本發(fā)明涉及一種利用生物酶轉(zhuǎn)化D-果糖制備D-阿洛酮糖的生產(chǎn)工藝，屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

隨著生活水平的日益提升，人們對食品安全也日漸重視，各種功能性食品和低熱量甜味劑已進(jìn)入市場，并受到消費(fèi)者的高度關(guān)注。D-阿洛酮糖 (D-psicose/D-allulose)，是一種自然界中存在但含量極少的稀有糖類，為D-果糖C-3位的差向異構(gòu)體；其甜度是蔗糖的70％，卻僅提供相當(dāng)于蔗糖0.3%的熱量，是食品中蔗糖的最佳代替品。韓國希杰第一制糖株式會社和日本松谷集團(tuán)分別于2011年和2013年向美國食品藥品監(jiān)督管理局 (FDA) 申請D-阿洛酮糖的“一般認(rèn)為安全”(GRAS) 認(rèn)定，都得到“沒有問題”的答復(fù)。此外，阿洛酮糖在保健和醫(yī)療等領(lǐng)域也具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

D-阿洛酮糖主要有生物合成與化學(xué)合成兩種途徑。相較于化學(xué)合成，生物合成的方法更為環(huán)保，有利于后續(xù)產(chǎn)物的分離純化，具有重大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。韓國希杰第一制糖株式會社、日本松谷集團(tuán)和英國泰萊公司是目前全球生產(chǎn)D-阿洛酮糖的三大廠家，他們均通過改良的重組菌株生產(chǎn)D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶，并利用該酶催化果糖生產(chǎn)D-阿洛酮糖，均已實(shí)現(xiàn)D-阿洛酮糖的商用化。與國外相比，國內(nèi)對D-阿洛酮糖的研究相對落后。江南大學(xué)最先通過對魚塘淤泥和水樣篩選，得到一株能合成D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶的類球紅細(xì)菌，其能催化D-果糖生成D-阿洛酮糖，轉(zhuǎn)化率最高達(dá)到6.54%。但是生物法也存在一定的弊端，目前酶法生產(chǎn)D-阿洛酮糖主要受制于所用酶的催化效率低、底物粘度大以及生產(chǎn)工藝繁瑣等。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種酶法轉(zhuǎn)化D-果糖高效制備D-阿洛酮糖的生產(chǎn)工藝，該法工藝簡單，生產(chǎn)過程中不使用任何化學(xué)制劑且實(shí)現(xiàn)物料循環(huán)，是純綠色制備D-阿洛酮糖的方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案：通過研究酶液添加量、反應(yīng)溫度、底物起始濃度及反應(yīng)時(shí)間四個(gè)因素對阿洛酮糖轉(zhuǎn)化率的影響，確定酶法制備D-阿洛酮糖的最佳反應(yīng)條件。在優(yōu)化條件下利用D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶對D-果糖溶液進(jìn)行轉(zhuǎn)化，反應(yīng)液經(jīng)脫色、離交、濃縮、色譜分離、結(jié)晶等工藝制備液體或結(jié)晶阿洛酮糖，生產(chǎn)過程中物料可循環(huán)，色譜分離后的提余液、離心后母液進(jìn)入循環(huán)進(jìn)行酶轉(zhuǎn)化，提高阿洛酮糖收率。阿洛酮糖含量或純度利用高效液相色譜（HPLC）檢測。

所涉及到的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶由實(shí)驗(yàn)室自行發(fā)酵制備。

所涉及到的D-果糖為本公司產(chǎn)品，純度達(dá)99%。

所述的D-阿洛酮糖含量或純度的測定方法：

利用HPLC對生成的D-阿洛酮糖含量或純度進(jìn)行分析，根據(jù)保留時(shí)間定性，色譜峰面積歸一化法定量。

所述的酶法制備反應(yīng)條件的初步研究：

本發(fā)明中分別對影響阿洛酮糖酶法制備的4個(gè)因素 (酶液添加量、反應(yīng)溫度、底物起始濃度和反應(yīng)時(shí)間) 進(jìn)行單因素試驗(yàn)，每確定一因素將作為下一單因素實(shí)驗(yàn)的固定條件，最終獲得的最佳條件用于D-阿洛酮糖的制備。

所述的酶法制備工藝主要包括酶轉(zhuǎn)化、脫色、離子交換、濃縮、色譜分離、結(jié)晶工序。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供了一種酶法轉(zhuǎn)化D-果糖高效制備D-阿洛酮糖的生產(chǎn)工藝，該法工藝簡單，生產(chǎn)過程中不使用任何化學(xué)制劑且實(shí)現(xiàn)物料循環(huán)，所用酶的催化活力較高，是純綠色制備D-阿洛酮糖的方法，有較大的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1：D-阿洛酮糖的酶法制備工藝圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明的操作方法。但是這些實(shí)施例僅用于詳細(xì)說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1

D-阿洛酮糖酶法制備條件的初步研究：

(1) 酶液添加量：以去離子水構(gòu)建反應(yīng)體系在50℃條件下，分別用不同的酶量 (10~50 μL×g^-1 D-果糖) 將500 g×L^-1的D-果糖溶液轉(zhuǎn)化10 h，然后用HPLC測定反應(yīng)體系中D-阿洛酮糖的含量。結(jié)果顯示隨著酶液添加量的增加，D-阿洛酮糖的含量逐漸增加，當(dāng)酶液添加量達(dá)到30 μL×g^-1 D-果糖時(shí)，最高含量為26.3%，然后逐漸降低。

(2) 反應(yīng)溫度：以去離子水構(gòu)建反應(yīng)體系在不同溫度下 (50~60℃)，分別用30 μL×g^-1 D-果糖的酶液添加量將500 g×L^-1的D-果糖溶液轉(zhuǎn)化10 h，然后用HPLC測定反應(yīng)體系中D-阿洛酮糖的含量。結(jié)果顯示D-阿洛酮糖的含量隨溫度升高而增加，當(dāng)反應(yīng)溫度為55℃時(shí)，D-阿洛酮糖的含量最高可達(dá)26.8%；溫度高于55℃時(shí)，酶轉(zhuǎn)化能力下降。

(3) 底物起始濃度：以去離子水配制不同質(zhì)量濃度的D-果糖溶液 (200~600 g×L^-1)，分別用30 μL×g^-1 D-果糖的酶液添加量在55℃下轉(zhuǎn)化10 h，然后用HPLC測定反應(yīng)體系中D-阿洛酮糖的含量。隨著D-果糖溶液濃度的增加，D-阿洛酮糖的含量逐漸增加，在質(zhì)量濃度為500 g×L^-1時(shí)，D-阿洛酮糖的含量最高為28.1%，隨后含量減少。

(4) 反應(yīng)時(shí)間：以去離子水構(gòu)建反應(yīng)體系在55℃條件下，用30 μL×g^-1 D-果糖的酶液添加量將500 g×L^-1的D-果糖溶液轉(zhuǎn)化不同的時(shí)間 (6~12 h)，然后用HPLC測定反應(yīng)體系中D-阿洛酮糖的含量。結(jié)果顯示隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，D-阿洛酮糖的含量逐漸增加，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到10 h時(shí)，D-阿洛酮糖的含量最高可達(dá)27.8%，然后有所減少。

實(shí)施例2

D-阿洛酮糖的酶法制備工藝流程

(1) 酶反應(yīng)：以去離子水構(gòu)建500 g×L^-1的D-果糖溶液，酶液添加量為30 μL×g^-1 D-果糖，反應(yīng)溫度55℃，反應(yīng)時(shí)間10 h后升溫至100℃滅酶。

(2) 脫色：加入料液干重0.1~5%活性炭，溫度70~100℃保溫30 min，采用陶瓷膜將活性炭脫除。

(3) 離交：料液經(jīng)陽-陰-陽離子交換樹脂除鹽降低電導(dǎo)，要求糖濃30%時(shí)電導(dǎo)0~100 μs/cm。

工藝流程如圖1所示，D-果糖經(jīng)酶轉(zhuǎn)化后得到D-阿洛酮糖含量達(dá)27-30%；反應(yīng)液先經(jīng)過活性炭脫色，后經(jīng)離子交換樹脂除鹽再濃縮所得的阿洛酮糖糖漿1純度達(dá)27-30%；將阿洛酮糖和果糖經(jīng)過色譜分離，重新進(jìn)行活性炭脫色、離交和濃縮所得的阿洛酮糖糖漿2純度達(dá)98%以上；將糖漿2進(jìn)行結(jié)晶，所得阿洛酮糖晶體純度達(dá)99%以上。