1.物種檢疫鑒定中心的運(yùn)行模式,其特征在于,包括以下步驟:
(1)、統(tǒng)一發(fā)放樣品采集工具、樣品采集管及其運(yùn)輸裝置、樣品采集信息記錄表、物種鑒定系統(tǒng)客戶端至一線口岸,所述的樣品采集工具包括一種便攜耐用的野外采集昆蟲(chóng)工具、漏斗形昆蟲(chóng)采樣裝置、電動(dòng)吸蚊器、雙層疊帳、誘蚊器、粘鼠板、Ⅱ號(hào)鼠夾、鼠籠,所述的樣品采集信息表包括輸出國(guó)、啟運(yùn)港、中轉(zhuǎn)港、到達(dá)港、貨物類型和數(shù)量、貨物包裝種類和數(shù)量、啟運(yùn)時(shí)間、到港時(shí)間,所述的物種鑒定系統(tǒng)客戶端是以物種檢疫鑒定中心已有的GLIMS業(yè)務(wù)管理系統(tǒng)為基礎(chǔ)的手機(jī)版APP或其他接口;
(2)、進(jìn)行樣品采集:如若發(fā)現(xiàn)活體標(biāo)本,放置于-20℃冰箱中冷凍處理,待其死亡后,依據(jù)檢測(cè)需求,將標(biāo)本保存于對(duì)應(yīng)的樣品采集管中,已死亡的個(gè)體或殘肢同樣依據(jù)不同的檢測(cè)需求裝入不同的樣品采集管中,采集樣品后需填寫(xiě)步驟(1)的樣品采集信息記錄表,并掃描樣品采集管上的唯一性條碼標(biāo)識(shí)將樣品單號(hào)錄入至物種鑒定系統(tǒng),對(duì)采樣現(xiàn)場(chǎng)和采集的樣本進(jìn)行拍照記錄,記錄采集現(xiàn)場(chǎng)的環(huán)境情況,了解樣本入境的方式;
(3)、樣品送檢的前處理:樣品送檢的前處理:根據(jù)采集到樣本的種類以及口岸的意愿,可選擇整體樣本送檢或者組織送檢,蠅類、蚤類、螨類、蜱類體積較小的媒介生物,可以直接將標(biāo)本保存在含樣品保存劑的樣品采集管中,對(duì)于身體表面鱗片較多,而且鱗片形成的體表花紋具有重要分類意義的生物,以送干制標(biāo)本為宜,如果需要進(jìn)行病原體尤其是RNA病原體的檢測(cè),則需盡快將樣品低溫處死,在覆蓋一層保鮮膜的冰盤(pán)中快速分揀種類,以液氮或干冰冷凍方式2小時(shí)之內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè),或者將新鮮采集并分揀后的樣品放入無(wú)液氮RNA樣品儲(chǔ)存液中,盡快送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè);如果口岸需保存標(biāo)本,也可取標(biāo)本部分組織保存于含樣品保存劑的樣品采集管中,取樣的原則是對(duì)標(biāo)本的外部形態(tài)破壞降到最低,標(biāo)本的其余部分在做好唯一性條碼標(biāo)識(shí)后,貼上與送檢樣品采集管上的一一對(duì)應(yīng)的條碼標(biāo)志和樣品采集標(biāo)簽,所述的樣品采集標(biāo)簽包括采集地、采集時(shí)間、采集人和采集管對(duì)應(yīng)的條碼標(biāo)志,妥善保管,以備后用;
(4)、送樣:將已采樣的樣品采集管放入專門(mén)的樣品采集管運(yùn)輸裝置中,附上填寫(xiě)完整的步驟(2)的采集信息記錄表通過(guò)郵寄或者專人送達(dá)的方式將標(biāo)本送至物種檢疫鑒定中心;
(5)、收樣:物種檢疫鑒定中心在樣品送達(dá)后,掃描唯一性條碼標(biāo)志錄入單號(hào),并將步驟(2)的采集信息記錄表內(nèi)容錄入物種鑒定系統(tǒng),同時(shí)物種鑒定系統(tǒng)更新檢測(cè)進(jìn)度,將收樣信息發(fā)至送樣口岸物種鑒定系統(tǒng)客戶端,口岸物種鑒定系統(tǒng)客戶端可隨時(shí)登錄系統(tǒng)查看進(jìn)度;
(6)、送檢樣品物理信息的采集:物種檢疫鑒定中心利用雙面觀顯微裝置及昆蟲(chóng)無(wú)損照相的裝置對(duì)采集標(biāo)本的圖像等物理信息進(jìn)行處理,并錄入系統(tǒng);
(7)、樣品DNA條形碼的檢測(cè):提取DNA,采用通用的DNA條形碼基因片段對(duì)送檢樣本進(jìn)行檢測(cè)鑒定,對(duì)于難區(qū)分的近緣種,物種檢疫鑒定中心將聯(lián)合采用線粒體COI、COII、12S、16S和Cytb基因、核糖體ITS2基因多基因聯(lián)合對(duì)送檢的樣本進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定,利用醫(yī)學(xué)媒介生物攜帶病原體快速檢測(cè)技術(shù),采用改進(jìn)的媒介生物攜帶細(xì)菌性病原體的NGS檢測(cè)前處理方法,分別獲得單個(gè)媒介生物體內(nèi)外攜帶的細(xì)菌性病原體DNA,使用篩選的用于鑒定媒介生物攜帶細(xì)菌性病原體的最佳可變區(qū)或多個(gè)可變區(qū)組合,利用優(yōu)化的PCR擴(kuò)增方法,并采用新一代測(cè)序平臺(tái),一次性高通量的檢測(cè)醫(yī)學(xué)媒介生物攜帶細(xì)菌性病原體,實(shí)現(xiàn)對(duì)輸入性醫(yī)學(xué)媒介生物的DNA條形碼鑒定及攜帶病原體的檢測(cè),或采用特異性引物檢測(cè)輸入性媒介生物所攜帶的病毒性病原體或者寄生蟲(chóng);
(8)、結(jié)果反饋:物種檢疫鑒定中心通過(guò)物種鑒定系統(tǒng)將鑒定結(jié)果推送反饋至口岸GLIMS業(yè)務(wù)管理系統(tǒng)客戶端,并按委托方的要求返還樣本,寄送檢測(cè)報(bào)告,或者在征得送檢方同意的前提下將樣品保存在物種檢疫鑒定中心。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的物種檢疫鑒定中心的運(yùn)行模式,其特征在于,所述的樣品采集管,有大、中、小三種規(guī)格,直徑分別為60mm、30mm、10mm,分別適用于不同大小的醫(yī)學(xué)媒介生物,包括蓋子(1)、管體(2)、泡沫填充(5)、昆蟲(chóng)針(3)及唯一性條碼標(biāo)識(shí)(4),所述的泡沫填充(5)需填充于管體(2)最下部,所述的唯一性條碼標(biāo)識(shí)(4)被印刷于管體(2)外壁上,所述的泡沫填充(5)可被樣品保存劑(6)來(lái)替代,制成可密封保存的液體浸泡采集管,所述的樣品保存劑(6)為非凍型組織DNA保存液或無(wú)液氮RNA樣品儲(chǔ)存液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的物種檢疫鑒定中心的運(yùn)行模式,其特征在于,所述的采集管運(yùn)輸裝置也有大、中、小三種規(guī)格,分別適用于不同大小的采集管,包括上蓋(7)、箱體(8)、采集管固定槽(9)及卡扣(10),所述的卡扣(10)位于上蓋(7)的邊緣位置,所述的采集管固定槽(9)陳列在箱體(8)內(nèi),箱體(8)內(nèi)部放置有冷凍液,可較長(zhǎng)時(shí)間位置-20℃的環(huán)境。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的物種檢疫鑒定中心的運(yùn)行模式,其特征在于,所述的漏斗形昆蟲(chóng)采樣裝置,包括漏斗形裝置(11)和廣口瓶(12),所述的漏斗形裝置(11)中間開(kāi)口,邊緣光滑,并卡扣在廣口瓶(12)上,所述的廣口瓶(12)內(nèi)壁光滑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的物種檢疫鑒定中心的運(yùn)行模式,其特征在于,步驟(3)所述的取標(biāo)本部分組織,有以下要求:對(duì)于媒介昆蟲(chóng),采集一條腿保存在樣品采集管中,對(duì)于鼠類,剪2cm的鼠尾、鼠肝或鼠肺保存在樣品采集管中,對(duì)于體積非常小的寄生性醫(yī)學(xué)媒介生物,如螨、蜱、蚤,如果是活體,將媒介生物饑餓處理,放入樣品采集管中,如果是死亡個(gè)體,則直接放入樣品采集管中。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的物種檢疫鑒定中心的運(yùn)行模式,其特征在于,步驟(7)所述多基因聯(lián)合,具體步驟為:分別從樣本取1條后足,進(jìn)行基因組DNA提取,PCR擴(kuò)增所用引物為:COⅠ:GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATATTGG,TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA;COII:CCTCGTCGTTATTCAGATTATCCTGA,TCAGGATAATCTGAATAACGTCGACC;12S:TTAGGTGAAAGCGACGGGCGAT,AATTTGTGCCAGCAGYCGCGGT;16S:CGCCTGTTTATCAAAAACAT,CCGGTCTGAACTCAGATCACGT;Cytb:GGWTAYGTWYTWCCWTGRGGWCARAT,GCRTAWGCRAAWARRAARTAYCAYTCWGG;ITS2:GCATCGATGAAGAACGCAGC,GCTGCGTTCTTCATCGATGC,PCR反應(yīng)體系:10×PCR buffer 5μl20μmol/L濃度的正向引物2.5μl,10μmol/L濃度的dNTP 1.5μl,Ex-TaqDNA聚合酶1μl,模板DNA 2μl,無(wú)菌水定容到50μl;擴(kuò)增條件:94℃變性5min;94℃40s,54℃40s,72℃1min,反應(yīng)40個(gè)循環(huán);72℃延伸10min;PCR結(jié)束后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行兩端雙向測(cè)序,序列分析與比對(duì)測(cè)序結(jié)果經(jīng)校對(duì)無(wú)誤后用于后續(xù)分析,所得序列上傳至GenBank,將序列在GenBank和BOLD中進(jìn)行序列比對(duì),進(jìn)行種類鑒定,用軟件進(jìn)行分析,以Kimura 2-parameter模式構(gòu)建鄰接法系統(tǒng)樹(shù),輔助進(jìn)行種類的鑒定。