本發(fā)明涉及一種特異引物對及其在檢測水稻耐鹽性中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水稻是我國重要的糧食作物之一，目前我國65％以上的人口以此作為主食。但隨著人口與經(jīng)濟的快速增長，糧食生產(chǎn)面臨著巨大的挑戰(zhàn)，其中水稻安全生產(chǎn)對于中國的可持續(xù)發(fā)展至關(guān)重要。水稻對鹽堿表現(xiàn)為中度敏感，其生長和結(jié)實會受到鹽堿的抑制。當前，土地鹽堿化已成為威脅水稻生產(chǎn)的重要因素之一，鹽堿可以使糧食作物嚴重減產(chǎn)，甚至高達40％以上。目前，全球大約20％的耕地存在鹽堿化現(xiàn)象，其中中國約為2000萬公頃，加之灌溉技術(shù)不當，造成的耕地次生鹽堿化面積也在日益擴大。為了克服鹽堿對水稻生產(chǎn)的不利影響，除了采用傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)栽培保護措施外，種植耐鹽品種成為降低鹽害損失最經(jīng)濟、最環(huán)保、最有效的重要方式之一。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種特異引物對及其在檢測水稻耐鹽性中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供了一種特異引物對，由引物F1和引物R1組成；
所述引物F1為如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列1所示的單鏈DNA分子；
(a2)將序列1經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代且與序列1具有相同功能的DNA分子；
所述引物R1為如下(a3)或(a4)：
(a3)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子；
(a4)將序列2經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代且與序列2具有相同功能的DNA分子。
所述特異引物對的用途為鑒定水稻耐鹽性。
本發(fā)明還保護所述特異引物對在鑒定水稻耐鹽性中的應(yīng)用。
本發(fā)明還保護含有所述特異引物對的試劑盒；所述試劑盒的應(yīng)用為鑒定水稻耐鹽性。
本發(fā)明還保護所述試劑盒的制備方法，包括將各條引物單獨包裝的步驟。
本發(fā)明還保護一種鑒定或輔助鑒定水稻耐鹽性的方法，包括如下步驟：提取待測水稻的基因組DNA，以待測水稻的基因組DNA為模板，采用所述特異引物對進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物用BstUI限制性內(nèi)切酶進行酶切，如果酶切產(chǎn)物中具有片段甲、待測水稻為耐鹽水稻，如果酶切產(chǎn)物中具有片段乙和片段丙、待測水稻為感鹽水稻。
所述片段甲為743-763bp的DNA片段。
所述片段乙為450-470bp的DNA片段。
所述片段丙為283-303bp的DNA片段。
所述片段甲具體可為753bp的DNA片段。
所述片段乙具體可為460bp的DNA片段。
所述片段丙具體可為293bp的DNA片段。
耐鹽水稻具體可為VI_R≥0.3的水稻。感鹽水稻具體可為VI_R<0.3的水稻。
VI_R的計算方法如下：將待測水稻的種子分為兩組，一組進行鹽溶液處理，一組進行水處理，在平行試驗的情況下，計算VI，進一步計算VI_R；VI_R＝鹽溶液處理組的VI/水處理組的VI。
VI為種子活力指數(shù)。
VI＝GL×SL，GL表示發(fā)芽指數(shù)；SL表示第10天的平均芽長。
GL＝∑(Ni/n)/i，Ni為第i天種子總發(fā)芽數(shù)，n為種子總數(shù)，i為實驗進行到第i天。
所述鹽處理具體可為采用60mM NaCl水溶液處理。
所述水處理具體可為采用蒸餾水處理。
所述鹽處理和所述水處理的條件具體可為：放置在30℃，相對濕度為80％的恒溫箱中處理10天(12h光照/12h黑暗)。
計算發(fā)芽指數(shù)時，具體可從第3天開始，每天記錄種子發(fā)芽數(shù)目并統(tǒng)計芽長，當芽長為種子長度一半，同時根長大于種子本身長度時作為種子發(fā)芽的標準。
所述待測水稻具體可為栽培稻。
所述待測水稻具體可為如下水稻材料中的任意一種：ESCARLATE：：GERVEX 887-C1、SAMBA：：GERVEX 186-C1、78XUAN WU：：IRGC 70475-1、ARC 7336：：IRGC 20606-1、E4197：：IRGC 68004-1、GENG 77-4：：IRGC 59321-1、GORIA：：IRGC 58736-1、HONG YANGZAO 3：：IRGC 67177-1、LUO AI ZAO 3：：IRGC 63730-1、M 142：：IRGC 35054-1、MIAOZHAN：：IRGC 76691-1、PERUNEL 0-69-18：：IRGC 19581-1、PINIDWA QAN QIPUGOPINGKITAN：：IRGC 23359-1、SAFARI、ARC 11822：：IRGC 21677-1、AUS 233：：IRGC29036-1、AUS 344：：IRGC 29131-1、BIR BAHADUR：：IRGC 53889-1、KARIA：：IRGC 6702-1、LAL TAURA：：IRGC 35017-1、NARIKEL BADI：：IRGC 37550-1、RANRUWAN：：IRGC 36360-1、AE NOUA：：IRGC 89308-1、B 3913B 16-20ST 28：：IRGC 63099-1、BALIBUD：：IRGC26871-1、BHU BHUSI：：IRGC 70803-1、DA HEI GU：：IRGC 72009-1、DAWK PUD KHAO：：IRGC 65808-1、DO KHAW：：IRGC 106977-1、HALSUDU HEENATI：：IRGC 15599-1、HONG MI JIU GONG JI：：IRGC 74031-1、JAERAERYUKDO：：IRGC 73053-1、RIKUTO KEMOCHI、GITANO：：IRGC82424-1、AI DA：：IRGC 72567-1、BAK TULSI：：IRGC 34831-1、IH PEN SHIM MING：：IRGC 26067-1、B 6311 A 5553-16-2：：IRGC 14541-1、ARC 11751：：IRGC 21614-1、ARC 12101：：IRGC 21907-1、BARI SUTAR：：IRGC 52410-1、BEGMI 135：：IRGC 27845-1。
所述待測水稻為以如下水稻材料中的任意一種或兩種為親本得到的后代：ESCARLATE：：GERVEX 887-C1、SAMBA：：GERVEX 186-C1、78XUAN WU：：IRGC 70475-1、ARC 7336：：IRGC 20606-1、E 4197：：IRGC 68004-1、GENG 77-4：：IRGC 59321-1、GORIA：：IRGC 58736-1、HONG YANG ZAO 3：：IRGC 67177-1、LUO AI ZAO 3：：IRGC 63730-1、M 142：：IRGC 35054-1、MIAO ZHAN：：IRGC 76691-1、PERUNEL 0-69-18：：IRGC 19581-1、PINIDWA QAN QIPUGO PINGKITAN：：IRGC 23359-1、SAFARI、ARC 11822：：IRGC 21677-1、AUS 233：：IRGC 29036-1、AUS 344：：IRGC 29131-1、BIR BAHADUR：：IRGC 53889-1、KARIA：：IRGC 6702-1、LAL TAURA：：IRGC 35017-1、NARIKEL BADI：：IRGC 37550-1、RANRUWAN：：IRGC 36360-1、AE NOUA：：IRGC 89308-1、B 3913B 16-20ST 28：：IRGC 63099-1、BALIBUD：：IRGC 26871-1、BHU BHUSI：：IRGC 70803-1、DA HEI GU：：IRGC 72009-1、DAWK PUD KHAO：：IRGC 65808-1、DO KHAW：：IRGC 106977-1、HALSUDU HEENATI：：IRGC 15599-1、HONG MI JIU GONG JI：：IRGC 74031-1、JAERAERYUKDO：：IRGC 73053-1、RIKUTO KEMOCHI、GITANO：：IRGC 82424-1、AI DA：：IRGC 72567-1、BAK TULSI：：IRGC 34831-1、IH PEN SHIM MING：：IRGC 26067-1、B 6311 A 5553-16-2：：IRGC 14541-1、ARC 11751：：IRGC 21614-1、ARC 12101：：IRGC 21907-1、BARI SUTAR：：IRGC 52410-1、BEGMI 135：：IRGC 27845-1。
所述引物F1和引物R1均以引物溶液形式加入至PCR反應(yīng)體系中，各條引物在引物溶液中的初始濃度均為10μM。
所述PCR擴增的反應(yīng)體系具體可為：模板DNA 1.5μL(50-300ng)，引物F1 1μL，引物R1 1μL，2×TSINGKE Master Mix7.5μL和ddH204μL。
所述PCR擴增的反應(yīng)程序具體可為：94℃預(yù)變性5min；94℃1min，65℃1min，72℃1min，35個循環(huán)；72℃延伸10min。
本發(fā)明還保護所述特異引物對或所述試劑盒或所述方法在水稻育種中的應(yīng)用。
所述育種的目的是選育耐鹽性水稻。
本發(fā)明提供了一種特異引物對，還提供了利用特異引物對檢測水稻耐鹽性的方法。本發(fā)明建立的檢測方法可用于預(yù)測水稻耐鹽性，對于水稻育種有重要意義。
附圖說明
圖1為42份水稻材料基因組DNA的PCR擴增產(chǎn)物酶切電泳檢測結(jié)果。
具體實施方式
以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。以下實施例中，各條引物均以引物溶液形式加入至PCR反應(yīng)體系中，各條引物在引物溶液中的初始濃度均為10μM。
以下實施例中的水稻材料均已經(jīng)在參考文獻：3K RGP.The 3,000 rice genomes project[J].Gigascience，2014，3：7.中公開記載。
實施例1、引物設(shè)計
對水稻基因組進行大量序列分析，設(shè)計了用于檢測水稻耐鹽性的一對引物(5’→3’)：
F1(序列表的序列1)：ACGAAGTGGAGGCAGGTATGTC；
R1(序列表的序列2)：TGCCGAGTTTTGGGTCTATTTTC。
實施例2、水稻耐鹽性檢測方法建立
提取待測水稻的基因組DNA，以基因組DNA為模板，采用實施例1設(shè)計的引物對進行PCR擴增。經(jīng)PCR擴增的產(chǎn)物用BstUI限制性內(nèi)切酶37℃酶切3h。如果酶切產(chǎn)物中具有753bp的DNA片段、待測水稻為耐鹽水稻，如果酶切產(chǎn)物中具有460bp的DNA片段和293bp的DNA片段、待測水稻為感鹽水稻。
PCR擴增體系(15μL)：模板DNA 1.5μL，引物F1 1μL，引物R1 1μL，2×TSINGKE Master Mix 7.5μL和ddH2O 4μL。
PCR擴增反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；94℃ 1min，65℃ 1min，72℃1min，35個循環(huán)；72℃延伸10min。
酶切反應(yīng)體系(20μL)：PCR擴增產(chǎn)物10μL，酶切buffer 2μL，BstUI限制性內(nèi)切酶0.5μL，ddH2O 8μL。
實施例3、水稻耐鹽性檢測
1、采用42份水稻材料作為實驗材料，每份材料選出120粒飽滿的種子，在溫度為50℃的烘箱中烘3天。將每份種子分成4份(鹽處理組和對照組，每組設(shè)置兩個重復(fù)，每個重復(fù)30粒種子)。
2、將步驟1的種子用體積百分比為15％的次氯酸鈉水溶液浸泡20min，用蒸餾水清洗3次。
3、在直徑9cm的培養(yǎng)皿中放置雙層濾紙，將30粒種子均勻分布于濾紙上，然后加入處理液(每天更換新配制的處理液，每次的加入量為10ml；鹽處理組的處理液為60mM鹽水，對照組的處理液為蒸餾水)，將培養(yǎng)皿放置在30℃，相對濕度為80％的恒溫箱中處理10天(12h光照/12h黑暗)。從第3天起，每天記錄種子發(fā)芽數(shù)目并統(tǒng)計芽長，當芽長為種子長度一半，同時根長大于種子本身長度時作為種子發(fā)芽的標準。根據(jù)統(tǒng)計的數(shù)據(jù)計算種子活力指數(shù)(VI)：VI＝GL×SL，其中GL表示發(fā)芽指數(shù)(GL＝∑(Ni/30)/i，Ni為第i天種子總發(fā)芽數(shù)，30為實驗種子總數(shù)，i為實驗進行到第i天)，SL表示第10天的平均芽長。VI_R＝鹽處理組的VI/對照組的VI。VI_R≥0.3為耐鹽品種，VI_R＜0.3為感鹽品種。
結(jié)果見表1。42份水稻材料中，33份為耐鹽材料，9份為感鹽材料。
表1 水稻耐鹽性統(tǒng)計
4、分別提取表1中編號1-42號水稻的基因組DNA，按照實施例2的方法進行檢測，結(jié)果如圖1所示，圖1中，M為DNA maker，泳道1-42分別對應(yīng)表1中編號1-42的水稻品種。泳道1-33均得到一個條帶(條帶甲)，泳道34-42均得到兩個條帶(條帶乙、條帶丙)。
回收各個條帶并進行測序，條帶甲為753bp，條帶乙為460bp，條帶丙為293bp。結(jié)果表明，33個耐鹽材料的酶切產(chǎn)物中均含有753bp的DNA片段。9個感鹽材料的酶切產(chǎn)物中均含有460bp的DNA片段和293bp的DNA片段。
實施例4、敏感性
待測水稻為：表1中編號1的ESCARLATE：：GERVEX 887-C1水稻和編號34的GITANO：：IRGC 82424-1水稻。
1、提取待測水稻的基因組DNA。
2、用ddH2O稀釋步驟1得到的DNA溶液，得到各個稀釋液。
3、將步驟2得到的稀釋液作為模板，采用實施例1制備的引物對進行PCR擴增。
PCR擴增體系(15μL)：模板DNA 1.5μL，引物F1 1μL，引物R1 1μL，2×TSINGKE Master Mix7.5μL和ddH2O 4μL。
PCR擴增反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；94℃ 1min，65℃1min，72℃1min，35個循環(huán)；72℃延伸10min。
由于采用的稀釋液的稀釋度不同，形成如下不同的反應(yīng)體系：
反應(yīng)體系1中，水稻基因組DNA的初始含量為300ng；
反應(yīng)體系2中，水稻基因組DNA的初始含量為200ng；
反應(yīng)體系3中，水稻基因組DNA的初始含量為150ng；
反應(yīng)體系4中，水稻基因組DNA的初始含量為100ng；
反應(yīng)體系5中，水稻基因組DNA的初始含量為50ng。
4、將步驟2的擴增產(chǎn)物用BstUI限制性內(nèi)切酶進行酶切，酶切產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠進行電泳分析。
酶切反應(yīng)體系(20μL)：PCR擴增產(chǎn)物10μL，酶切buffer 2μL，BstUI限制性內(nèi)切酶0.5μL，ddH2O 8μL。
結(jié)果：采用反應(yīng)體系1-5擴增編號1的ESCARLATE：：GERVEX 887-C1水稻基因組DNA，PCR產(chǎn)物經(jīng)BstUI酶切后，均能形成753bp的特征條帶；采用反應(yīng)體系1-5擴增編號34的GITANO：：IRGC 82424-1水稻基因組DNA，PCR產(chǎn)物經(jīng)BstUI酶切后，均能形成460bp和293bp的兩條特征條帶。結(jié)果表明，當待測水稻基因組DNA含量低至50ng時，采用實施例2建立的檢測方法依然能夠檢測出水稻耐鹽性。
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中國農(nóng)業(yè)科學院深圳生物育種創(chuàng)新研究院
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acgaagtgga ggcaggtatg tc 22
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