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一種將阿維菌渣轉(zhuǎn)化為乳酸乳球菌素的方法及其培養(yǎng)基與流程

文檔序號:12097661閱讀:525來源:國知局

本發(fā)明涉及抗生素發(fā)酵菌渣再利用技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種將阿維菌渣轉(zhuǎn)化為乳酸乳球菌素的方法及其培養(yǎng)基。



背景技術(shù):

阿維菌素是一種十六元大環(huán)內(nèi)酯化合物,是一種殺蟲殺螨生物農(nóng)藥。1975年,由日本北里研究所(Kitasato Institute)的大村智從阿維鏈霉菌中分離得到的。與大多數(shù)殺蟲劑不同的是,阿維菌素的作用機制是干擾害蟲神經(jīng)生理活動,刺激釋放γ-氨基丁酸從而抑制節(jié)肢動物的神經(jīng)傳導,但對脊椎動物無害。由于其具有高效、廣譜、安全、殘留少等殺蟲特點,現(xiàn)如今已在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)以及醫(yī)學上有廣泛應(yīng)用。

阿維菌渣是在阿維菌素生產(chǎn)過程中提取出阿維菌素后剩下的物質(zhì),其主要成分包括阿維菌素生產(chǎn)菌種的菌絲體、極少量的未利用完的培養(yǎng)基、微量的阿維菌素以及在提取過程中加入的固體介質(zhì)等。截止2014年3月止,我國有16家企業(yè)生產(chǎn)阿維菌素原藥,原料產(chǎn)能占國際市場的100%。不完全統(tǒng)計,國內(nèi)阿維菌素每年的總產(chǎn)量約為5500噸。以內(nèi)蒙古新威遠生物化工有限公司為例,該公司阿維菌素的年產(chǎn)量達300噸以上,而其阿維菌渣每年的排放量達2500噸之多。由此可粗略估算出阿維菌素與阿維菌渣在生產(chǎn)中比例約為1:8。以此比例進行保守估計,我國每年產(chǎn)出的阿維菌渣達4.4萬噸。菌渣中含有大量的有機廢棄物。以內(nèi)蒙古新威遠生物化工有限公司生產(chǎn)所得的阿維菌渣為例,按照相應(yīng)的國家標準方法(GB5009.5-2010、GB/T15672-2009和GB/T6433-2006)測定,其中干基中粗蛋白的含量為33.89%,總糖含量為29.17%,脂肪含量為6.20%,珍珠巖含量為12%,活性炭含量為0.6%,其他18.14%。由此可見,阿維菌渣中含有大量的碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂類等可被二次利用的生物質(zhì)。然而,依據(jù)我國2008版和2016版修訂后的《國家危險廢物名錄》,阿維菌渣屬于一類抗生素菌渣,明確禁止用作飼料或飼料添加劑。目前,對于內(nèi)蒙古新威遠生物化工有限公司來說,阿維菌渣唯一的處理方式就是焚燒碳化處理,并且是出資請專業(yè)公司進行焚燒。這種處理方式不僅增加了阿維菌素生產(chǎn)企業(yè)的成本,同時造成了生物質(zhì)資源的浪費,也增加了碳排放和大氣的污染。

Nisin,又名乳酸乳球菌素,是由34個氨基酸殘基組成的小分子多肽,由乳酸乳球菌產(chǎn)生。由于其對大部分革蘭氏陽性菌有高效抑制的作用,且被食用后能在消化道里迅速被降解成氨基酸,對人體安全無毒,是國家唯一允許用于食品工業(yè)的生物食品防腐劑。Nisin的生產(chǎn)需要豐富的營養(yǎng),尤其對氨基酸或蛋白質(zhì)的需求量更大。阿維菌渣干基中不僅蛋白質(zhì)含量豐富,且含有的大量的糖分,而這些都是乳酸乳球菌生產(chǎn)nisin必不可少的營養(yǎng)物質(zhì)。如果能把阿維菌渣利用乳酸乳球菌轉(zhuǎn)化成高附加值的nisin,不僅能實現(xiàn)對阿維菌渣的再利用,,而且還能大幅增加阿維菌素生產(chǎn)企業(yè)的經(jīng)濟效益。那么,如何實現(xiàn)阿維菌渣的再利用,如何將阿維菌渣轉(zhuǎn)化成高附加值的物質(zhì),實現(xiàn)變廢為寶,降低生產(chǎn)成本,從而大幅增加阿維菌素生產(chǎn)企業(yè)的經(jīng)濟效益,成為了一個亟待解決的問題。



技術(shù)實現(xiàn)要素:

針對現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷,本發(fā)明目的在于提供一種將阿維菌渣轉(zhuǎn)化為乳酸乳球菌素的方法及其培養(yǎng)基,以解決阿維菌渣對環(huán)境的污染問題,實現(xiàn)阿維菌渣的再利用,同時為乳酸乳球菌素的生產(chǎn)提供原料來源,實現(xiàn)阿維菌渣的再資源化和高值化轉(zhuǎn)化,降低生產(chǎn)成本,提高經(jīng)濟效益。

為實現(xiàn)上述目的,本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:

第一方面,本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)基,包括阿維菌渣。需要說明的是,阿維鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)阿維菌素過程中,提取產(chǎn)物阿維菌素后,剩余的物質(zhì)為阿維菌渣;阿維菌渣主要成分是阿維菌素生產(chǎn)菌種的菌絲體,即阿維鏈霉菌的菌絲體,阿維菌渣還包括極少量的未利用完的培養(yǎng)基、微量的阿維菌素和在提取過程中加入的固體介質(zhì)。阿維菌渣可以作為唯一的碳源和氮源,也就是說,在培養(yǎng)基中不需要添加其它的碳源和氮源。

在本發(fā)明的進一步實施方式中,還包括磷酸二氫鉀(KH2PO4)、氯化鈉(NaCl)和七水硫酸鎂(MgSO4·7H2O)。

在本發(fā)明的進一步實施方式中,所述培養(yǎng)基中,所述阿維菌渣的質(zhì)量以干重計為30~360g/L,所述磷酸二氫鉀的終濃度為15~25g/L、所述氯化鈉的終濃度為1.0~2.0g/L,所述七水硫酸鎂的終濃度為0.10~0.20g/L;所述培養(yǎng)基的pH為6.8~7.2。在培養(yǎng)基中,阿維菌渣的質(zhì)量以干重計優(yōu)選為180~360g/L。

在本發(fā)明的進一步實施方式中,所述阿維菌渣是以干粉的形式加入,所述干粉的粒徑≤0.250mm。需要說明的是,將阿維菌渣溶于水之前,可以將阿維菌渣在105℃干燥至恒重,然后粉粹過篩,收集粒徑小于或等于0.250mm的阿維菌渣干粉。

第二方面,本發(fā)明提供了一種制備上述培養(yǎng)基的方法,包括如下步驟:將所述磷酸二氫鉀、所述氯化鈉、所述七水硫酸鎂和所述阿維菌渣與水混合均勻,并調(diào)節(jié)pH值至6.8~7.2,即得。水優(yōu)選為蒸餾水。

第三方面,本發(fā)明提供了一種發(fā)酵生產(chǎn)乳酸乳球菌素的方法,包括如下步驟:將乳酸乳球菌接種至上述的培養(yǎng)基中,發(fā)酵生產(chǎn),得到乳酸乳球菌素。

在本發(fā)明的進一步實施方式中,將所述乳酸乳球菌培養(yǎng)至對數(shù)中期,然后進行所述接種,所述接種的菌種量與所述培養(yǎng)基的體積比為(3~8):100;所述乳酸乳球菌為Lactococcus lactis subsp.lactis YF11。

在本發(fā)明的進一步實施方式中,在所述發(fā)酵生產(chǎn)中,溫度為28~32℃,攪拌轉(zhuǎn)速為100~200r/min,發(fā)酵時間為8~12h。

在本發(fā)明的進一步實施方式中,所述方法還包括在所述接種前對所述培養(yǎng)基進行滅菌的步驟。

第四方面,本發(fā)明提供了一種將阿維菌渣轉(zhuǎn)化為乳酸乳球菌素的方法,利用包括上述任一項所述的方法進行轉(zhuǎn)化。需要說明的是,只要涵蓋上述發(fā)酵生產(chǎn)乳酸乳球菌素的方法,包括前序?qū)Π⒕S菌渣進行其他處理或在后序?qū)θ樗崛榍蚓靥崛?、純化等,均屬于本發(fā)明的保護范圍;在上述方法的基礎(chǔ)上進行無實質(zhì)內(nèi)容的變化、修改、替換和變型,也應(yīng)該屬于本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明提供的利用阿維菌渣生產(chǎn)乳酸乳球菌素的方法,可以解決阿維菌渣對環(huán)境的污染問題,實現(xiàn)阿維菌渣的再利用,同時為乳酸乳球菌素的生產(chǎn)提供原料來源,實現(xiàn)阿維菌渣的再資源化和高值化轉(zhuǎn)化,降低生產(chǎn)成本,提高經(jīng)濟效益。

本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出,部分將從下面的描述中變得明顯,或通過本發(fā)明的實踐了解到。

具體實施方式

下面將對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述,顯然,所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例,而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例,本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例,都屬于本發(fā)明保護的范圍。

下述實施例中的實驗方法,如無特殊說明,均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的試驗材料,如無特殊說明,均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。

以下實施例中的定量試驗,均設(shè)置三次重復實驗,數(shù)據(jù)為三次重復實驗的平均值或平均值±標準差。

本發(fā)明所利用的阿維菌渣是由內(nèi)蒙古新威遠生物化工有限公司提供的阿維菌渣,所用菌種乳酸乳球菌是Lactococcus lactis subsp.lactis YF11(菌種保藏號:CGMCC7.52)。

本發(fā)明提供一種發(fā)酵生產(chǎn)乳酸乳球菌素的方法,包括如下步驟:

S1:將磷酸二氫鉀、氯化鈉和七水硫酸鎂和阿維菌渣溶于水,阿維菌渣的質(zhì)量以干重計為30~360g/L,磷酸二氫鉀的終濃度為15~25g/L,氯化鈉的終濃度為1.0~2.0g/L,七水硫酸鎂的終濃度為0.10~0.20g/L,混合均勻,將得到的培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH至6.8~7.2,然后滅菌;將阿維菌渣溶于水之前,還包括優(yōu)選步驟:將阿維菌渣處理為干粉末,然后過篩,收集粒徑小于或等于0.250mm的阿維菌渣干粉。

S2:將乳酸乳球菌接種至滅菌后的培養(yǎng)基中,發(fā)酵生產(chǎn),得到乳酸乳球菌素;優(yōu)選將乳酸乳球菌培養(yǎng)至對數(shù)中期,然后進行接種,接種的菌種量與滅菌后的培養(yǎng)基的體積比為(3~8):100;乳酸乳球菌為Lactococcus lactis subsp.lactis YF11;在發(fā)酵生產(chǎn)中,溫度優(yōu)選為28~32℃,攪拌轉(zhuǎn)速優(yōu)選為100~200r/min,發(fā)酵時間優(yōu)選為8~12h。

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明提供的發(fā)酵生產(chǎn)乳酸乳球菌素的方法進一步說明。

實施例一

將阿維菌渣在105℃干燥后粉粹,得到阿維菌渣干粉末,然后過60目篩,收集粒徑小于或等于0.250mm的阿維菌渣干粉;稱取9g阿維菌渣干粉,加入KH2PO4、NaCl和MgSO4·7H2O,再加入蒸餾水至50mL,使阿維菌渣以干重計為180g/L,KH2PO4終濃度為15g/L,NaCl終濃度為1.0g/L,MgSO4·7H2O終濃度0.10g/L,混合均勻,調(diào)節(jié)得到的培養(yǎng)基的pH為6.8,經(jīng)過121℃高壓滅菌20min后冷卻至30℃,即得滅菌后培養(yǎng)基。將培養(yǎng)至對數(shù)中期的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis subsp.lactis YF11)以3%的接種量(接種的菌種量與所述滅菌后的培養(yǎng)基的體積比)接種至滅菌后培養(yǎng)基中,在溫度為28℃、攪拌轉(zhuǎn)速為100r/min下培養(yǎng)8h后,終止發(fā)酵,得到菌渣發(fā)酵液,主要包括乳酸乳球菌素和乳酸乳球菌。

實施例二

將阿維菌渣在105℃干燥后粉粹,得到阿維菌渣干粉末,然后過60目篩,收集粒徑小于或等于0.250mm的阿維菌渣干粉;稱取12g阿維菌渣干粉,加入KH2PO4、NaCl和MgSO4·7H2O,再加入蒸餾水至50mL,使阿維菌渣以干重計為240g/L,KH2PO4終濃度為20g/L,NaCl終濃度為1.5g/L,MgSO4·7H2O終濃度0.15g/L,混合均勻,調(diào)節(jié)得到的培養(yǎng)基的pH為7.0,經(jīng)過121℃高壓滅菌20min后冷卻至30℃,即得滅菌后培養(yǎng)基。將培養(yǎng)至對數(shù)中期的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis subsp.lactis YF11)以5%的接種量(接種的菌種量與所述滅菌后的培養(yǎng)基的體積比)接種至滅菌后培養(yǎng)基中,在溫度為30℃、攪拌轉(zhuǎn)速為150r/min下培養(yǎng)10h后,終止發(fā)酵,得到菌渣發(fā)酵液,主要包括乳酸乳球菌素和乳酸乳球菌。

實施例三

將阿維菌渣在105℃干燥后粉粹,得到阿維菌渣干粉末,然后過60目篩,收集粒徑小于或等于0.250mm的阿維菌渣干粉;稱取18g阿維菌渣干粉,加入KH2PO4、NaCl和MgSO4·7H2O,再加入蒸餾水至50mL,使阿維菌渣以干重計為360g/L,KH2PO4終濃度為25g/L,NaCl終濃度為2.0g/L,MgSO4·7H2O終濃度0.20g/L,混合均勻,調(diào)節(jié)得到的培養(yǎng)基的pH為7.2,經(jīng)過121℃高壓滅菌20min后冷卻至32℃,即得滅菌后培養(yǎng)基。將培養(yǎng)至對數(shù)中期的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis subsp.lactis YF11)以8%的接種量(接種的菌種量與所述滅菌后的培養(yǎng)基的體積比)接種至滅菌后培養(yǎng)基中,在溫度為30℃、攪拌轉(zhuǎn)速為200r/min下培養(yǎng)12h后,終止發(fā)酵,得到菌渣發(fā)酵液,主要包括乳酸乳球菌素和乳酸乳球菌。

將本發(fā)明實施例一至實施例三制備得到的包括乳酸乳球菌素和乳酸乳球菌的菌渣發(fā)酵液進行分析,具體如下。

1、采用菌落計數(shù)的方法分析實施例一至實施例三制備得到的菌渣發(fā)酵液包中的乳酸乳球菌的數(shù)目,結(jié)果如下:實施例一中的菌渣發(fā)酵液的乳酸乳球菌數(shù)為0.70×107個/mL;實施例二中的菌渣發(fā)酵液的乳酸乳球菌數(shù)為1.20×107個/mL;實施例三中的菌渣發(fā)酵液的乳酸乳球菌數(shù)為1.18×107個/mL。

2、采用J.Tramer和C.E.Wolf的瓊脂擴散法分析實施例一至實施例三制備得到的菌渣發(fā)酵液中的乳酸乳球菌素的效價,結(jié)果如下:實施例一中的菌渣發(fā)酵液的乳酸乳球菌素的效價為1682IU/mL;實施例二中的菌渣發(fā)酵液的乳酸乳球菌素的效價為1964IU/mL;實施例三中的菌渣發(fā)酵液的乳酸乳球菌素的效價為1948IU/mL。

需要說明的是,除了上述實施例一至實施例三列舉的情況,選用其它的方法參數(shù)也是可行的。

本發(fā)明提供的利用阿維菌渣生產(chǎn)乳酸乳球菌素的方法,可以將阿維菌渣再利用作為生產(chǎn)乳酸乳球菌素的碳源和氮源,其生產(chǎn)得到的菌渣發(fā)酵液的乳酸乳球菌數(shù)可以達到0.70×107個/mL,乳酸乳球菌素的效價可以達到1682IU/mL,產(chǎn)率較高。本發(fā)明提供的利用阿維菌渣生產(chǎn)乳酸乳球菌素的方法,可以解決阿維菌渣對環(huán)境的污染問題,實現(xiàn)阿維菌渣的再利用,同時為乳酸乳球菌素的生產(chǎn)提供原料來源,實現(xiàn)阿維菌渣的再資源化和高值化轉(zhuǎn)化,降低生產(chǎn)成本,提高經(jīng)濟效益,具有重要的意義。

在本說明書的描述中,參考術(shù)語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中,對上述術(shù)語的示意性表述不必須針對的是相同的實施例或示例。而且,描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點可以在任一個或多個實施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外,在不相互矛盾的情況下,本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將本說明書中描述的不同實施例或示例以及不同實施例或示例的特征進行結(jié)合和組合。

盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例,可以理解的是,上述實施例是示例性的,不能理解為對本發(fā)明的限制,本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型,而并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的范圍,其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求和說明書的范圍當中。

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