的大部分CTCs以高水平表達ECM基因的集合，并通常見于原發(fā)腫瘤的間質(zhì)、而非上皮區(qū)室中。這可反映出在上皮/間質(zhì)界面處的許多CTCs的起源，與特有的限制性標記(例如Igfbp5和Klf4)的表達一致。遺傳學上匹配的各小鼠腫瘤生成具有共享和特有的ECM基因表達模式的CTCs這一事實表明了腫瘤特異性侵襲通路，該腫瘤特異性侵襲通路被置于CTCs的本質(zhì)特征之上。通過CTCs表達的胞外蛋白的高水平為靶向這些轉(zhuǎn)移前體提供了出乎預(yù)料的機會。

人胰腺CTCs表達ECM蛋白SPARC。為了確定ECM蛋白表達與人類疾病的關(guān)聯(lián)性，從轉(zhuǎn)移性PDAC患者的血液中分離CTCs，并使其接受單細胞RNA測序。對來自3個患者的7個胰腺CTCs的分析顯示出，大部分表達界定了其上皮起源的角蛋白，并且在小鼠CTCs中富集的60個胞外蛋白基因中的總共13個在至少一個的人胰腺CTC中以高水平表達(>100rpm)(圖7)。人SPARC是在全部的人胰腺CTC中以高水平發(fā)現(xiàn)的唯一的基因。對人前列腺和乳腺CTCs的分析也顯示出包括SPARC在內(nèi)的胞外蛋白的顯著表達，強調(diào)了這些靶標為轉(zhuǎn)移性上皮癌細胞中所普遍共享(數(shù)據(jù)未示出)。小鼠和人PDAC中的Sparc/SPARC的RNA-ISH發(fā)現(xiàn)Sparc/SPARC表達主要局限在腫瘤的間質(zhì)區(qū)室(數(shù)據(jù)未示出)。SPARC的表達見于196/198(99％)的人原發(fā)PDAC腫瘤和36％的陽性腫瘤中，該陽性腫瘤在上皮腫瘤細胞中(雖然為總體信號的少數(shù))具有一些可檢測的SPARC。SPARC作為胞外蛋白的存在使得能夠進行靶向SPARC的抗體針對性療法?？傊@些數(shù)據(jù)表明在小鼠胰腺CTCs中的發(fā)現(xiàn)也可在人類疾病中找到，并同時提供了新的生物標記和治療靶標。

討論

本文所述的為使用單細胞RNA測序進行的CTC組成和多樣性的詳細分析?？傊?，在93個單一的小鼠胰腺CTCs中獲得高質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄組，并與來自匹配的原發(fā)腫瘤的20個單細胞、塊狀腫瘤制備物以及來自從相同小鼠胰腺腫瘤模型建立的永生化細胞系的16個細胞進行比較。使用密切匹配人PDAC的小鼠模型，使得能夠?qū)ν瑫r分離的原發(fā)腫瘤試樣與CTCs進行比較。鑒于KPC小鼠模型中共享的Kras/Trp53遺傳驅(qū)動物，還能夠檢查個體小鼠內(nèi)和不同動物之間的CTC異質(zhì)性。最后，CTC-iChip技術(shù)的使用使得能夠不管其細胞表面表位而選擇不帶標簽的CTCs，從而避免了與腫瘤標記特異性細胞純化相關(guān)的任何偏倚。總之，這些觀察結(jié)果包括如下：1.CTCs成簇為多個子類，包括主要的“典型CTC”組，以及通過血小板衍生標記或增殖指征標記的其它組；2.雖然單個小鼠腫瘤可產(chǎn)生納入這些簇中的各簇的CTCs，盡管它們共享遺傳驅(qū)動物，衍生自個體小鼠的CTCs具有獨特的模式；3.通過實質(zhì)上全部的典型CTCs所共享的共同標記包括上皮以及間充質(zhì)標記、Aldh1a2干細胞標記以及識別定位于原發(fā)腫瘤的上皮/間質(zhì)邊界處的灶點的兩個高度表達的轉(zhuǎn)錄物(Igfbp5和Klf4)；以及4.幾乎全部的典型CTCs共享的最高度富集的CTC特異性轉(zhuǎn)錄物編碼與腫瘤間質(zhì)區(qū)室相關(guān)的胞外基質(zhì)蛋白。

與之前的部分純化的塊狀CTC群體的RNA測序相比，本文報告的單細胞分析提供了腫瘤細胞特異性讀數(shù)的明顯更深的深度。就這一點而言，對來自小鼠胰腺癌模型的典型CTCs的詳細分析是史無前例的。本文展示了胰腺癌CTCs一致地喪失了上皮標記E-鈣粘蛋白(Cdh1)(上皮-至-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵特征)的表達。然而，細胞不會喪失其它上皮標記(例如細胞角蛋白)的表達，且典型EMT間充質(zhì)標記(例如波形蛋白)也沒有一致性的增加。就這一點而言，大多數(shù)典型CTCs表現(xiàn)出在雙表型狀態(tài)的停滯。雖然其表達細胞角蛋白(存在于原發(fā)腫瘤的上皮成分中)，CTCs中的大部分其它高表達的標記為與原發(fā)腫瘤的非上皮或“間質(zhì)”成分所共享。這些間質(zhì)基因中在典型CTCs中表達的為Aldh1a2(推定的胰腺癌干細胞標記)(Rasheed和Matsui，2012；Rasheed等，2010)。轉(zhuǎn)移前體中的Aldh1a2是否為具有細胞可塑性的功能顯著標記仍有待確定。

與共享的典型CTCs的上皮和間充質(zhì)狀態(tài)相關(guān)的令人興奮的觀察結(jié)果是，它們的實質(zhì)上一致(>85％)的Igfbp5和Klf4的高水平共表達，這兩個基因僅在原發(fā)腫瘤內(nèi)的上皮/間質(zhì)界面處的細胞的小的亞群體中表達。這提出了有趣的可能性：腫瘤內(nèi)的這一關(guān)鍵定位產(chǎn)生不成比例部分的有活力的CTCs。實際上，活躍地經(jīng)歷EMT的腫瘤細胞有可能在上皮-間質(zhì)部分富集，有助于腫瘤間質(zhì)與腫瘤衍生和非惡性的反應(yīng)性細胞類型的混合品系。特別值得注意的是，胚胎發(fā)育和胰腺惡性腫瘤中的IGF信號轉(zhuǎn)導和Klf4轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)二者的潛在作用使得其在腫瘤以及CTCs中產(chǎn)生獨特的表達模式。

最后，來自該單一CTC RNA測序研究的最為出乎預(yù)料的發(fā)現(xiàn)是絕大多數(shù)典型CTCs上的ECM蛋白的極高水平的豐度。尤其是，對匹配的原發(fā)和轉(zhuǎn)移性的乳腺腫瘤的現(xiàn)有評估識別了作為轉(zhuǎn)移中的ECM分子富集的最普遍的基因表達差異，包括一些18％差異化表達的基因(Weigelt等，2005)。雖然這被解釋為反映了轉(zhuǎn)移位點的局部環(huán)境的差異，本發(fā)明的數(shù)據(jù)表明ECM蛋白被CTCs自身高度表達。類比于經(jīng)典的“種子相較于土壤”的爭辯(Fidler，2003)，CTCs可能實際上是攜帶一些其自身土壤的種子。

CTCs的詳細的分子分析的最終目的是理解CTCs的產(chǎn)生過程和其治療脆弱性。就這一點而言，衍生自目前的單一CTC RNA測序分析的重要觀察結(jié)果是胞外蛋白(主要具有在ECM中發(fā)現(xiàn)的蛋白)出乎預(yù)料的表達。CTCs中豐度最高且普遍共享的兩個ECM蛋白是Dcn和Sparc，二者均為建立的腫瘤間質(zhì)基因。尤其是，表達間質(zhì)的Sparc看起來結(jié)合白蛋白綴合的包含化療劑的納米顆粒(白蛋白結(jié)合型紫杉醇(nab-paclitaxel))，使得能夠提高在人PDAC中的細胞毒性和效力(Neuzillet等，2013；Von Hoff等，2011；Yardley，2013)。實際上，作為改進化療劑遞送和從其支持性微環(huán)境中剝離腫瘤細胞的手段，已針對靶向胰腺癌間質(zhì)做出大量努力(Neesse等，2011；Olive等，2009；Provenzano等，2012；Rasheed等，2012)。這些基因產(chǎn)物也被CTCs表達的發(fā)現(xiàn)表明抗體導向的治療不僅可用于針對原發(fā)腫瘤間質(zhì)，也可靶向轉(zhuǎn)移入血液中的腫瘤細胞。

如本文所述，目前的CTC分析從將其匹配至已知的腫瘤界定標記延伸至對其特有性質(zhì)進行研究，所述特有性質(zhì)區(qū)分CTC與大部分原發(fā)腫瘤以及能夠成為CTC在血流中存活并產(chǎn)生遠端轉(zhuǎn)移的能力的基礎(chǔ)。對人癌轉(zhuǎn)移的細胞處理的此類深刻理解對于預(yù)防原發(fā)腫瘤擴散至遠端器官的終極目標而言是關(guān)鍵的。

實驗程序

小鼠和細胞系。在這些實驗中使用的患有胰腺癌的小鼠為如之前所述的(Bardeesy等，2006)表達Pdx1、LSL-Kras^G12D以及Trp53^lox/+或Trp53^lox/lox驅(qū)動的Cre。通過將mT/mG小鼠(Jackson Laboratory-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato，-EGFP)Luo/J)飼養(yǎng)成為用于KPC小鼠生成的繁殖對，生成帶有EGFP胰腺品系標簽的KPC小鼠。從Jackson Laboratory購買正常的FVB小鼠。全部的小鼠照料和規(guī)程按照MGH SRAC批準的方案進行。

CTC富集技術(shù)的改造。鑒于期望無偏的富集系統(tǒng)，對于該應(yīng)用選擇之前展示的負性耗竭(negative depletion)技術(shù)(Ozkumur等，2013)。除了將大鼠抗小鼠CD45抗體(BAM114，R&D Systems，USA)綴合至MyOne珠外，全部處理方案與之前認定的相同。

單細胞顯微操作、擴增和測序。在全血抗CD45負性耗竭之后，將含有富集細胞的產(chǎn)物收集在35mm陪替氏培養(yǎng)皿中，并使用Nikon Eclipse Ti^TM倒置熒光顯微鏡查看?；谕暾募毎螒B(tài)學和缺乏抗CD45磁珠標記來識別感興趣的細胞。在EppendorfNK 2顯微操作器上，對這些靶細胞分別用10μm轉(zhuǎn)移槍頭進行顯微操作，并排出至含有RNA保護性裂解緩沖液的PCR管中，并立即在液氮中進行速凍。利用改良的方案對單細胞進行擴增(Tang等，2010)，并在ABI 5500XL^TM系統(tǒng)上測序。

RNA原位雜交(RNA-ISH)。根據(jù)Affymetrix QuantiGene ViewRNA ISH Tissue-2Plex Assay^TM實施RNA-ISH。

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表1：KEGG定義的信號轉(zhuǎn)導通路中的CTC富集基因的注釋。*表明基因見于多個通路基因集合中。

表2：通過秩生成顯著表達的基因(FDR<0.01)

表3：利用BP_FAT和CC_FAT數(shù)據(jù)集，CTC-c富集基因中的最顯著的基因本體條目

表4：CTC-c vs CTC-plt中富集的最顯著的基因集合

表5：CTC-c vs CTC-pro中富集的最顯著的基因集合

q值<0.01

實施例2：補充方法

小鼠和細胞系。在這些實驗中使用的患有胰腺癌的小鼠為如之前所述的(Bardeesy等，2006)表達Pdx1、LSL-Kras^G12D以及Trp53^lox/+或Trp53^lox/lox驅(qū)動的Cre(否則稱為KPC)。通過將mT/mG小鼠(從Jackson Laboratory購得-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato，-EGFP)Luo/J)飼養(yǎng)成為用于KPC小鼠生成的繁殖對，生成帶有EGFP胰腺品系標簽的KPC小鼠。從Jackson Laboratory購買正常的FVB小鼠。全部的小鼠照料和規(guī)程按照MGH SRAC批準的方案進行。

對于心臟穿刺術(shù)，給予動物異氟烷鎮(zhèn)靜劑，胸腔壁用乙醇消毒，在胸廓之上制造皮膚切口以暴露胸腔并消除正常皮膚的上皮細胞污染。將23號針用于抽取約1mL血液進入裝有100μL PBS-10mM EDTA pH7.4(Gibco)的1mL注射器中。通過加入濃縮的500mM EDTA的藥丸劑或者用10mM EDTA進行1:1稀釋，將血EDTA濃度升高至5mM，隨后按照動物方案指導對動物進行安樂死。

將先前從該內(nèi)源性模型中發(fā)展的原發(fā)腫瘤生成的小鼠胰腺細胞系NB508(Pdx1-Cre/Kras^G12D/Trp53^lox/+)通過慢病毒進行GFP轉(zhuǎn)染(NB508-GFP)。該細胞系用于加入細胞(spiked cell experiments)實驗和正位腫瘤形成。

使用RPMI-1640培養(yǎng)基+10％FBS+1％Pen/Strep(Gibco/Invitrogen)將NB508-GFP細胞系維持在標準培養(yǎng)條件下。

對于正位實驗，將NB508-GFP細胞正位注射入健康同系(FVB背景)小鼠的胰腺。簡單來說，用異氟烷將小鼠麻醉，用脫毛產(chǎn)品處理左腹壁，并用70％乙醇滅菌。在左側(cè)腹壁上部制造小切口，并使胰腺松動。將處于0.1mL總體積的PBS中的約100萬個NB508-GFP細胞注入胰腺。通過無菌手術(shù)釘封閉腹膜和腹壁。使得腫瘤生長2周，此時，通過心臟穿刺術(shù)獲得血液用于CTC-iChip處理。

CTC富集技術(shù)的改造。鑒于期望無偏的富集系統(tǒng)，對于該應(yīng)用選擇負性耗竭技術(shù)。除了將大鼠抗小鼠CD45抗體(BAM114，R&D Systems，USA)綴合至MyOne珠外，全部處理方案與之前認定的相同。

通過將約1000個表達GFP的NB508細胞加入至1mL健康小鼠血液中并進行處理以確定回收效率，進行加入細胞實驗以對系統(tǒng)進行驗證。使用正位模型以驗證回收效率，以及從荷瘤小鼠初步確定期望的耗竭效率。在這些實驗中，對富集的樣本評價在產(chǎn)物中觀察到的GFP+細胞的數(shù)量。

從內(nèi)源性模型分離的CTCs的免疫染色。利用一抗-二抗方式將分離的CTCs旋涂在載玻片上并進行免疫染色。一抗為兔抗廣譜細胞角蛋白(1:50，Abcam ab9377)和山羊抗小鼠CD45(1:500，R&D systems AF114)。將帶有免疫熒光標簽的二抗用于信號放大。二抗為驢抗兔Alexa Fluor 594(1:500，Invitrogen A-21207)和驢抗山羊Alexa Fluor 488(1:500，Invitrogen A-11055)。隨后用DAPI對核進行復染，用PBS對玻片進行漂洗，蓋上蓋玻片并在4℃下儲存。使用BioView^TMLtd.自動成像系統(tǒng)(Billerica，MA)以及自動正置熒光顯微鏡(Eclipse 90i^TM，Nikon，Melville，NY)在10×放大倍數(shù)下成像。對潛在的CTCs進行打分需要CK陽性染色而無需CD45染色，隨后手動檢查。使用來自非荷瘤小鼠的試樣建立閾值和基線信號。

單細胞顯微操作。在全血抗CD45負性耗竭之后，將含有富集細胞的產(chǎn)物收集在35mm陪替氏培養(yǎng)皿中，并使用Nikon Eclipse^TMTi倒置熒光顯微鏡查看?；谕暾募毎螒B(tài)學和缺乏抗CD45磁珠標記識別感興趣的細胞。在EppendorfNK 2顯微操作器上，對這些靶細胞分別用10μm轉(zhuǎn)移槍頭進行顯微操作，并排出至含有RNA保護性裂解緩沖液(10×PCR緩沖液II、25mM MgCl₂、10％NP40、0.1M DTT、SUPERase-In、Rnase抑制劑、0.5μM UP1引物、10mM dNTP以及無核酸酶的水)的PCR管中，并立即在液氮中進行速凍。

單細胞擴增和測序。如前描述(Tang等，2010)用如下指出的微調(diào)的方案進行單細胞擴增和測序。將來自抽提的單個循環(huán)腫瘤細胞的RNA樣本在冰上融解，并在70℃下孵育90秒。為了生成cDNA，將樣本用逆轉(zhuǎn)錄預(yù)混液(每1×體積0.33μL SuperScript III^TM逆轉(zhuǎn)錄酶、0.05μl RNase抑制劑和0.07μl T4基因32蛋白)進行處理，并在熱循環(huán)儀上于50℃下孵育30分鐘并于70℃下孵育15分鐘。為移除游離的引物，將1.0μl EXOSAP混合物添加至各樣本，在37℃下孵育30分鐘，并在80℃下滅活25分鐘。接下來，通過如下將3’-poly-A尾添加至各樣本中的cDNA：在預(yù)混液中(每1×體積4.26μl H₂O、0.6μl 10×PCR緩沖液II、0.36μl 25mM MgCl₂、0.18μl 100mM dATP、0.3μl末端轉(zhuǎn)移酶和0.3μl RNase H)于37℃下孵育15分鐘，并在70℃下滅活10分鐘。第二條鏈cDNA通過如下合成：將各樣本分為4份，并在預(yù)混液中(每1×體積13.654μl H₂O、2.2μl 10×高保真PCR緩沖液、1.76μl 2.5mM的各dNTP、0.066μl 100μM的UP2引物、0.88μl 50mM MgSO₄和0.44μl Platinum Taq DNA聚合酶)于95℃下孵育3分鐘、于50℃下孵育2分鐘并于72℃下孵育10分鐘。

用預(yù)混液(每1×體積6.7μl H₂O、4.1μl 10×高保真PCR緩沖液、1.64μl 50mM MgSO₄、4.1μl 2.5mM的各dNTP、0.82μl 100μM的AUP1引物、0.82μl 100μM的AUP2引物和0.82μl Platinum Taq DNA聚合酶)進行PCR擴增(95℃下3分鐘；95℃下30秒、67℃下1分鐘、72℃下6分6秒的20次循環(huán))。將各樣本的4個反應(yīng)物合并，并使用QIAGEN PCR純化試劑盒(Cat.No 28106)進行純化，以50μl EB緩沖液洗脫。通過使用qPCR測試基因Gapdh、ActB、Ptprc(CD45)、Krt8、Krt18、Krt19和Pdx1來選擇樣本。每個樣本又分為4份，并用預(yù)混物(每1×體積59.1μl H₂O、9μl 10×高保真PCR緩沖液、3.6μl 50mM MgSO₄、13.5μl 2.5mM的各dNTP、0.9μl 100μM的AUP1引物、0.9μl 100μM的AUP2引物和1.8μl Platinum Taq DNA聚合酶)進行第二輪PCR擴增(98℃下3分鐘、67℃下1分鐘和72℃下6分6秒的9個循環(huán))。將樣本合并并使用Agencourt AMPure XP珠純化，并以40μl 1×低TE緩沖液洗脫。

測序文庫構(gòu)建。為了使用Covaris S2^TM系統(tǒng)剪切DNA，向各樣本中添加1×低TE緩沖液和1.2μl剪切緩沖液。剪切程序的條件包括：6個循環(huán)、5℃水浴溫度、15℃水浴溫度限制、10％占空循環(huán)、強度為5、100個循環(huán)/爆發(fā)、以及60秒。然后，用預(yù)混液(每1×體積14μl H₂O、40μl 5×反應(yīng)緩沖液、8μl 10mM dNTP、8μl末端修整酶1和10μl末端修整酶2)將樣本于室溫下末端修整30分鐘。用0.5×體積的Agencourt AMPure XP^TM珠移除大于500bp的DNA片段。將上清液轉(zhuǎn)移至分離管。為了按大小選擇200-500bp DNA產(chǎn)物，加入0.3×體積的珠，并用70％EtOH洗滌樣本2次。將產(chǎn)物以36μl低TE緩沖液進行洗脫。通過用預(yù)混液(每1×體積5μl A-Tailing Enzyme I、10μl 5×反應(yīng)緩沖液和1μl 10mM dATP)處理，將dA尾添加至各按大小選擇的DNA，在68℃下孵育30分鐘，并冷卻至室溫。為了標記和區(qū)分用于測序的各DNA樣本，使用5500SOLiD Fragment Library Enzyme Module^TM(4464413)將條形碼接頭(5500SOLiD 4464405)連接至DNA。在條形編碼之后，使用Agencourt AMPure XP^TM珠將樣本純化兩次，并以22μl低TE緩沖液進行洗脫。在一輪PCR擴增(95℃下5分鐘；95℃下15秒、62℃下15秒和70℃下1分鐘的12次循環(huán)；以及70℃下5分鐘)之后，用AMPure XP珠純化文庫。最后，為了對連接的DNA進行量化，使用SOLiD Library TaqMan Quantitation Kit^TM進行qPCR。完成的條形編碼文庫再用模板珠制劑進行乳液PCR，并在ABI 5500XL^TM上進行測序。

RNA原位雜交(RNA-ISH)。將石蠟包埋的組織塊進行新鮮切片并冷凍于-80℃下。從冷藏箱中移出后，在60℃下將玻片烘烤1h，并在室溫(RT)下于10％甲醛中固定1h。使用Histo-Clear^TM移除石蠟，并根據(jù)Affymetrix QuantiGene ViewRNA ISH Tissue-2Plex Assay^TM實施RNA-ISH^TM。在RT下于5％甲醛中進行固定之前，將組織切片在緩沖溶液中于95℃下預(yù)處理10min并用蛋白酶消化10min，使組織切片透化。應(yīng)用靶探針裝置并通過在40℃下孵育2h與組織雜交。以1:50的稀釋度使用1型探針，所述1型探針包括Aldh1a2(VB1-14197)、Dcn(VB1-14962)、Klf4(VB1-14988)、Igfbp5(VB1-14987)和Sparc(VB1-14196)。6型探針包括1:50的EGFP(VF6-13336)和各自為1:100的合并的Krt8(VB6-11060)和Krt18(VB6-11059)。通過PreAmplifier和Amplifer QT混合物對靶探針裝置的連續(xù)雜交，對信號進行放大。通過將6型標記探針施用于Fast Blue底物并將1型標記探針施用于Fast Red底物，檢測靶mRNA分子。在RT下用Gill’s蘇木精對組織復染10s。DAPI(Invitrogen，D3571；3.0μg/ml)染色進行1min。將利用Nikon 90i的熒光顯微術(shù)用于對靶mRNA進行可視化。在Cy3通道中檢測1型探針，在Cy5通道中檢測6型探針。使用NIS-Elements^TM軟件生成合并的圖像。

確定每百萬讀數(shù)(rpm)。用小鼠基因組版本mm9以及來自genome.ucsc.edu由mm9已知基因列表定義的轉(zhuǎn)錄組的no-novel-juncs參數(shù)集合，利用tophat^TM2.0.4版(Trapnell等，2009)和bowtiel^TM0.12.7版對有色區(qū)域讀數(shù)進行比對。舍棄無比對或比對至基因組多個位置的讀數(shù)。如果可能的話，利用來自genome.ucsc.edu的mm9列表knownToLocusLink將經(jīng)比對的各讀數(shù)映射至其外顯子已被該讀數(shù)比對了的基因。各基因讀數(shù)的計數(shù)是映射至該基因的讀數(shù)的數(shù)目。這一計數(shù)除以映射至任何基因的讀出的總數(shù)目并乘以一百萬，從而形成每百萬讀數(shù)(rpm)計數(shù)。由于注意到比對中存在3’偏倚，所以使用了rpm而不是rpkm。

非監(jiān)督分級聚類和主成分分析。向rpm矩陣添加1和rpm矩陣的最小正值之中的最小值，以剔除0。隨后對結(jié)果進行l(wèi)og10轉(zhuǎn)換，生成稱為log10(rpm)的矩陣。保留具有最高2000標準偏差的log10(rpm)矩陣的行(對應(yīng)于基因)，棄去其它的行。隨后對結(jié)果進行中位數(shù)平滑處理。用凝聚分級聚類對結(jié)果進行聚類，其平均連接具有的距離度量相當于1減去Pearson相關(guān)系數(shù)。計算log10(rpm)矩陣的主成分，繪出樣本坐標相對于前三個主成分的圖。

細胞異質(zhì)性測量。對于樣本簇的采集，將統(tǒng)計量M定義為簇中全部樣本對的平均值的簇間的平均值，該簇具有對應(yīng)于所述樣本對的rpm矩陣的兩列之間的相關(guān)系數(shù)的atanh。將“平均簇內(nèi)相關(guān)系數(shù)”定義為tanh(M)。對樣本進行刀切法(Jackknife)估計，以評估統(tǒng)計量s的標準偏差。將95％CI定義為tanh(M±sφ^-1(0.975))，其中φ為標準正態(tài)分布的累積分布函數(shù)。為了計算零假設(shè)(所述零假設(shè)為簇的統(tǒng)計量M分布的平均值與所采集的簇的統(tǒng)計量M分布的平均值相同)的p值，我們令p＝2(1-φ(|M1-M2|/√(s²₁+s²₂)))。值得注意的是，針對相同數(shù)據(jù)實施自舉法來替代刀切法并獲得類似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未示出)。

利用秩生成的監(jiān)督的差異化基因表達。為了找到兩組樣本間的差異化表達的基因，用如上定義的log10(rpm)矩陣開始進行分析。移除對應(yīng)于不在樣本集合中的樣本的列。隨后移除其第90百分位的值小于log10(10)的移除的行。使用Bioconductor(Gentleman等，2004)RankProd^TM軟件包(2.28.0版本)的RP函數(shù)獲得上調(diào)和下調(diào)的差異化表達的FDR估值。如果其FDR估值小于0.01，認為基因為差異化表達，然而如果有任何如下情況則棄去：該基因同時上調(diào)和下調(diào)差異化表達。

基因集合富集。在四組基因集合的集中考量富集：(1)全部的KEGG^TM，如DAVID^TM6.7(Huang da等，2009)中發(fā)現(xiàn)的；(2)如DAVID^TM6.7中發(fā)現(xiàn)的使用GO_BP的基因本體(GO)；以及(3)如DAVID 6.7中發(fā)現(xiàn)的GO_CC。將超幾何檢驗用于所述集的各基因集合，對發(fā)現(xiàn)的差異化表達的基因集合檢驗在基因集合的集中的富集。使用Benjamini-Hochberg方法將各集獲得的p值轉(zhuǎn)換為FDR估計(Benjamini和Hochberg，1995)。

全部的注釋的血小板轉(zhuǎn)錄物的數(shù)字移除。將log10(rpm)矩陣中書真表達與具有如下名稱的基因集合中的任何基因的表達的相關(guān)系數(shù)絕對值大于0.6的446個基因從log10(rpm)矩陣(如上定義)中移除：處于MSigDB v3.1中的GNATENKO_PLATELET_SIGNATURE和TENEDINI_MEGAKARYOCYTE_MARKERS。隨后如上所述實施成簇。

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實施例3

小鼠胰腺CTCs的比較分析顯示出60種胞外蛋白的富集(表6)。在人胰腺循環(huán)腫瘤細胞中進行這些特定生物標記和治療靶標的評估，示出人胰腺CTCs中的最為豐富的靶標(圖7)。這些胞外蛋白不僅代表潛在的生物標記，而且鑒于其作為腫瘤細胞外表面上的蛋白的性質(zhì)，它們?yōu)橹委煱袠??？衫缤ㄟ^基于抗體的治療劑(例如，如在如下的情況中：用于HER2的曲妥珠單抗、用于EGFR的西妥普單抗以及用于VEGF的貝伐單抗)靶向表6的胞外蛋白，以治療癌癥。

表6：胰腺CTC富集的胞外蛋白的列表

將這些CTC富集的基因擴展至人胰腺、乳腺和前列腺單細胞CTC數(shù)據(jù)，識別出如表9所示的5個候選基因。

表9：借助RNA-seq的具有高表達的人單個CTCs的百分數(shù)

關(guān)注于胰腺癌，選擇SPARC作為初始基因進行評估。小鼠和人原發(fā)腫瘤中的SPARC RNA-ISH(數(shù)據(jù)未示出)表明了間質(zhì)細胞中的顯著表達，為腫瘤提供了基本的微環(huán)境信號。本領(lǐng)域的大量努力關(guān)注為了治療效力的目的靶向PDAC間質(zhì)[1-4]，使得SPARC作為CTC治療靶標以及間質(zhì)導向的靶標。總共196/198(99％)的人胰腺腫瘤為SPARC陽性，且36％具有明顯的上皮腫瘤細胞表達。

人胰腺癌細胞系的評估識別出5個細胞系中的3個具有升高的SPARC表達，這與增高的遷移行為相關(guān)(與轉(zhuǎn)移行為相關(guān)聯(lián)的替代的體外測定法)(圖8)。

針對具有最高的SPARC表達的兩個細胞系(PDAC2和PDAC3)，使用短的發(fā)夾RNA干擾(shRNA)對人胰腺癌中的SPARC的功能進行評估。實施多重體外測定法，包括增殖、遷移、侵襲、刮擦(scratch)和軟瓊脂。阻抑SPARC表達的最深遠的影響是針對遷移行為(圖9和數(shù)據(jù)未示出)，表明SPARC不僅存在于多個CTCs中，并且當在細胞系模型中被抑制時具有功能性結(jié)果。

鑒于這些數(shù)據(jù)，使用PDAC-3進行體內(nèi)尾靜脈接種，以確定SPARC敲減是否影響轉(zhuǎn)移。尾靜脈接種后2周的最初數(shù)據(jù)表明，當SPARC被shRNA抑制時，轉(zhuǎn)移潛能降低，與83％的對照小鼠發(fā)生轉(zhuǎn)移相比，具有抗SPARC的shRNA的細胞系中40％轉(zhuǎn)移(圖10)。

表面蛋白靶標

表9中識別的大部分靶標為分泌因子，將注釋為細胞表面蛋白的基因的分析總結(jié)于表14中。

表14：具有高表達的表面蛋白基因的人單個CTCs的百分數(shù)

在本文考慮之列的是，鑒于這些基因?qū)⒈徽先隒TCs的質(zhì)膜中，這些基因是靶標。一般而言，細胞表面標記的RNA表達趨向于低于細胞的實際蛋白水平。

在本文考慮之列的是用于治療效用的針對IL6ST、SULF2和SV2A的抗體。

1.IL6ST——IL6、LIF、CNTF和制瘤素M的信號轉(zhuǎn)導子

a.對于STAT3激活的下游是重要的。

b.已經(jīng)開發(fā)針對IL6受體和IL6的抗體用于人類疾病(包括癌癥)。

2.SULF2——通過移除6-O-硫酸基團來修飾硫酸肝素的硫酸酯酶

a.在癌癥的進展和轉(zhuǎn)移中富集的表達。

b.已經(jīng)開發(fā)針對硫酸酯酶活性的藥物，并在肝癌模型中測試其活性。

3.SV2Ａ——神經(jīng)內(nèi)分泌細胞中升高的突觸囊泡糖蛋白

a.神經(jīng)內(nèi)分泌細胞的標記，其在人胰腺癌的上皮間質(zhì)邊界處出現(xiàn)。

b.癌癥中的神經(jīng)內(nèi)分泌分化共同特征，并且預(yù)示著更嚴重的疾病。

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實施例4

循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)從原發(fā)腫瘤脫落進入血流中，介導癌癥血源性擴散至遠端器官。為了界定其構(gòu)成，對小鼠胰腺癌模型中的CTCs與匹配的原發(fā)腫瘤的全基因組水平表達譜進行比較，利用非表位依賴型微流體捕獲來分離單個CTCs，隨后進行單細胞RNA測序。CTC與原發(fā)腫瘤和腫瘤衍生細胞系分開成簇，顯示出低的增殖指征、Aldhla2的富集、上皮和間充質(zhì)標記的雙表型表達以及Igfbp5(在上皮-間質(zhì)界面處富集的基因轉(zhuǎn)錄物)的表達。小鼠以及人胰腺CTCs表現(xiàn)出間質(zhì)衍生的胞外基質(zhì)(ECM)蛋白(包括SPARC)的極高的表達，其在癌細胞中的敲減阻抑了細胞遷移和侵襲。CTCs異常表達間質(zhì)ECM基因表明其有助于癌癥擴散至遠端器官的微環(huán)境信號。

典型CTCs主要表達Aldh1a2同工型，而Aldhla1在多種細胞類型中表達(數(shù)據(jù)未示出)。在單個CTCs內(nèi)，Aldh1同工型的表達與間充質(zhì)基因(Cdh11、Vim)的富集或上皮基因(Cdh1、Mucl)的喪失均無關(guān)，表明在CTCs中干細胞和EMT標記并不存在固有的關(guān)聯(lián)。利用RNA原位雜交(RNA-ISH)對原發(fā)胰腺腫瘤進行Aldh1a2分析識別了表達該干細胞標記的罕見的上皮腫瘤細胞，然而大部分的表達存在于癌癥相關(guān)的間質(zhì)細胞內(nèi)(圖12A)，這與人PDAC中的ALDH蛋白的免疫組化相一致(Rasheed等，2010)。

除了CTCs的明顯多樣性外，對共享的轉(zhuǎn)錄物檢索可提供關(guān)于其在原發(fā)腫瘤內(nèi)的細胞起源、其侵系并在血流中存活的機制的進一步理解以及最終識別CTC特異性治療靶標。選擇嚴格的標準來識別最高度富集的CTC-c轉(zhuǎn)錄物(RP得分<300)，所述CTC-c轉(zhuǎn)錄物在R90％的全部典型CTCs中以極高水平表達(>100rpm)。三個基因滿足如下這些標準：Kruppel樣因子4(Klf4)，干細胞(iPS)重編程關(guān)鍵因子之一(Takahashi和Yamanaka，2006)；胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白5(Igfbp5)，一種胞外生長因子結(jié)合蛋白；以及核心蛋白聚糖(Dcn)。利用RNA-ISH在原發(fā)腫瘤試樣中識別這三個高度富集的CTC基因的潛在的共定位。與Aldh1a2相比，Klf4在原發(fā)腫瘤的上皮組分中表達(圖12B)。Igfbp5特別令人感興趣之處在于，其表達集中于腫瘤的上皮-間質(zhì)界面處(圖12C)。在本文考慮之列的是，如單個CTCs的RNA-seq所表明的，這一位置區(qū)域富集經(jīng)歷EMT的癌細胞，有助于混合的上皮/間質(zhì)轉(zhuǎn)錄程序。

除了高度表達Dcn外，CTCs一致地具有高水平的多個ECM基因轉(zhuǎn)錄物。全部的CTC富集的基因的GO分析(表3)識別了32個蛋白質(zhì)性質(zhì)的ECM基因(GO:0005578，OR 2.4，q值4.8 3 10.3)。這些基因通常在反應(yīng)性間質(zhì)細胞中而非上皮癌細胞中表達；并且雖然最近的研究強調(diào)了間質(zhì)在支持胰腺癌的發(fā)病機制和轉(zhuǎn)移方面的重要性(Feig等，2012；Neesse等，2011，2013；Olive等，2009；Provenzano等，2012)，循環(huán)的腫瘤細胞內(nèi)的這些間質(zhì)相關(guān)ECM基因的表達也是出乎預(yù)料的。使用RP差異化表達分析，將CTCs與純化的帶有EGFP標簽的原發(fā)腫瘤單細胞(TuGMP3)及塊狀腫瘤樣本(腫瘤細胞與反應(yīng)性間質(zhì)細胞相混合)進行比較。六個蛋白質(zhì)性質(zhì)的ECM基因被CTCs和基質(zhì)組分高度表達，而并不被原發(fā)腫瘤內(nèi)的上皮細胞表達：Dcn、Sparc、Ccdc80、Col1a2、Col3a1和Timp2(數(shù)據(jù)未示出)。Dcn和Sparc二者的RNA-ISH分析證實了在小鼠原發(fā)腫瘤的間質(zhì)要素中的廣泛表達，而在上皮-間質(zhì)邊界的少數(shù)區(qū)域處這些轉(zhuǎn)錄物與角蛋白表達細胞共定位(數(shù)據(jù)未示出)。

SPARC為ECM蛋白基因。198個原發(fā)的人PDAC的RNA-ISH分析表明了在99％的情形下的SPARC轉(zhuǎn)錄物的豐富的間質(zhì)細胞表達，以及上至三分之一的腫瘤具有罕見的表達該ECM基因產(chǎn)物的上皮細胞(數(shù)據(jù)未示出)。與這些觀察結(jié)果一致的是，帶有EGFP標簽的單個原發(fā)腫瘤細胞的RNA-seq(數(shù)據(jù)未示出)識別出在20個細胞中僅有1個細胞(5％)具有高水平(>100rpm)的Sparc和Krt19的共表達。

概括來說，ECM基因的豐富表達是全部的富角蛋白的典型CTCs的共同特征。這與原發(fā)腫瘤成鮮明的對比，在原發(fā)腫瘤中這些基因產(chǎn)物被支持性間質(zhì)細胞、而不是被上皮癌細胞所分泌。然而，在原發(fā)腫瘤的上皮-間質(zhì)界面處的罕見的細胞看起來同時表達角蛋白和ECM基因，這與在CTCs自身中觀察到的模式一致。

為了證實在血流中循環(huán)的人癌細胞的蛋白質(zhì)性質(zhì)的ECM基因的表達，從患有胰腺癌(n＝7)、乳腺癌(n＝29)和前列腺癌(n＝77)的患者分離單個CTCs，并使其接受單細胞RNA-seq。六個ECM蛋白基因在人CTCs中高度表達(在>15％的全部CTC樣本中>100rpm)(圖13；表13)。尤其是，三個基因(SPARC、MGP、SPON2)為ECM糖蛋白，其被定義為核心基質(zhì)體(matrisome)的一部分(Naba等，2012)。核心基質(zhì)體蛋白SPARC在胰腺CTCs中特別富集，在100％的胰腺CTCs(相比于31％的乳腺CTCs和9％的前列腺CTCs)中以高水平表達(>100rpm)。人上皮CTCs之間的ECM蛋白基因表達方面的顯著差異表明微環(huán)境的組織特異性以及ECM蛋白信號轉(zhuǎn)導方面的可能的冗余性?？傊?，人CTCs中的ECM基因家族成員的一致性表達表明其上調(diào)有助于從原發(fā)腫瘤產(chǎn)生CTCs、或者有助于在其循環(huán)進入血流時從微環(huán)境信號剝離的癌細胞的存活。

為了界定胰腺癌細胞中的SPARC表達的功能性結(jié)果，對一組來自患者的低傳代PDAC細胞系的表達進行篩選。識別出了兩個具有相對高的SPARC表達的人PDAC細胞系(PDAC2和PDAC3)，使得能夠?qū)π〉陌l(fā)夾RNA(shRNA)介導的敲減的結(jié)果進行測試(圖8、圖9、圖16A-圖16D)。利用兩個獨立的shRNA構(gòu)建體進行的PDAC2和PDAC3細胞系中的內(nèi)源性的SPARC表達的阻抑不會影響2D培養(yǎng)物的增殖或非貼壁依賴性的腫瘤球的形成(圖14A-圖14B、圖16A-圖16D)。然而，通過兩種shRNA進行的SPARC的敲減顯著降低了創(chuàng)傷刮擦測定法中的胰腺癌細胞遷移以及如體外Boyden測定法所測量的侵襲性質(zhì)(數(shù)據(jù)未示出)。

與表達非靶標的發(fā)夾(shNT)對照的細胞相比，利用兩種shRNA構(gòu)建體進行的SPARC阻抑型PDAC3細胞的尾靜脈注射產(chǎn)生顯著更少的肺轉(zhuǎn)移(圖14D)。如通過熒光素酶成像和原發(fā)腫瘤大小歸一化所測量的，對于SPARC阻抑型PDAC3細胞，從正位胰腺異種移植物生成的轉(zhuǎn)移也顯著減少(圖14E)。因此，胰腺癌細胞的SPARC表達看起來選擇性地增強其侵襲和遷移性質(zhì)，增強了轉(zhuǎn)移惡性。SPARC表達的高水平在實質(zhì)上全部的胰腺CTCs中是明顯的，因此提出其明顯有助于胰腺癌轉(zhuǎn)移擴散的可能性。

討論

本文所述的為使用單細胞RNA-seq對胰腺癌中的CTC組成和多樣性進行的詳細分析。在93個單個小鼠胰腺CTCs中獲得高質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄組，并與來自匹配的原發(fā)腫瘤和來自從相同的小鼠胰腺腫瘤模型建立的永生化細胞系的塊狀和單細胞制備物進行比較。KPC小鼠模型的使用使得能夠?qū)⑼瑫r分離的原發(fā)腫瘤試樣和CTCs進行比較，并允許測量共享相同的Kras/Trp53遺傳驅(qū)動物的多個小鼠間的CTC異質(zhì)性。來自這些細胞的大量的分離的CTCs和高質(zhì)量的分離的RNA反映出CTC-iChip技術(shù)的應(yīng)用，其有效地耗竭了正常的血液成分，富集CTC不帶標簽的并使得單細胞操作成為可能。最后，不管其細胞表面表位，CTC的純化避免了與基于共同的上皮標記(例如EpCAM)表達的純化有關(guān)的任何偏倚。

總之，本文的觀察結(jié)果包括如下：(1)CTC表達譜聚類為三類，包括主要的“典型CTC”組以及通過血小板衍生標記或增殖指征界定的其它組。(2)實質(zhì)上全部的典型CTCs共享的共同特征包括上皮和間充質(zhì)標記、干細胞相關(guān)基因Aldh1a2以及三個高表達的轉(zhuǎn)錄物Klf4、Igfbp5和Dcn的表達。Igfbp5表達細胞在原發(fā)腫瘤內(nèi)的上皮-間質(zhì)邊界處的特異性定位可指明顯著有助于CTC生成的區(qū)域。(3)被幾乎全部的典型CTCs共享的最高度富集的CTC特異性轉(zhuǎn)錄物編碼胞外基質(zhì)蛋白，例如Sparc。(4)在小鼠和人胰腺CTCs中均觀察到CTCs中的該ECM基因產(chǎn)物的異常表達(其通常在腫瘤間質(zhì)區(qū)室中豐富)，并且該基因的敲減減弱了重構(gòu)體系中的癌細胞遷移和侵襲(圖15)。與部分純化的塊狀CTC群體的RNA-seq(需要白細胞衍生的讀數(shù)的數(shù)字減影)(Yu等，2012，2013)相比，本文報告的單細胞分析提供了顯著更為深入的腫瘤細胞特異性轉(zhuǎn)錄物讀數(shù)，并且使得能夠?qū)TC異質(zhì)性進行測量。

在本文考慮之列的是，除了起始突變外，可用體細胞獲得性遺傳和表觀遺傳改變對衍生自不同腫瘤的CTCs進行區(qū)分。多個小鼠腫瘤有助于三個獨特的CTCs簇中的每一個。雖然其具有非典型的表達模式，通過其包含帶有品系標簽的腫瘤細胞，證實了將血小板相關(guān)和增殖的CTC子類識別為腫瘤衍生的。通過典型的CTC簇所表現(xiàn)出的更加特征性的表達模式使得能夠與原發(fā)腫瘤細胞進行詳細比較，從而提供對CTCs起源和性質(zhì)的進一步的深刻理解。

小鼠胰腺的典型CTCs一律喪失上皮標記E-鈣粘蛋白(Cdh1)的表達，其為上皮-至-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵特征。然而，細胞不喪失其它上皮標記(例如細胞角蛋白)的表達，也不存在典型的間充質(zhì)標記(例如波形蛋白)的一致的增高。就這一點而言，大部分典型CTCs表現(xiàn)出停滯在雙表型狀態(tài)。雖然其表達存在于原發(fā)腫瘤的上皮組分中的細胞角蛋白，CTCs中的大部分的其它高度表達的標記與原發(fā)腫瘤的間質(zhì)組分共享。在這些間質(zhì)基因中為Aldh1a2(Rasheed和Matsui，2012；Rasheed等，2010)。與典型CTCs的共享的上皮和間充質(zhì)狀態(tài)相關(guān)的令人興奮的觀察結(jié)果是其實質(zhì)上普遍(93％)表達Igfbp5，Igfbp5在原發(fā)腫瘤內(nèi)的上皮/間質(zhì)界面處的小部分的細胞中特有表達。這提出了如下可能：該原發(fā)腫瘤中的關(guān)鍵定位產(chǎn)生了不成比例部分的有活力的CTCs。

來自單CTC RNA-seq研究的最出乎預(yù)料的觀察結(jié)果是絕大多數(shù)典型CTCs中的ECM轉(zhuǎn)錄物的高豐度。表達這些ECM基因產(chǎn)物的單細胞中的胰腺癌富集的細胞角蛋白(Krt7和Krt19)的共表達排除了其代表循環(huán)的腫瘤衍生的成纖維細胞的可能性。

與一些胰腺癌細胞中的SPARC的異常表達相一致的是，患者衍生的腫瘤細胞系的一個子類也共表達SPARC和上皮細胞角蛋白。在SPARC敲減后通過這些胰腺細胞系表現(xiàn)出的細胞遷移和轉(zhuǎn)移潛能的降低表明了SPARC有助于CTC介導的轉(zhuǎn)移。在本文考慮之列的是，Sparc表達有助于轉(zhuǎn)移，然而在一些實施方式中ECM蛋白表達的內(nèi)在的冗余可緩和該效應(yīng)。

已針對靶向胰腺癌間質(zhì)作為改進化療劑遞送和從其支持性微環(huán)境中剝離腫瘤細胞的手段做出大量努力(Neesse等，2011；Olive等，2009；Provenzano等，2012；Rasheed等，2012)。本文描述的發(fā)現(xiàn)(例如這些基因產(chǎn)物也被CTC本身表達)表明顯著水平的細胞可塑性。就CTCs的侵襲性質(zhì)部分地由此類ECM蛋白的表達介導而言，也提出了靶向血液中的癌細胞的可能。

表13：人CTC ECM基因表達

表10：CTC-c vs CTC-pro中富集的最顯著的基因集合

q值<0.01

表11：CTC-c vs CTC-plt中富集的最顯著的基因集合

q值<0.01

表12：借助秩生成顯著表達的基因(FDR<0.01)

表12和表13中列出的基因名稱為慣用名稱。表12或表13中列出的各基因的NCBI基因ID號可通過使用慣用名稱作為查詢物檢索NCBI“基因”數(shù)據(jù)庫(可在萬維網(wǎng)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/上得到)并選擇首個返回的智人(Homo sapiens)基因而獲得?？墒褂肬CSC基因組瀏覽器(可在萬維網(wǎng)http://genome.ucsc.edu上得到)的基因分選器功能獲得其它基因。在一些實施方式中，標記基因選自表13和/或表12中列出的基因。

在一些實施方式中，所述標記基因選自在表13中的至少一類CTC中被表明上調(diào)的標記基因，例如標記基因1-142。在一些實施方式中，所述標記基因選自在表12中的至少一類CTC中被表明上調(diào)的標記基因，例如標有“CTC-c vs.原發(fā)腫瘤富集的基因”或“CTC-c vs.WBC”列中列出的標記基因。

在CTC中，表13或表12中列出的標記基因可被上調(diào)，例如，對于表13和/或表12中列出的標記基因而言，如果與標記基因表達的參比水平相比，在細胞或樣本中測得的該標記基因表達較高，則所述細胞被識別為CTC和/或樣品被識別為包含CTCs。優(yōu)選地，一度關(guān)注的是統(tǒng)計學上顯著的改變。然而，即便組中的少數(shù)基因并未與正常的不同，如果組的整體改變表現(xiàn)為顯著的改變、優(yōu)選統(tǒng)計學上顯著的改變，則樣本可被識別為包含CTCs。在本文考慮之列的是兩種以上的所指出的標記的全部可能組合。