本發(fā)明屬于核酸檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種基于LAMP技術(shù)的檢測(cè)維氏粒線蟲的方法。

背景技術(shù)：

線形動(dòng)物門是動(dòng)物界中最大的門之一，為假體腔動(dòng)物，有超過(guò)28,000個(gè)已被記錄的物種，尚有大量種尚未命名。絕大多數(shù)體小呈圓柱形。它們?cè)诘⒑Ｋ?、陸地上隨處可見，不論是個(gè)體數(shù)或物種數(shù)都往往超越其他動(dòng)物。此外，有許多種的線蟲是寄生性的(超過(guò)16,000種)，包括許多植物及人類在內(nèi)的動(dòng)物的病原體。

粒屬線蟲是一類高度專化的植物種子和地上部寄生線蟲，可危害多種禾本科植物，導(dǎo)致產(chǎn)量和質(zhì)量嚴(yán)重下降。我國(guó)口岸曾多次在進(jìn)境牧草種子中截獲粒屬線蟲，該類線蟲在植物穗部形成蟲癭，在收獲植物種子時(shí)蟲癭脫落混入植物種子，隨植物種子的調(diào)運(yùn)作遠(yuǎn)距離傳播。

粒屬線蟲中，維氏粒線蟲(Anguina wevelli)是非常重要的種類，是牧草及草坪草的重要有害生物。2013年，上海出入境檢驗(yàn)檢疫局全國(guó)首次在進(jìn)境的畫眉草種子中截獲維氏粒線蟲。目前，在中國(guó)尚未有維氏粒線蟲的分布報(bào)道，一旦該線蟲隨入境的草籽傳入我國(guó)，將很難根治。

線蟲進(jìn)行分類鑒定多數(shù)是依據(jù)成熟雌蟲的形態(tài)學(xué)特征，幼蟲和雄蟲形態(tài)一般不作為定種的主要依據(jù)。據(jù)維氏粒線蟲的生活史可知，要得到該線蟲的雌、雄蟲，關(guān)鍵是找到蟲癭。口岸檢驗(yàn)檢疫部門在進(jìn)境牧草種子檢疫中遇到的難題是只分離到粒屬線蟲的幼蟲，卻沒(méi)有找到蟲癭，難以根據(jù)幼蟲特征進(jìn)行種類鑒定。還有，粒屬線蟲的形態(tài)學(xué)鑒定要求鑒定人員具有良好的分類學(xué)基礎(chǔ)。

因此，開展維氏粒線蟲的分子生物學(xué)檢測(cè)方法研究，建立能夠準(zhǔn)確、快速鑒定幼蟲的分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)于保護(hù)中國(guó)的生物物種安全是十分迫切和必要的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種基于LAMP技術(shù)的檢測(cè)維氏粒線蟲的方法。

在本發(fā)明的第一方面，提供一種檢測(cè)維氏粒線蟲的方法，所述方法包括：

以待測(cè)樣品的DNA為模板，以特異性擴(kuò)增引物進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增；若發(fā)生特異性擴(kuò)增，則表明待測(cè)樣品中包含維氏粒線蟲；

所述的特異性擴(kuò)增引物包括：正向外引物SEQ ID NO:1，反向外引物SEQ ID NO:2，正向內(nèi)引物SEQ ID NO:3，反向內(nèi)引物SEQ ID NO:4。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種將維氏粒線蟲與其它線蟲進(jìn)行區(qū)分的方法，所述方法包括：

以待測(cè)線蟲的DNA為模板，以特異性擴(kuò)增引物進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增；若發(fā)生特異性擴(kuò)增，則表明待測(cè)線蟲為維氏粒線蟲；若不發(fā)生特異性擴(kuò)增，則表明待測(cè)線蟲為非維氏粒線蟲；

所述的特異性擴(kuò)增引物包括：正向外引物SEQ ID NO:1，反向外引物SEQ ID NO:2，正向內(nèi)引物SEQ ID NO:3，反向內(nèi)引物SEQ ID NO:4。

在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的體系中包括所述的特異性擴(kuò)增引物、Tris-HCl、K⁺、Mg²⁺、(NH₄)₂SO₄、Tween20、甜菜堿、dNTP、DNA聚合酶；較佳地，所述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的體系中還包括鈣黃綠素；較佳地，Mg²⁺濃度8±1mM、甜菜堿濃度0.8±0.2M、dNTP濃度1.4±0.2mM、Tris-HCl濃度20±3mM、K⁺濃度10±2mM、(NH₄)₂SO₄濃度10±2mM、Tween20濃度0.1±0.02％。

在另一優(yōu)選例中，所述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增在63±1℃恒溫反應(yīng)。

在另一優(yōu)選例中，所述的待測(cè)樣品包括(但不限于)：植物、動(dòng)物(包含家畜)、飼料、土壤、淡水、海水、地下水。

在另一優(yōu)選例中，所述的待測(cè)樣品或待測(cè)線蟲包括：維氏粒線蟲，小麥粒線蟲，剪股穎粒線蟲，?？凭€蟲，鱗球莖莖線蟲，莖屬線蟲，朱頂紅短體線蟲，穿刺短體線蟲，北方根結(jié)線蟲，西班牙根結(jié)線蟲，無(wú)花果胞囊線蟲，仙人掌胞囊線蟲，松材線蟲，滑刃屬線蟲，柑橘半穿刺線蟲，強(qiáng)壯盤旋線蟲，厚皮擬毛刺線蟲，腎形擬毛刺線蟲，具毒毛刺線蟲，貝克劍線蟲，Xiphinema incertum。

在另一優(yōu)選例中，所述方法對(duì)于維氏粒線蟲的最低檢測(cè)限為1/80000條幼蟲DNA。

在本發(fā)明的另一方面，提供用于檢測(cè)維氏粒線蟲的引物，所述引物是LAMP擴(kuò)增引物，包括：正向外引物SEQ ID NO:1，反向外引物SEQ ID NO:2，正向內(nèi)引物SEQ ID NO:3，反向內(nèi)引物SEQ ID NO:4。

在本發(fā)明的另一方面，提供所述的引物的用途，用于從待測(cè)樣品中檢測(cè)維氏粒線蟲；或用于將維氏粒線蟲與其它線蟲進(jìn)行區(qū)分。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種檢測(cè)維氏粒線蟲的試劑盒，其中包括所述的引物。

在一個(gè)優(yōu)選例中，所述試劑盒中還包括(但不限于)：含有維氏粒線蟲的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品；Tris-HCl；DNA提取試劑；pH緩沖試劑；鉀離子溶液；鎂離子溶液；銨離子溶液；Tween20；甜菜堿；dNTP；DNA聚合酶；熒光染料；和/或說(shuō)明檢測(cè)維氏粒線蟲的方法的使用說(shuō)明書。

本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。

附圖說(shuō)明

圖1、第一組LAMP特異性檢測(cè)(LA-320C柱狀圖)；其中，樣本DNA模板順序從左至右依次為：3維氏粒線蟲，4維氏粒線蟲，5維氏粒線蟲，6小麥粒線蟲，7小麥粒線蟲，8剪股穎粒線蟲，9剪股穎粒線蟲，10?？凭€蟲，11鱗球莖莖線蟲，12鱗球莖莖線蟲，13鱗球莖莖線蟲，14莖屬線蟲，15莖屬線蟲，16莖屬線蟲，17莖屬線蟲，及ddH₂O。

圖2、第一組LAMP特異性檢測(cè)(LA-320C曲線圖)；其中，A、C圖CH1～CH8樣本DNA模板順序依次為：3維氏粒線蟲，4維氏粒線蟲，5維氏粒線蟲，6小麥粒線蟲，7小麥粒線蟲，8剪股穎粒線蟲，9剪股穎粒線蟲，10粒科線蟲；B、D圖CH1～CH8樣本DNA模板順序依次為：11鱗球莖莖線蟲，12鱗球莖莖線蟲，13鱗球莖莖線蟲，14莖屬線蟲，15莖屬線蟲，16莖屬線蟲，17莖屬線蟲，及ddH₂O；

圖A、B：樣本反應(yīng)速率曲線；

圖C、D：樣本反應(yīng)擴(kuò)增曲線。

圖3、第一組LAMP特異性檢測(cè)(顯色法)；其中，1～16反應(yīng)管的DNA模板順序依次為：3維氏粒線蟲，4維氏粒線蟲，5維氏粒線蟲，6小麥粒線蟲，7小麥粒線蟲，8剪股穎粒線蟲，9剪股穎粒線蟲，10粒科線蟲，11鱗球莖莖線蟲，12鱗球莖莖線蟲，13鱗球莖莖線蟲，14莖屬線蟲，15莖屬線蟲，16莖屬線蟲，17莖屬線蟲，及ddH₂O。

圖4、第二組LAMP特異性檢測(cè)(LA-320C柱狀圖)；其中，樣本DNA模板順序從左至右依次為：1維氏粒線蟲，2維氏粒線蟲，5維氏粒線蟲，ddH₂O，9剪股穎粒線蟲，18朱頂紅短體線蟲，19穿刺短體線蟲，20傷殘短體線蟲，21北方根結(jié)線蟲，22西班牙根結(jié)線蟲，23無(wú)花果胞囊線蟲，24仙人掌胞囊線蟲，25松材線蟲，26滑刃屬線蟲，27柑橘半穿刺線蟲，28強(qiáng)壯盤旋線蟲，29厚皮擬毛刺線蟲，30腎形擬毛刺線蟲，31具毒毛刺線蟲，32貝克劍線蟲，33Xiphinema incertum。

圖5、第二組LAMP特異性檢測(cè)(LA-320C曲線圖)；其中，A、D圖CH1～CH8樣本DNA模板順序依次為：1維氏粒線蟲，2維氏粒線蟲，5維氏粒線蟲，ddH₂O，9剪股穎粒線蟲，18朱頂紅短體線蟲，19穿刺短體線蟲，20傷殘短體線蟲；B、E圖CH1～CH8樣本DNA模板順序依次為：21北方根結(jié)線蟲，22西班牙根結(jié)線蟲，23無(wú)花果胞囊線蟲，24仙人掌胞囊線蟲，25松材線蟲，26滑刃屬線蟲，27柑橘半穿刺線蟲，28強(qiáng)壯盤旋線蟲；C、F圖CH1～CH5樣本DNA模板順序依次為：29厚皮擬毛刺線蟲，30腎形擬毛刺線蟲，31具毒毛刺線蟲，32貝克劍線蟲，33Xiphinema incertum。

圖A、B、C：樣本反應(yīng)速率曲線；

圖D、E、F：樣本反應(yīng)擴(kuò)增曲線。

圖6、第二組LAMP特異性檢測(cè)(顯色法)；其中，1～21反應(yīng)管的DNA模板順序依次為：1維氏粒線蟲，2維氏粒線蟲，5維氏粒線蟲，ddH₂O，9剪股穎粒線蟲，18朱頂紅短體線蟲，19穿刺短體線蟲，20傷殘短體線蟲，21北方根結(jié)線蟲，22西班牙根結(jié)線蟲，23無(wú)花果胞囊線蟲，24仙人掌胞囊線蟲，25松材線蟲，26滑刃屬線蟲，27柑橘半穿刺線蟲，28強(qiáng)壯盤旋線蟲，29厚皮擬毛刺線蟲，30腎形擬毛刺線蟲，31具毒毛刺線蟲，32貝克劍線蟲，33Xiphinema incertum。

圖7、LAMP靈敏度檢測(cè)(LA-320C柱形圖)；其中，1～7號(hào)樣本為3號(hào)DNA梯度稀釋的模板，依次為：10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，8號(hào)的模板為ddH₂O。

圖8、LAMP靈敏度檢測(cè)(LA-320C曲線圖)；其中，CH1～CH7樣本為3號(hào)DNA梯度稀釋的模板，依次為：10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，CH 8的模板為ddH₂O。

左圖：樣本反應(yīng)速率曲線；

右圖：樣本反應(yīng)擴(kuò)增曲線。

圖9、目視濁度法呈現(xiàn)LAMP靈敏度檢測(cè)結(jié)果；其中，左起第1～7反應(yīng)管樣本為3號(hào)DNA梯度稀釋的模板，依次為：10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，第8反應(yīng)管的模板為ddH₂O。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究和試驗(yàn)，首次揭示一種維氏粒線蟲的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)檢測(cè)方法。經(jīng)過(guò)比較篩選，本發(fā)明人揭示了對(duì)于維氏粒線蟲特異性良好的LAMP擴(kuò)增引物，所述引物針對(duì)含有維氏粒線蟲的DNA可發(fā)生特異性擴(kuò)增(獲得陽(yáng)性結(jié)果)，而對(duì)沒(méi)有維氏粒線蟲的非維氏粒線蟲或非線蟲的DNA不發(fā)生特異性擴(kuò)增(獲得陰性結(jié)果)。本發(fā)明的方法可良好地應(yīng)用于鑒定維氏粒線蟲、將之與其非常接近的其它種類的線蟲相區(qū)分，并且具有良好的再現(xiàn)性、靈敏度、檢測(cè)穩(wěn)定性。

如前所述線蟲的種類非常多，超過(guò)28,000個(gè)已被記錄的物種，粒屬線蟲是一類高度?；闹参锓N子和地上部寄生線蟲，而維氏粒線蟲是其中之一。

鑒于線蟲種類繁多，從如此多的種類中找到對(duì)于維氏粒線蟲特異性的鑒定試劑非常困難。需要考慮的不僅僅是維氏粒線蟲這類物種本身的基因序列，而是需要考慮不要與其它與之具有親緣關(guān)系的諸多物種產(chǎn)生交叉反應(yīng)，這是非常困難的。對(duì)于這種區(qū)分，本領(lǐng)域中目前而言尚缺乏檢測(cè)手段。

為此，本發(fā)明人經(jīng)過(guò)了長(zhǎng)期的研究和篩選，深入比對(duì)維氏粒線蟲種內(nèi)的保守性和非維氏粒線蟲種間的差異性，以及比對(duì)粒線蟲的屬內(nèi)的保守性和非粒線蟲屬間的差異性，經(jīng)過(guò)針對(duì)各種樣本的反復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證，最終確定了適用于鑒定維氏粒線蟲的特異性引物和探針序列，即以下特異性擴(kuò)增引物：正向外引物SEQ ID NO:1，反向外引物SEQ ID NO:2，正向內(nèi)引物SEQ ID NO:3，反向內(nèi)引物SEQ ID NO:4；所述的引物應(yīng)用于LAMP反應(yīng)，速度很快，從而不需要環(huán)引物的參與即可良好地完成反應(yīng)。

為此，本發(fā)明人經(jīng)過(guò)深入的研究和大量的篩選，找到了合適的檢測(cè)靶標(biāo)，基于此開發(fā)了LAMP檢測(cè)維氏粒線蟲的方法。

如本文所用，所述的“待測(cè)樣品”可以是(但不限于)：植物、動(dòng)物(包含家畜)、飼料、土壤、淡水、海水、地下水等。

本發(fā)明人通過(guò)對(duì)引物的篩選，獲得一類可特異性鑒定維氏粒線蟲的引物，其對(duì)于維氏粒線蟲的DNA發(fā)生特異性擴(kuò)增，而對(duì)沒(méi)有維氏粒線蟲的DNA不發(fā)生特異性擴(kuò)增。

因此，本發(fā)明提供一種引物，所述的引物是LAMP擴(kuò)增引物，包括：正向外引物SEQ ID NO:1，反向外引物SEQ ID NO:2，正向內(nèi)引物SEQ ID NO:3，反向內(nèi)引物SEQ ID NO:4。

本發(fā)明的這些引物還可以用放射性同位素、生物素、酶、熒光素或其他化學(xué)發(fā)光物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。

利用本發(fā)明的引物，進(jìn)行LAMP反應(yīng)，并通過(guò)濁度儀檢測(cè)或顯色觀察，就可以準(zhǔn)確、快速地判斷待測(cè)樣品是否含有維氏粒線蟲，而且所需的樣品量很少。

LAMP是近年來(lái)發(fā)展的一種新穎和較成熟的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)。LAMP是針對(duì)靶基因的多個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)特異引物，利用鏈置換DNA聚合酶在等溫條件下，即可完成的核酸擴(kuò)增反應(yīng)。與PCR方法相比，LAMP不需要熱循環(huán)儀(PCR儀)，且由于LAMP反應(yīng)中產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物-白色焦磷酸鎂沉淀，擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)肉眼觀察或濁度計(jì)即可判定結(jié)果；因此LAMP適合于現(xiàn)場(chǎng)或條件較差的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行快速檢測(cè)。LAMP技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明建立的維氏粒線蟲的LAMP檢測(cè)方法，用于解決我國(guó)檢驗(yàn)檢疫一線實(shí)驗(yàn)室快速、準(zhǔn)確鑒定維氏粒線蟲的檢測(cè)需求。

獲取待測(cè)樣品的DNA的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的技術(shù)，例如可采取傳統(tǒng)的酚/氯仿/異戊醇法，或者可采用一些商購(gòu)的DNA提取試劑盒，這類試劑盒是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。

本發(fā)明還涉及一種用于檢測(cè)維氏粒線蟲的試劑盒，所述試劑盒中含有針對(duì)維氏粒線蟲的LAMP擴(kuò)增引物。

此外，所述的試劑盒還可含有其它檢測(cè)維氏粒線蟲的試劑，如(但不限于)：含有維氏粒線蟲的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品；DNA提取試劑；pH緩沖試劑(如Tris-HCl(PH8.8))；鉀離子溶液；鎂離子溶液；銨離子溶液；Tween20；甜菜堿；dNTP；Bst大片段DNA聚合酶；熒光染料(如SYBR Green I熒光染料)。

此外，所述的試劑盒中還可含有檢測(cè)維氏粒線蟲的使用說(shuō)明書和/或標(biāo)準(zhǔn)操作程序。

本發(fā)明所述的試劑盒可實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)、批量檢測(cè)維氏粒線蟲的目的。

本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于：

(1)首次揭示一種可特異性檢測(cè)維氏粒線蟲的引物，所述的引物特異性良好，對(duì)于維氏粒線蟲的核酸(如DNA)能夠?qū)崿F(xiàn)特異性擴(kuò)增，而對(duì)于維氏粒線蟲以外的其它物種不能特異性擴(kuò)增。并且，所述引物具有良好的再現(xiàn)性、結(jié)果穩(wěn)定可靠。

(2)本發(fā)明建立的維氏粒線蟲LAMP檢測(cè)方法快速、便捷。只需要60min即可完成LAMP反應(yīng)，而且對(duì)儀器設(shè)備要求低，不需要PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)等昂貴儀器，使用水浴鍋即可完成檢測(cè)。

(3)本發(fā)明建立的維氏粒線蟲LAMP檢測(cè)方法靈敏度高。檢測(cè)極限達(dá)到1/80000條幼蟲DNA。

(4)本發(fā)明建立的維氏粒線蟲LAMP檢測(cè)方法特異性強(qiáng)。本發(fā)明的方法只能夠特異地?cái)U(kuò)增維氏粒線蟲，供試其它8種?？凭€蟲和16種非粒科線蟲均未發(fā)生非特異性擴(kuò)增，具有物種特異性。

(5)本發(fā)明建立的維氏粒線蟲LAMP檢測(cè)方法穩(wěn)定性良好。檢測(cè)靈敏度之內(nèi)的所有維氏粒線蟲樣本LAMP反應(yīng)均呈陽(yáng)性擴(kuò)增(前后多次試驗(yàn)共計(jì)18個(gè)反應(yīng))。

(6)本發(fā)明建立的維氏粒線蟲LAMP檢測(cè)方法步驟簡(jiǎn)單。所有試劑在反應(yīng)前添加，實(shí)現(xiàn)一步核酸擴(kuò)增。

(7)本發(fā)明建立的維氏粒線蟲LAMP檢測(cè)方法結(jié)果判定簡(jiǎn)便。其產(chǎn)物的檢測(cè)方法比較多，用肉眼觀察濁度或熒光顯色就能夠判斷擴(kuò)增與否，實(shí)現(xiàn)了結(jié)果可視化，還可采用實(shí)時(shí)濁度儀等方法判定。

本發(fā)明建立的維氏粒線蟲LAMP快速檢測(cè)方法具有物種特異性和穩(wěn)定性，且費(fèi)用成本低廉，操作簡(jiǎn)便，快速準(zhǔn)確，適用于各種實(shí)驗(yàn)條件的實(shí)驗(yàn)室(尤其是基層實(shí)驗(yàn)室)對(duì)維氏粒線蟲的檢測(cè)，對(duì)口岸快速檢測(cè)具有重要意義。

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

材料與方法

1.1線蟲

維氏粒線蟲DNA(南非)、剪股穎粒線蟲DNA由天津出入境檢驗(yàn)檢疫局提供，小麥粒線蟲DNA來(lái)自美國(guó)北卡羅來(lái)那州農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)服務(wù)處線蟲實(shí)驗(yàn)室。其它供試線蟲DNA均為上海出入境檢驗(yàn)檢疫局近年檢疫工作中收集的線蟲DNA。

線蟲及其來(lái)源見表1。

表1、供試線蟲DNA及其寄主植物材料和來(lái)源

備注：鑒于外來(lái)DNA材料有限及DNA模板濃度有限，特使用全基因組擴(kuò)增試劑盒對(duì)外來(lái)DNA進(jìn)行擴(kuò)增得到新的濃縮的DNA材料，表中加*號(hào)標(biāo)注。

1.2主要試劑與儀器

試劑：

Bst DNA polymerase large fragment購(gòu)自New England Biolabs公司。

Tris，KCl，(NH₄)₂SO₄，Tween20，MgSO₄，甜菜堿(Betaine)購(gòu)自Sigma公司。

熒光染料鈣黃綠素，購(gòu)自榮研生物科技(中國(guó))有限公司。

dNTPs和MgCl₂購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

本發(fā)明所設(shè)計(jì)的LAMP引物委托上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

其它常規(guī)試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

儀器：

LAMP實(shí)時(shí)濁度儀LA-320C。

旋渦混合器。

微量移液器。

冰箱。

離心機(jī)。

1.3 DNA提取

線蟲DNA提取使用DNeasyBlood&Tissue Kit(Qiagen)試劑盒，提取方法按照試劑盒使用說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4 LAMP引物設(shè)計(jì)

本發(fā)明人進(jìn)行了大量的研究、分析，包括線蟲屬內(nèi)比較(將維氏粒線蟲與粒屬的其它近似種進(jìn)行比較)、屬間比較(將維氏粒線蟲與粒屬線蟲以外其它線蟲進(jìn)行比較)，以及將維氏粒線蟲與大量其它物種進(jìn)行比較。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明人設(shè)計(jì)了適用于鑒定維氏粒線蟲的LAMP特異性檢測(cè)引物。所述的引物序列如表2所示。

表2

1.5 LAMP擴(kuò)增和檢測(cè)

25μL LAMP反應(yīng)體系中各組分終濃度為：

當(dāng)需要進(jìn)行顯色反應(yīng)時(shí)，還在反應(yīng)體系中加熒光試劑鈣黃綠素1μL。用滅菌雙蒸水補(bǔ)足體系。

LAMP反應(yīng)條件：

63℃恒溫反應(yīng)60min，80℃滅活5min結(jié)束反應(yīng)。

采用以下方法鑒別是否發(fā)生了LAMP反應(yīng)：

(A)直接通過(guò)LAMP實(shí)時(shí)濁度儀觀察；

(B)在反應(yīng)前向待測(cè)體系中加入1μL鈣黃綠素，反應(yīng)后觀察溶液顏色是否變?yōu)榫G色；

(C)直接目視觀察反應(yīng)管中是否有白色渾濁物產(chǎn)生。

1.6 LAMP特異性試驗(yàn)

將供試材料中的線蟲DNA分成2組，采用顯色法的反應(yīng)體系，分別進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。第一組模板選取隸屬于?？凭€蟲(包括形態(tài)近似種和系統(tǒng)發(fā)育近源的線蟲)的DNA，第二組模板主要選取非?？凭€蟲的DNA。

使用LAMP實(shí)時(shí)濁度儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)LAMP反應(yīng)，63℃運(yùn)行65min，驗(yàn)證LAMP反應(yīng)的特異性。

分別以實(shí)時(shí)濁度儀和顯色法觀察檢測(cè)結(jié)果。

1.7 LAMP靈敏度試驗(yàn)

供試維氏粒線蟲的DNA以10倍梯度進(jìn)行系列稀釋，DNA模板依次為：10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，共7個(gè)稀釋度，進(jìn)行靈敏度試驗(yàn)。

使用LAMP實(shí)時(shí)濁度儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)LAMP反應(yīng)，63℃運(yùn)行65min，以確定LAMP檢測(cè)靈敏度。

分別以實(shí)時(shí)濁度儀和目視濁度法進(jìn)行檢測(cè)。

實(shí)施例1、維氏粒線蟲的LAMP特異性試驗(yàn)

使用所設(shè)計(jì)的引物和檢測(cè)體系對(duì)供試線蟲DNA進(jìn)行LAMP檢測(cè)。設(shè)計(jì)兩組試驗(yàn)組進(jìn)行LAMP特異性試驗(yàn)。

第一組，供試線蟲包括：維氏粒線蟲，小麥粒線蟲，剪股穎粒線蟲，?？凭€蟲1種，鱗球莖莖線蟲，莖屬線蟲4種。LAMP特異性試驗(yàn)結(jié)果如圖1～3。

圖1為L(zhǎng)A-320C柱形圖呈現(xiàn)第一組LAMP特異性檢測(cè)的結(jié)果。由結(jié)果可見，16個(gè)樣本中，僅維氏粒線蟲樣本呈陽(yáng)性擴(kuò)增，其它?？凭€蟲均未發(fā)生擴(kuò)增。

圖2為L(zhǎng)A-320C曲線圖呈現(xiàn)第一組LAMP特異性檢測(cè)的結(jié)果?？梢姡?6個(gè)樣本中，僅維氏粒線蟲樣本呈陽(yáng)性擴(kuò)增，其它?？凭€蟲均未發(fā)生擴(kuò)增。

圖3為顯色法呈現(xiàn)第一組LAMP特異性檢測(cè)的結(jié)果?？梢姡?6個(gè)樣本中，僅維氏粒線蟲樣本呈陽(yáng)性擴(kuò)增(呈現(xiàn)綠色)，其它?？凭€蟲均未發(fā)生擴(kuò)增。

第二組，供試線蟲包括：維氏粒線蟲，剪股穎粒線蟲，以及朱頂紅短體線蟲等16種非?？凭€蟲(見表1中編號(hào)18～33)。LAMP特異性試驗(yàn)結(jié)果如圖4～6。

圖4為L(zhǎng)A-320C柱形圖呈現(xiàn)第二組LAMP特異性檢測(cè)的結(jié)果?？梢?，21個(gè)樣本中，僅維氏粒線蟲樣本呈陽(yáng)性擴(kuò)增，其它?？凭€蟲和非粒科線蟲均未發(fā)生擴(kuò)增。

圖5為L(zhǎng)A-320C曲線圖呈現(xiàn)第二組LAMP特異性檢測(cè)的結(jié)果?？梢?，21個(gè)樣本中，僅維氏粒線蟲樣本呈陽(yáng)性擴(kuò)增，其它粒科線蟲和非?？凭€蟲均未發(fā)生擴(kuò)增。

圖6為顯色法呈現(xiàn)第二組LAMP特異性檢測(cè)的結(jié)果?？梢?，21個(gè)樣本中，僅維氏粒線蟲樣本呈陽(yáng)性擴(kuò)增(呈現(xiàn)綠色)，其它?？凭€蟲和非粒科線蟲均未發(fā)生擴(kuò)增。

實(shí)施例2、維氏粒線蟲的LAMP靈敏度試驗(yàn)

將供試線蟲DNA(表1中3號(hào)維氏粒線蟲單條幼蟲DNA)以10倍梯度進(jìn)行系列稀釋，DNA模板依次為：10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，共7個(gè)稀釋度，進(jìn)行靈敏度試驗(yàn)。

從圖7～圖9可以看出，單條幼蟲DNA在10^-3稀釋度時(shí)，45min內(nèi)就可以準(zhǔn)確檢測(cè)到擴(kuò)增產(chǎn)物，10^-4稀釋度未發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)。

該樣本單條幼蟲DNA提取時(shí)得到的DNA體積為200μL，由此可算出本發(fā)明建立的維氏粒線蟲LAMP檢測(cè)方法最低檢測(cè)限為1/80000條幼蟲DNA。

在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

序列表

<110> 上海出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心

<120> 一種基于LAMP技術(shù)的檢測(cè)維氏粒線蟲的方法

<130> 167544

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 1

cctttccgtg gaatgttgaa 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 2

acgtaccgat tctcttcaa 19

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 3

ggtggggact tcaccagaaa atagccaaac agtccaagaa gg 42

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 4

tggacgaaaa aacggctctg gacgtaggca tacaactgct 40