本發(fā)明屬于分子生物技術(shù)領(lǐng)域,涉及一種斷奶仔豬抗應(yīng)激生理反應(yīng)能力的標(biāo)記引物和方法。
背景技術(shù):
仔豬早期斷奶導(dǎo)致早期斷奶綜合癥,采食量下降,體重減輕甚至停滯不長(zhǎng),免疫力下降,腸道結(jié)構(gòu)和功能遭到破壞,容易發(fā)生腹瀉和水腫,重度的會(huì)致死。早期斷奶綜合征導(dǎo)致的仔豬生長(zhǎng)受阻,給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。仔豬斷奶相關(guān)研究一直是熱點(diǎn),Dunsford等(1989)研究發(fā)現(xiàn),21日齡斷奶仔豬在斷奶后第3天腸絨毛高度顯著下降,這種顯著變化持續(xù)到斷奶后第12天。顧憲紅等(2001)研究結(jié)果表明斷奶導(dǎo)致仔豬腸絨毛高度縮短,隱窩加深。斷奶導(dǎo)致的仔豬腸道結(jié)構(gòu)這種變化,造成腸道消化吸收面積減小,導(dǎo)致消化能力下降、養(yǎng)分吸收減少。因此,在斷奶后具有更高的腸道發(fā)育狀況的斷奶仔豬生長(zhǎng)狀況會(huì)更加優(yōu)良,也就是說(shuō)具有更強(qiáng)的抗應(yīng)激生理反應(yīng)能力。通過(guò)在斷奶仔豬日糧中添加仔豬所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)從而減輕斷奶應(yīng)激的相關(guān)研究已有很多。李垚等(2005)的研究表明,在21日齡斷奶仔豬日糧中添加表皮生長(zhǎng)因子可以提高促腎上腺皮質(zhì)激素、皮質(zhì)醇、胰島素水平,促進(jìn)肌肉蛋白質(zhì)的合成與周轉(zhuǎn),增加蛋白質(zhì)、脂肪、糖原的合成,刺激細(xì)胞的增殖與分化,有效地緩解斷奶應(yīng)激。楊彩梅等(2005)的研究表明,日糧中添加谷氨酰胺能促進(jìn)斷奶初期仔豬的采食和生長(zhǎng),能提高斷奶仔豬小腸食糜中脂肪酶、淀粉酶和糜蛋白酶的活力。從現(xiàn)有研究中可以了解到,當(dāng)斷奶仔豬豬血清谷氨酰胺酶GA、皮質(zhì)醇Cor含量越高、小腸絨毛高度約高對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用能力就越強(qiáng),斷奶仔豬的抗應(yīng)激生理反應(yīng)能力也就越強(qiáng)。GA是谷氨酰胺分解的關(guān)鍵酶和限速酶,仔豬斷奶后,母源谷氨酰胺消失,小腸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏,體內(nèi)谷氨酰胺水解代謝加強(qiáng)以緩斷奶應(yīng)激。仔豬斷奶后血清Cor濃度會(huì)升高,促進(jìn)仔豬體內(nèi)合成代謝,使仔豬抗應(yīng)激能力加強(qiáng)。Cor是介導(dǎo)動(dòng)物體內(nèi)應(yīng)激反過(guò)程的一種重要中間介質(zhì),血清Cor濃度的高低能靈敏地反映機(jī)體遭受創(chuàng)傷程的強(qiáng)弱,因此可以把GA、Cor看作是判定動(dòng)物遭受應(yīng)激程度的一個(gè)敏感而有效指標(biāo)。尋找到高血清GA、Cor含量和小腸絨毛高度的斷奶仔豬,對(duì)提高斷奶仔豬抗應(yīng)激生理反應(yīng)能力,減少斷奶仔豬因斷奶而引起的生長(zhǎng)狀況下降,提高效益減少養(yǎng)殖成本具有重要的意義。
已有研究表明不同豬種抗應(yīng)激能力存在一定差異,且中國(guó)地方豬種抗應(yīng)激能力普遍較外來(lái)豬種強(qiáng)?,F(xiàn)有的研究表明,血清生化指標(biāo)、腸黏膜形態(tài)是研究斷奶仔豬斷奶應(yīng)激的重要指標(biāo),而現(xiàn)有的研究對(duì)地方豬種和外來(lái)豬種斷奶應(yīng)激差異性的報(bào)道較少。尤其是奶應(yīng)激期,中外豬種仔豬的抗應(yīng)激能力及其遺傳機(jī)理相關(guān)研究目前未見報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明的目的在于以安徽地方優(yōu)良品種安慶六白豬和國(guó)外引進(jìn)品種長(zhǎng)白豬為研究對(duì)象,研究?jī)蓚€(gè)豬種在斷奶應(yīng)激期血清生化指標(biāo)變化、腸黏膜形態(tài)變化。探討品種間斷奶應(yīng)激期仔豬血清指標(biāo)的差異、腸道結(jié)構(gòu)發(fā)育和功能的差異、相關(guān)候選基因表達(dá)的差異以及基因表達(dá)與各抗應(yīng)激生化指標(biāo)的相關(guān)性,旨在找出安徽地方優(yōu)良品種安慶六白豬候選基因與腸道發(fā)育的內(nèi)在聯(lián)系,篩選影響仔豬抗斷奶應(yīng)激能力及腸道發(fā)育的相關(guān)候選基因,為今后品種選育和新品系的建立提供參考。
1.本發(fā)明提供一種比較斷奶仔豬血清GA、Cor含量以及小腸絨毛高度差異的標(biāo)記引物,該引物對(duì)包括GLS、EGFR、IGF-1、IGF-1R;其中,
引物對(duì)GLS,正向引物序列如SEQ ID NO.1所示,反向引物序列如SEQ ID NO.2所示;
引物對(duì)EGFR,正向引物序列如SEQ ID NO.3所示,反向引物序列如SEQ ID NO.4所示;
引物對(duì)IGF-1,正向引物序列如SEQ ID NO.5所示,反向引物序列如SEQ ID NO.6所示;
引物對(duì)IGF-1R,正向引物序列如SEQ ID NO.7所示,反向引物序列如SEQ ID NO.8所示;
2.本發(fā)明還提供一種比較斷奶仔豬血清GA、Cor含量以及小腸絨毛高度差異的方法,該方法分別以與血清GA、Cor含量呈正相關(guān)的候選基因GLS和EGFR的表達(dá)水平比較不同斷奶仔豬個(gè)體血清GA、Cor含量差異,與小腸絨毛高度呈正相關(guān)的候選基因IGF-1、IGF-R的表達(dá)水平比較不同斷奶仔豬個(gè)體腸絨毛高度差異。
3.本發(fā)明還提供一種比較斷奶仔豬腸道發(fā)育狀況的方法,該方法以與斷奶仔豬腸道生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)聯(lián)的血清GA、Cor含量、仔豬小腸絨毛高度為對(duì)象,通過(guò)分析與血清GA、Cor含量呈正相關(guān)的候選基因GLS和EGFR的表達(dá)水平,與小腸絨毛高度呈正相關(guān)的候選基因IGF-1、IGF-R的表達(dá)水平,判定斷奶仔豬腸道發(fā)育狀況,標(biāo)記基因表達(dá)水平高的斷奶仔豬比標(biāo)記基因表達(dá)水平低的斷奶仔豬腸道發(fā)育更良好。
4.上述3提供的比較斷奶仔豬腸道發(fā)育狀況的方法,具體包括如下步驟:(1)斷奶仔豬小腸總RNA提??;(2)引物設(shè)計(jì):分別設(shè)計(jì)候選基因GLS的反轉(zhuǎn)錄引物對(duì)GLS、候選基因EGFR的反轉(zhuǎn)錄引物對(duì)EGFR、候選基因IGF-1的反轉(zhuǎn)錄引物對(duì)IGF-1、候選基因IGF-1R的反轉(zhuǎn)錄引物對(duì)IGF-1R;(3)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA:使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒以步驟(1)得到的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA;(4)采用步驟(2)通過(guò)q-RT-PCR方法測(cè)定候選基因GLS、EGFR、IGF-1、IGF-1R在斷奶仔豬個(gè)體小腸中的表達(dá)量;(5)根據(jù)各候選基因在不同斷奶仔豬個(gè)體的表達(dá)量的差異確定不同斷奶仔豬腸道發(fā)育狀況;
其中,引物對(duì)GLS,正向引物序列如SEQ ID NO.1所示,反向引物序列如SEQ ID NO.2所示;
引物對(duì)EGFR,正向引物序列如SEQ ID NO.3所示,反向引物序列如SEQ ID NO.4所示;
引物對(duì)IGF-1,正向引物序列如SEQ ID NO.5所示,反向引物序列如SEQ ID NO.6所示;
引物對(duì)IGF-1R,正向引物序列如SEQ ID NO.7所示,反向引物序列如SEQ ID NO.8所示。
5.上述4提供的比較斷奶仔豬腸道發(fā)育狀況的方法,其中,步驟(4)所述q-RT-PCR方法具體包括如下步驟:
(1)標(biāo)準(zhǔn)品制備及條件優(yōu)化:每個(gè)待測(cè)RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物取等量混合,將cDNA混合樣按梯度稀釋,用RT-PCR的反應(yīng)體系,對(duì)每個(gè)目的基因作標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)優(yōu)化整個(gè)反應(yīng)條件;
(2)q-RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立和擴(kuò)增曲線:采用RT-PCR方法作目的基因GLS、EGFR、IGF-1、IGF-1R的標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到各個(gè)目的基因及內(nèi)參β-Actin基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線,對(duì)結(jié)果相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)及擴(kuò)增效率均等于或接近于1.000時(shí),表明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)誤差較小,可信度較高,實(shí)驗(yàn)所得的Ct值可準(zhǔn)確地測(cè)定起始cDNA的拷貝數(shù);目的基因和看家基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率小于0.1,表明兩個(gè)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率基本一致,在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中可以使用分析Comparative Delta-delta Ct法進(jìn)行相對(duì)定量分析;
(3)相關(guān)候選基因的q-RT-PCR反應(yīng):采用RT-PCR法檢測(cè)豬GLS、EGFR、IGF-1、IGF-1R、FUT1、LYZ、TAP1、SLA-DQB、TLR4基因及內(nèi)參基因β-Actin在斷奶仔豬小腸各段的表達(dá)量;
(4)數(shù)據(jù)分析:目的基因mRNA表達(dá)豐度采用2-ΔΔCT法對(duì)有效數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)算出每個(gè)樣本目的基因的相對(duì)表達(dá)水平,通過(guò)內(nèi)參基因β-Actin校正;
其中,內(nèi)參基因β-Actin的擴(kuò)增引物對(duì)β-antin上游序列如SEQ ID NO.9所示,下游引物序列如SEQ ID NO.10所示。
6.上述5提供的比較斷奶仔豬腸道發(fā)育狀況的方法,其中,步驟(4)q-RT-PCR反應(yīng)體系為20μL,包括:SYBR綠色熒光染料10μL,上游引物1μL,下游引物1μL,cDNA1μL,超純水7μL;反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性30s;95℃變性10s,退火溫度下退火30s,40個(gè)循環(huán),于65℃5s至95℃5s時(shí)搜集熒光值;其中,引物對(duì)GLS的退火溫度為58.8℃;引物對(duì)EGFR的退火溫度為60℃;引物對(duì)IGF-1和IGF-1R的退火溫度為61℃。
7.上述4提供的比較斷奶仔豬腸道發(fā)育狀況的方法,其中,步驟(3)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA具體包括如下步驟:(1)基因組DNA除去反應(yīng):體系包括:5×gDNA Eraser緩沖液2μL,gDNA Eraser1μL,總RNA1μg,加超純水至10μL;反應(yīng)條件為:42℃反應(yīng)2min,4℃保存,得反應(yīng)液I;(2)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng):體系包括:反應(yīng)液I 10μL,5×PrimeBuffer2 4.0μL,PrimeRT酶混合液I 1.0μL,RT Primer Mix 1.0μL,加超純水至20μL;反應(yīng)條件為:使用普通PCR儀設(shè)置程序37℃反應(yīng)15min,85℃反應(yīng)5s,4℃保存,得反轉(zhuǎn)錄樣品cDNA,檢測(cè)后置于-20℃條件下備用。
8.上述3-7任一項(xiàng)提供的比較斷奶仔豬腸道發(fā)育狀況的方法,其中,所述斷奶仔豬品種為安徽地方品種安慶六白豬。
9.上述3-7任一項(xiàng)提供的方法在斷奶仔豬抗應(yīng)激生理反應(yīng)能力比較中的應(yīng)用,其中,該方法比較GLS、EGFR和IGF-1、IGF-R的表達(dá)水平,基因表達(dá)水平越高,說(shuō)明與基因表達(dá)正相關(guān)的GA、Cor和仔豬小腸絨毛高度水平越高,仔豬斷奶抗應(yīng)激能力越強(qiáng)。
10.上述9提供的方法在斷奶仔豬抗應(yīng)激生理反應(yīng)能力比較中的應(yīng)用,其中,所述斷奶仔豬品種為安徽地方品種安慶六白豬
本申請(qǐng)?zhí)峁┑摹氨容^”概念是斷奶仔豬個(gè)體間的比較,“高低”、“強(qiáng)弱”均是指?jìng)€(gè)體間的比較,根據(jù)GLS、EGFR和IGF-1、IGF-R的表達(dá)水平,確定不同個(gè)體間生化指標(biāo)血清GA、Cor含量的高低以及小腸絨毛高度的大小,從而比較斷奶仔豬不同個(gè)體間腸道發(fā)育以及抗應(yīng)激生理反應(yīng)能力大小。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
1.本申請(qǐng)獲得了斷奶仔豬尤其是安徽地方品種安慶六白豬斷奶仔豬腸道發(fā)育與候選基因表達(dá)差異之間的關(guān)系,填補(bǔ)了現(xiàn)有技術(shù)的空白,由此得出斷奶仔豬抗應(yīng)激生理反應(yīng)能力與候選基因表達(dá)差異之間的關(guān)系,為今后品種選育和新品系的建立提供參考。
2.本發(fā)明以仔豬抗應(yīng)激生化指標(biāo)血清GA、Cor含量以及小腸絨毛高度為參照,在大量基因中尋找到與血清GA、Cor含量以及小腸絨毛高度成正相關(guān)的候選基因,從而根據(jù)候選基因表達(dá)情況可以快速獲得斷奶仔豬尤其是安徽地方品種安慶六白豬斷奶仔豬的腸道發(fā)育以及對(duì)斷奶抗應(yīng)激能力的高低,減少選育過(guò)程中的復(fù)雜性,避免斷奶仔豬因?yàn)槭艿酱碳さ纫蛩貙?dǎo)致生化指標(biāo)急劇變化而與實(shí)際不符,保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性。
附圖說(shuō)明
圖1部分RNA電泳圖
圖2部分cDNA電泳圖;其中,β-Actin條帶114bp
圖3 GLS基因RT-PCR曲線;其中,A圖為標(biāo)準(zhǔn)曲線;B圖為擴(kuò)增曲線;C圖為溶解曲線
圖4 IGF-1基因RT-PCR曲線;其中,A圖為標(biāo)準(zhǔn)曲線;B圖為擴(kuò)增曲線;C圖為溶解曲線
圖5 IGF-1R基因RT-PCR曲線;其中,A圖為標(biāo)準(zhǔn)曲線;B圖為擴(kuò)增曲線;C圖為溶解曲線
圖6 EGFR基因RT-PCR曲線;其中,A圖為標(biāo)準(zhǔn)曲線;B圖為擴(kuò)增曲線;C圖為溶解曲線
圖7 33日齡和39日齡安慶六白豬和長(zhǎng)白豬各腸段黏膜GLS基因表達(dá)情況
圖8 33日齡和39日齡安慶六白豬和長(zhǎng)白豬各腸段黏膜IGF-1基因表達(dá)情況
圖9 33日齡和39日齡安慶六白豬和長(zhǎng)白豬各腸段黏膜IGF-1R基因表達(dá)情況
圖10 33日齡和39日齡安慶六白豬和長(zhǎng)白豬各腸段黏膜EGFR基因表達(dá)情況
其中,圖7-10中Δ表示不同品種同一日齡仔豬同一腸段差異顯著(P<0.05),ΔΔ表示不同品種同一日齡仔豬同一腸段差異極顯著(P<0.01);*表示同一品種不同日齡仔豬同一腸段差異顯著(P<0.05),**表示同一品種不同日齡仔豬同一腸段差異極顯著(P<0.01);不同小寫字母表示單一品種單一日齡仔豬各腸段間差異顯著(P<0.05),不同大寫字母表示單一
品種單一日齡仔豬各腸段間差異極顯著(P<0.01)。A:安慶六白豬,L:長(zhǎng)白豬。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體闡述。
實(shí)施例1:
一、試驗(yàn)方法
1.1試驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集
從安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)基地選擇健康狀態(tài)良好的長(zhǎng)白豬和安慶六白豬28日齡斷奶仔豬各20頭,分別于33日齡、39日齡各取10頭屠宰。前腔靜脈采血,制備血清,置-20℃冰箱保存,用于血清生化指標(biāo)檢測(cè)。取小腸十二指腸、空腸、回腸各腸段8cm,迅速放入備有4%多聚甲醛的固定液中,待做組織切片;另從小腸各段截取8cm,用1%PBS溶液將腸段徹底沖洗干凈,刮取腸黏膜無(wú)菌的凍存管中,并迅速放入液氮中保存,樣品放入-80℃條件下保存至使用;另從小腸各段截取8cm,用1%PBS溶液將腸段徹底沖洗干凈,并迅速放入液氮中保存,樣品放入-80℃條件下保存至使用,待做熒光定量檢測(cè)。
試驗(yàn)所需儀器和試劑如果沒(méi)有特別說(shuō)明,均屬于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過(guò)市場(chǎng)可以購(gòu)買獲得的。
1.2血清指標(biāo)測(cè)定
從仔豬前腔靜脈采血,4度冰箱靜置一夜后,3000r/min離心15min分離制備血清。采用武漢新啟迪公司的相應(yīng)ELISA試劑盒,采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法測(cè)定血清GH、GA、Cor、CD3、CD4、T4、T3。
1.3腸黏膜二糖酶、ATP酶活性含量測(cè)定
取0.2g各腸段黏膜放于1mL 1%的PBS緩沖液中研磨,制備勻漿液。采用南京建成公司的相應(yīng)試劑盒測(cè)定乳糖酶、麥芽糖酶、蔗糖酶、ATP酶活性,方法和操作按說(shuō)明書進(jìn)行,檢測(cè)每毫克蛋白質(zhì)中的二糖酶及ATP酶活力。
1.4切片制作及觀察
1.4.1切片制作
小腸各段固定16小時(shí)到24小時(shí)后,取出組織,經(jīng)水洗、透明、浸蠟、包埋等處理后,制備連續(xù)橫斷切片,厚度為5μm,每隔10張切片取1張切片。
1.4.2HE染色
取5張切片,切片脫蠟、蘇木精-伊紅、分色、脫水、透明、封片。每張切片觀察5個(gè)典型視野,用目鏡測(cè)量測(cè)微尺測(cè)量5根最長(zhǎng)的絨毛長(zhǎng)度(以腸腺絨毛連接處到絨毛頂端為準(zhǔn),最深的隱窩深度(以腸腺絨毛連接處到腸腺基部為準(zhǔn))。每項(xiàng)指標(biāo)均測(cè)定25組數(shù)據(jù)。
1.5實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR測(cè)定各個(gè)基因的表達(dá)水平
1.5.1十二指腸、空腸、回腸中總RNA提取
按Total RNA Kit II(50)(Omega)說(shuō)明書提取總RNA,步驟如下:
(1)1.5mL無(wú)RNA酶離心管中加入1mL RNA-SOW Reagent裂解液,取約100mg的十二指腸組織(-80℃冰箱保存)于研缽中,邊加液氮邊研磨至粉末狀,迅速轉(zhuǎn)入含裂解液的1.5mL無(wú)RNA酶離心管中,充分震蕩搖勻于室溫下靜置2~3min。
(2)靜置后向里加入0.2mL氯仿,搖勻,劇烈振蕩15-20s,隨后放在冰上孵化10min。
(3)4℃,12000rmp離心15min后,混合物分離成3層,中間層和上層為水相RNA保存在上層水相中,下層為苯酚-氯仿相。
(4)將80%的水相轉(zhuǎn)入新的EP管中,并向里加入三分之一體積的無(wú)水乙醇,最大速度漩渦震蕩15s,接下來(lái)的步驟的離心操作均在室溫條件下進(jìn)行。
(5)將離心柱置于2mL收集管中,將步驟5中的液體轉(zhuǎn)入離心柱中,10000rmp離心30~60s,棄流出液。
(6)將離心柱放入新的2mL收集管中,并加入300μl RNA Wash Buffer I,10000rmp離心30~60s,棄流出液。
(7)向離心柱中加入400μL RNA Wash Buffer II,10000rmp離心30~60s,棄流出液。
(8)將離心柱放入新的2mL收集管中,向里加入500μLRNA Wash Buffer II,10000rmp離心30~60s,棄流出液。
(9)重復(fù)步驟8,13000rmp離心2min,丟掉流出液,超凈臺(tái)內(nèi)干燥離心柱5min。
(10)洗脫RNA,將離心柱轉(zhuǎn)入1.5mL無(wú)RNA酶離心管中,向離心柱中加入300μLDEPC水,室溫孵化2min,13000rmp離心1min,棄離心柱,保留流出液,即RNA,置于-80℃冰箱中保存??漳c、回腸中的總RNA提取同上述方法。
1.5.2RNA提取質(zhì)量的檢測(cè)
(1)使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的OD260值、OD280值及濃度。OD260/OD280值在1.8-2.0之間的RNA為合格品。
(2)甲醛變性膠檢測(cè)RNA質(zhì)量。取RNA樣5μL與1μL的5×Loading buffer混勻,置于70℃水浴鍋內(nèi)加熱10min,后置于冰上驟冷以消除RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)。用1.2%甲醛變性凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量,電壓為100v。凝膠成像系統(tǒng)下觀察條帶,通??梢钥吹?條帶,一般為28s、18s、5s,其中28s、18s較亮,5s較暗,且28s的亮度是18s的兩倍的RNA質(zhì)量比較好(見圖1),留下符合要求的RNA樣。
(3)選擇符合上述兩個(gè)條件的RNA樣稀釋至1μg/μL分裝于無(wú)RNA酶離心管內(nèi),于-80℃條件下保存以供反轉(zhuǎn)錄。
1.5.3組織提取的總RNA質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果
提取安慶六白豬和長(zhǎng)白豬十二指腸、空腸及回腸中的RNA并用甲醛變性膠進(jìn)行電泳檢測(cè),電泳圖中的18S、5S及28S三條條帶清晰可見。因此,總RNA的質(zhì)量符合實(shí)驗(yàn)要求,可進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA(圖1)。
1.5.4引物設(shè)計(jì)與合成
根據(jù)GenBank中豬GLS、EGFR、IGF-1、IGF-1R的序列,設(shè)計(jì)引物序列,引物由上海生工生物公司合成。引物序列和PCR參數(shù)如表1所示。
表1.用于Real-time quantitative PCR的引物序列及PCR參數(shù)
1.5.5反轉(zhuǎn)錄合成cDNA
使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(TAKARA),反應(yīng)體系及反應(yīng)條件如下,見表2、3。
表2.反轉(zhuǎn)錄第一步基因組DNA除去反應(yīng)
反應(yīng)條件:使用普通PCR儀設(shè)置程序42℃反應(yīng)2min,4℃保存,得反應(yīng)液I。
表3.反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
反應(yīng)條件:使用普通PCR儀設(shè)置程序37℃反應(yīng)15min,85℃反應(yīng)5s,4℃保存。得反轉(zhuǎn)錄樣品cDNA,檢測(cè)后置于-20℃條件下備用。
1.5.6cDNA純度檢測(cè)
反應(yīng)體系及反應(yīng)條件如下,反應(yīng)完成后取6μL PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上以120V電壓電泳15min,凝膠成像系統(tǒng)下觀察條帶以鑒定cDNA純度(β-Actin為例)。
表4.常規(guī)PCR反應(yīng)
1.5.7cDNA純度鑒定結(jié)果
將提取的總RNA按照相關(guān)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明合成cDNA。按照常規(guī)PCR反應(yīng)體系添加反應(yīng)物,引物為β-Actin基因,質(zhì)粒為cDNA。采用瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)檢測(cè)擴(kuò)增的產(chǎn)物,在電泳圖上可看到樣品得到很好的β-Actin電泳條帶。從電泳圖片結(jié)果看,PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物條帶清晰,且無(wú)雜帶,說(shuō)明該引物可特異性地?cái)U(kuò)增出目的產(chǎn)物。
1.5.8q-RT-PCR
(1)標(biāo)準(zhǔn)品制備及條件優(yōu)化
每個(gè)待測(cè)RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物取等量混合,將cDNA混合樣按梯度稀釋,用RT-PCR的反應(yīng)體系,對(duì)每個(gè)目的基因作標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)優(yōu)化整個(gè)反應(yīng)條件。用標(biāo)準(zhǔn)曲線驗(yàn)證目的基因和內(nèi)參基因的引物有效性、最佳退火溫度、使用濃度及RT-PCR反應(yīng)中的試劑,以評(píng)估每個(gè)目的基因和內(nèi)參基因RT-PCR反應(yīng)的最佳條件。RT-PCR反應(yīng)體系及條件如下(表5),每個(gè)樣品重復(fù)3次,并設(shè)陰性對(duì)照。
(2)q-RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立和擴(kuò)增曲線
采用q-RT-PCR方法作目的基因GLS、EGFR、IGF-1、IGF-1R的標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到各個(gè)目的基因及β-Actin基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線,對(duì)結(jié)果相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)及擴(kuò)增效率均等于或接近于1.000時(shí),表明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)誤差較小,可信度較高,實(shí)驗(yàn)所得的Ct值可準(zhǔn)確地測(cè)定起始cDNA的拷貝數(shù)。目的基因和看家基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率小于0.1,表明兩個(gè)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率基本一致,在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中可以使用分析Comparative Delta-delta Ct法進(jìn)行相對(duì)定量分析。根據(jù)熔解曲線確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性需要,當(dāng)熔解曲線的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物只有一個(gè)峰值,且無(wú)非特異性峰存在,說(shuō)明引物的特異性良好,可以在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中使用。根據(jù)上述要求進(jìn)行試驗(yàn),從而得到所有樣品擴(kuò)增曲線,見圖3-6。
(3)相關(guān)候選基因的q-RT-PCR反應(yīng)
采用RT-PCR法檢測(cè)豬GLS、EGFR、IGF-1、IGF-1R基因及內(nèi)參基因β-Actin在斷奶仔豬小腸各段的表達(dá)量。反應(yīng)體系及反應(yīng)條件如下(表5),反應(yīng)體系為20μL?;虮磉_(dá)量分析:目的基因mRNA表達(dá)豐度采用2-ΔΔCT法對(duì)有效數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)算出每個(gè)樣本目的基因的相對(duì)表達(dá)水平,通過(guò)內(nèi)參基因β-Actin校正。
表5.q-RT-PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件
1.6數(shù)據(jù)分析
試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,采用SPSS20.0軟件對(duì)結(jié)果中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,品種間同一日齡的均值差異、品種內(nèi)不同日齡的均值差異、品種內(nèi)種不同日齡同一腸段的均值差異均采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析,單一品種單一日齡小腸各段的均值差異采用One-Way ANOVA統(tǒng)計(jì)分析,顯著性差異水平為P<0.05,極顯著性差異水平為P<0.01。采用SPSS20.0軟件Bivariate correlation程序進(jìn)行數(shù)據(jù)相關(guān)性分析。
(二)數(shù)據(jù)分析
2.1小腸黏膜GLS、IGF-1、IGF-1R、EGFRmRNA的相對(duì)表達(dá)水平
2.1.1GLS mRNA的相對(duì)表達(dá)水平
33日齡時(shí),安慶六白豬空腸GLS mRNA表達(dá)水平顯著高于長(zhǎng)白豬(P<0.05),十二指腸和回腸GLS mRNA表達(dá)水平與長(zhǎng)白豬差異不顯著。39日齡時(shí),安慶六白豬小腸各段GLS mRNA表達(dá)水平與長(zhǎng)白豬差異不顯著。同一豬種39日齡小腸各段GLS mRNA表達(dá)水平與33日齡比較發(fā)現(xiàn),安慶六白豬十二指腸和回腸GLS mRNA表達(dá)水平均顯著提高了(P<0.05);長(zhǎng)白豬十二指腸和回腸GLS mRNA表達(dá)水平均極顯著提高了(P<0.01),空腸GLS mRNA表達(dá)水平顯著提高(P<0.05)。
33日齡和39日齡時(shí),長(zhǎng)白豬和安慶六白豬小腸各段GLS mRNA的表達(dá)水平依次均是空腸最高,十二指腸次之,回腸最低。33日齡時(shí),安慶六白豬空腸GLS mRNA的表達(dá)水平極顯著高于十二指腸和回腸(P<0.01),而十二指腸和回腸之間無(wú)顯著差異;長(zhǎng)白豬空腸GLS mRNA的表達(dá)水平顯著高于回腸(P<0.05),空腸及回腸與十二指腸無(wú)顯著差異。39日齡時(shí),安慶六白豬空腸GLS mRNA的表達(dá)水平極顯著高于十二指腸(P<0.01),顯著高于回腸(P<0.05),而十二指腸和回腸之間無(wú)顯著差異;長(zhǎng)白豬小腸各段GLS mRNA的表達(dá)水平無(wú)顯著差異(見圖4)。
2.1.2IGF-1mRNA的相對(duì)表達(dá)水平
33日齡時(shí),長(zhǎng)白豬十二指腸、空腸IGF-1mRNA表達(dá)水平極顯著、顯著高于安慶六白豬(P<0.01,P<0.05),回腸IGF-1mRNA表達(dá)水平與安慶六白豬差異不顯著。39日齡時(shí),安慶六白豬小腸各段IGF-1mRNA表達(dá)水平與長(zhǎng)白豬差異不顯著。同一豬種39日齡小腸各段IGF-1mRNA表達(dá)水平與33日齡比較發(fā)現(xiàn),安慶六白豬十二指腸IGF-1mRNA表達(dá)水平極顯著提高了(P<0.05),空腸與回腸IGF-1mRNA表達(dá)水平趨勢(shì)是升高了;長(zhǎng)白豬小腸各段IGF-1mRNA表達(dá)水平變化不顯著。
33日齡和39日齡時(shí),兩豬種小腸各段IGF-1 mRNA的表達(dá)水平依次均是空腸最高,十二指腸次之,回腸最低。33日齡時(shí),安慶六白豬空腸IGF-1 mRNA的表達(dá)水平極顯著高于十二指腸和回腸(P<0.01),十二指腸IGF-1 mRNA的表達(dá)水平顯著高于回腸(P<0.05);長(zhǎng)白豬十二指腸及空腸IGF-1mRNA的表達(dá)水平均極顯著高于(P<0.01),空腸與十二指腸無(wú)顯著差異。39日齡時(shí),安慶六白豬和長(zhǎng)白豬小腸各段IGF-1 mRNA的表達(dá)水平均無(wú)顯著差異(見圖5)。
2.1.3IGF-1R mRNA的相對(duì)表達(dá)水平
33日齡和39日齡時(shí),長(zhǎng)白豬小腸各段IGF-1R mRNA表達(dá)水平均表現(xiàn)出高于安慶六白豬的趨勢(shì),品種之間無(wú)顯著差異。同一豬種39日齡斷奶仔豬小腸各段IGF-1R mRNA表達(dá)水平與33日齡斷奶仔豬比較發(fā)現(xiàn),兩豬種小腸各段IGF-1R mRNA表達(dá)水平均有所提高,變化不明顯。
33日齡和39日齡時(shí),兩豬種小腸各段IGF-1R mRNA的表達(dá)水平依次均是空腸最高,十二指腸次之,回腸最低。33日齡時(shí),安慶六白豬空腸IGF-1R mRNA的表達(dá)水平極顯著高于回腸(P<0.01),十二指腸與空腸及回腸無(wú)顯著差異;39日齡時(shí),安慶六白豬小腸各段IGF-1R mRNA的表達(dá)水平差異不顯著。33日齡和39日齡時(shí),長(zhǎng)白豬空腸IGF-1R mRNA的表達(dá)水平顯著高于回腸(P<0.05),十二指腸與空腸及回腸無(wú)顯著差異(見圖6)。
2.1.4EGFR mRNA的相對(duì)表達(dá)水平
33日齡時(shí),安慶六白豬十二指腸和空腸EGFR mRNA表達(dá)水平均顯著高于長(zhǎng)白豬(P<0.05),回腸EGFR mRNA表達(dá)水平與長(zhǎng)白豬差異不顯著。39日齡時(shí),安慶六白豬小腸各段EGFR mRNA表達(dá)水平與長(zhǎng)白豬差異不顯著。同一豬種39日齡小腸各段EGFR mRNA表達(dá)水平與33日比較發(fā)現(xiàn),安慶六白豬小腸各段EGFR mRNA表達(dá)水平變化不顯著;長(zhǎng)白豬十二指腸和空腸EGFR mRNA表達(dá)水平有所提高,回腸EGFR mRNA表達(dá)水平有所下降,變化均不顯著。
33日齡和39日齡時(shí),長(zhǎng)白豬和安慶六白豬小腸各段EGFR mRNA的表達(dá)水平依次均是空腸最高,十二指腸次之,回腸最低。33日齡時(shí),安慶六白豬回腸EGFR mRNA的表達(dá)水平極顯著低于空腸(P<0.01),顯著低于于十二指腸(P<0.05),十二指腸與空腸差異不顯著,39日齡時(shí),安慶六白豬十二指腸及空腸EGFR mRNA的表達(dá)水平顯著高于回腸(P<0.05),而十二指腸和空腸之間無(wú)顯著差異;33日齡和39日齡時(shí),長(zhǎng)白豬空腸EGFR mRNA的表達(dá)水平顯著高于回腸(P<0.05),空腸及十二指腸與回腸無(wú)顯著差異(見圖7)。
2.2相關(guān)性分析結(jié)果
2.2.1小腸GLS及EGFR基因表達(dá)量與血清GA及Cor含量的相關(guān)性分析
GLS基因在33日齡和39日齡安慶六白豬空腸段表達(dá)量與血清GA含量顯著正相關(guān)(P<0.05),在39日齡長(zhǎng)白豬十二指腸段表達(dá)量與血清GA含量顯著正相關(guān)(P<0.05)。EGFR基因在33日齡安慶六白豬十二指腸段表達(dá)量與血清GA含量顯著正相關(guān)(P<0.05)(見表6)。
表6.GLS和EGFR mRNA表達(dá)量與血清GA含量的相關(guān)性
注:**表示極顯著相關(guān),*表示顯著相關(guān)(表12、13、17、18同)
GLS基因在33日齡安慶六白豬十二指腸段及長(zhǎng)白豬空腸段表達(dá)量與血清Cor含量均顯著正相關(guān)(P<0.05)。EGFR基因在33日齡兩豬種空腸段及39日齡安慶六白豬十二指段表達(dá)量與血清Cor含量均顯著正相關(guān)(P<0.05)(見表7)。
表7.GLS和EGFR mRNA表達(dá)量與血清Cor含量的相關(guān)性
2.2.2小腸IGF-1及IGF-1R基因表達(dá)量與小腸絨毛高度的相關(guān)性分析
33日齡安慶六白豬空腸段和長(zhǎng)白豬十二指腸段IGF-1基因表達(dá)量與腸絨毛高度顯著正相關(guān)(P<0.05),39日齡安慶六白豬十二指腸IGF-1、IGF-1R基因表達(dá)量與腸絨毛高度顯著正相關(guān)(P<0.05)。
表8.IGF-1和IGF-1R基因表達(dá)量與小腸絨毛高度的相關(guān)性
2.3結(jié)論
小腸生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因GLS及EGFR基因在小腸各段的表達(dá)與仔豬抗應(yīng)激生化指標(biāo)GA、Cor達(dá)高度正相關(guān);IGF-1及IGF-1R基因在小腸各段的表達(dá)與小腸絨毛高度顯著正相關(guān)。在不同斷奶仔豬個(gè)體間,GLS及EGFR基因表達(dá)水平高低可以用來(lái)比較血清GA、Cor含量的多少,IGF-1及IGF-1R基因表達(dá)水平可以用來(lái)比較小腸絨毛高度差異,從而推測(cè)出斷奶仔豬小腸生長(zhǎng)發(fā)育以及抗斷奶應(yīng)激生理反應(yīng)的能力。
可以知道,上述實(shí)施例僅為了說(shuō)明發(fā)明原理而采用的示例性實(shí)施方式,然而本發(fā)明不僅限于此,本領(lǐng)域技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明實(shí)質(zhì)情況下,可以做出各種改進(jìn)和變更,這些改進(jìn)和變更也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
<110>安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
<120>一種比較斷奶仔豬抗應(yīng)激生理反應(yīng)能力的標(biāo)記引物和方法
<160>10
<210>1
<211>19
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>上游引物序列GLS -F
<400>1
AGGGCAGTTT GCTTTCCAT 19
<210>2
<211>20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>下游引物序列GLS-R
<400>2
CTTGTCCAGA GGAGGAGACC 20
<210>3
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>上游引物序列EGFR -F
<400>3
GGCCTCCATG CTTTTGAGAA 20
<210>4
<211>19
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>下游引物序列EGFR -R
<400>4
GACGCTATGT CCAGGCCAA 19
<210>5
<211>19
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>上游引物序列IGF-1 -F
<400>5
CCTCAAGCCT GCCAAGTCG 19
<210>6
<211>19
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>下游引物序列IGF-1 -R
<400>6
GGTAACTCGT GCAGAGCAAA GG 22
<210>7
<211>22
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>上游引物序列IGF-1R -F
<400>7
CCACCCAACA CCTACCGCTT CG 22
<210>8
<211>22
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>下游引物序列IGF-1R -R
<400>8
GCACTCGCCA TCATGGATCA CA 22
<210>9
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>下游引物序列β-antin -F
<400>9
CTCGATCATG AAGTGCGACG 20
<210>10
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>下游引物序列β-antin -R
<400>10
GTGATCTCCT TCTGCATCCT GTC 23