本發(fā)明屬于口岸采樣送樣檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化領(lǐng)域，具體涉及一種物種檢疫鑒定中心的運(yùn)行模式。

背景技術(shù)：
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輸入性醫(yī)學(xué)媒介生物及其傳播的各種疾病對(duì)人類公共衛(wèi)生危害非常嚴(yán)重，是世界最重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。全球一體化為輸入性醫(yī)學(xué)媒介生物及蟲(chóng)媒病的廣范圍、快速度的傳播提供了機(jī)會(huì)；新發(fā)傳染病不斷出現(xiàn)，各種公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)一旦發(fā)生迅速傳遍全球，對(duì)人類的生命健康帶來(lái)前所未有的威脅，檢疫風(fēng)險(xiǎn)顯著加劇。但目前口岸現(xiàn)有的輸入性醫(yī)學(xué)媒介生物的傳統(tǒng)形態(tài)鑒定方法存在很多問(wèn)題，如無(wú)法鑒定若蟲(chóng)、雌蟲(chóng)等非成蟲(chóng)態(tài)媒介、肢體殘肢不全的昆蟲(chóng)及近緣種，輸入性媒介由于缺少參考資料和參比標(biāo)本無(wú)法準(zhǔn)確快速鑒定以及數(shù)據(jù)共享性差等。DNA條形碼(DNA barcodes)是用線粒體基因組內(nèi)一段標(biāo)準(zhǔn)的、短的DNA片段來(lái)鑒定物種的一項(xiàng)分子物種鑒定技術(shù)，具有廣泛的應(yīng)用前景，在物種鑒定、假牛羊肉、假魚(yú)翅、以次充好等食品欺詐、中草藥種類、生物多樣性及瀕危物種保護(hù)等研究領(lǐng)域具有一定的應(yīng)用潛力。特別是在物種鑒定方面，借助互聯(lián)網(wǎng)⁺可數(shù)字化共享成為該方法的一大優(yōu)勢(shì)，利用所建立的標(biāo)準(zhǔn)操作流程，并借助建成的大規(guī)模數(shù)據(jù)庫(kù)，實(shí)現(xiàn)了大批量快速準(zhǔn)確地鑒別物種。

口岸截獲的輸入性媒介生物的鑒定大多依賴傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類，大多依賴成蟲(chóng)的形態(tài)特征進(jìn)行鑒定，而口岸截獲的往往是幼蟲(chóng)、卵、蛹等非成蟲(chóng)蟲(chóng)態(tài)。目前通常的做法是將幼蟲(chóng)、卵和蛹等飼養(yǎng)成成蟲(chóng)后再鑒定，鑒定周期長(zhǎng)，存在著很大的公共衛(wèi)生及生態(tài)隱患，且無(wú)法準(zhǔn)確鑒定雌性、肢體殘肢不全的昆蟲(chóng)及近緣種，但是輸入性醫(yī)學(xué)媒介的近緣種在攜帶的病原體上可能有很大的區(qū)別，對(duì)公共衛(wèi)生安全的威脅風(fēng)險(xiǎn)不同，如果鑒定不準(zhǔn)確極易引起防御過(guò)當(dāng)浪費(fèi)資源，或者防御不足產(chǎn)生危害公共衛(wèi)生安全等問(wèn)題，傳統(tǒng)的鑒定手段已無(wú)法滿足提高通關(guān)效率，降低通關(guān)成本，提升口岸通關(guān)和貿(mào)易便利化水平的要求。因此，全國(guó)各大口岸亟待開(kāi)展醫(yī)學(xué)媒介生物鑒定方法的技術(shù)轉(zhuǎn)型升級(jí)、完成檢測(cè)技術(shù)的革新。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的是提供一種物種檢疫鑒定中心的運(yùn)行模式，以DNA條形碼鑒定技術(shù)及相關(guān)分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)為基礎(chǔ)，依托本單位獨(dú)立建立的醫(yī)學(xué)媒介生物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)和公共數(shù)據(jù)庫(kù)，運(yùn)用輸入性媒介生物DNA條形碼檢疫鑒定新模式，實(shí)現(xiàn)對(duì)輸入性媒介生物的快速準(zhǔn)確鑒定。

本發(fā)明的物種檢疫鑒定中心的運(yùn)行模式，其特征在于，包括以下步驟：

(1)、統(tǒng)一發(fā)放樣品采集工具、樣品采集管及其運(yùn)輸裝置、樣品采集信息記錄表、物種鑒定系統(tǒng)客戶端至一線口岸，所述的樣品采集工具包括一種便攜耐用的野外采集昆蟲(chóng)工具、漏斗形昆蟲(chóng)采樣裝置、電動(dòng)吸蚊器、雙層疊帳、誘蚊器、粘鼠板、Ⅱ號(hào)鼠夾、鼠籠，所述的樣品采集信息表包括輸出國(guó)、啟運(yùn)港、中轉(zhuǎn)港、到達(dá)港、貨物類型和數(shù)量、貨物包裝種類和數(shù)量、啟運(yùn)時(shí)間、到港時(shí)間，所述的物種鑒定系統(tǒng)客戶端是以物種檢疫鑒定中心已有的GLIMS業(yè)務(wù)管理系統(tǒng)為基礎(chǔ)的手機(jī)版APP或其他接口；

(2)、進(jìn)行樣品采集：如若發(fā)現(xiàn)活體標(biāo)本，放置于-20℃冰箱中冷凍處理，待其死亡后，依據(jù)檢測(cè)需求，將標(biāo)本保存于對(duì)應(yīng)的樣品采集管中，已死亡的個(gè)體或殘肢同樣依據(jù)不同的檢測(cè)需求裝入不同的樣品采集管中，采集樣品后需填寫(xiě)步驟(1)的樣品采集信息記錄表，并掃描樣品采集管上的唯一性條碼標(biāo)識(shí)將樣品單號(hào)錄入至物種鑒定系統(tǒng)，對(duì)采樣現(xiàn)場(chǎng)和采集的樣本進(jìn)行拍照記錄，記錄采集現(xiàn)場(chǎng)的環(huán)境情況，了解樣本入境的方式；

(3)、樣品送檢的前處理：根據(jù)采集到樣本的種類以及口岸的意愿，可選擇整體樣本送檢或者組織送檢，蠅類、蚤類、螨類、蜱類體積較小的媒介生物，可以直接將標(biāo)本保存在含樣品保存劑的樣品采集管中，對(duì)于身體表面鱗片較多，而且鱗片形成的體表花紋具有重要分類意義的生物，以送干制標(biāo)本為宜，如果需要進(jìn)行病原體尤其是RNA病原體的檢測(cè)，則需盡快將樣品低溫處死，在覆蓋一層保鮮膜的冰盤(pán)中快速分揀種類，以液氮或干冰冷凍方式2小時(shí)之內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，或者將新鮮采集并分揀后的樣品放入無(wú)液氮RNA樣品儲(chǔ)存液中，盡快送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)；如果口岸需保存標(biāo)本，也可取標(biāo)本部分組織保存于含樣品保存劑的樣品采集管中，取樣的原則是對(duì)標(biāo)本的外部形態(tài)破壞降到最低，標(biāo)本的其余部分在做好唯一性條碼標(biāo)識(shí)后，貼上與送檢樣品采集管上的一一對(duì)應(yīng)的條碼標(biāo)志和樣品采集標(biāo)簽，所述的樣品采集標(biāo)簽包括采集地、采集時(shí)間、采集人和采集管對(duì)應(yīng)的條碼標(biāo)志，妥善保管，以備后用；

(4)、送樣：將已采樣的樣品采集管放入專門的樣品采集管運(yùn)輸裝置中，附上填寫(xiě)完整的步驟(2)的采集信息記錄表通過(guò)郵寄或者專人送達(dá)的方式將標(biāo)本送至物種檢疫鑒定中心；

(5)、收樣：物種檢疫鑒定中心在樣品送達(dá)后，掃描唯一性條碼標(biāo)志錄入單號(hào)，并將步驟(2)的采集信息記錄表內(nèi)容錄入物種鑒定系統(tǒng)，同時(shí)物種鑒定系統(tǒng)更新檢測(cè)進(jìn)度，將收樣信息發(fā)至送樣口岸物種鑒定系統(tǒng)客戶端，口岸物種鑒定系統(tǒng)客戶端可隨時(shí)登錄系統(tǒng)查看進(jìn)度；

(6)、送檢樣品物理信息的采集：物種檢疫鑒定中心利用雙面觀顯微裝置及昆蟲(chóng)無(wú)損照相的裝置對(duì)采集標(biāo)本的圖像等物理信息進(jìn)行處理，并錄入系統(tǒng)；

(7)、樣品DNA條形碼的檢測(cè)：提取DNA，采用通用的DNA條形碼基因片段對(duì)送檢樣本進(jìn)行檢測(cè)鑒定，對(duì)于難區(qū)分的近緣種，物種檢疫鑒定中心將聯(lián)合采用線粒體COI、COII、12S、16S和Cytb基因、核糖體ITS2基因多基因聯(lián)合對(duì)送檢的樣本進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定。利用醫(yī)學(xué)媒介生物攜帶病原體快速檢測(cè)技術(shù)，采用改進(jìn)的媒介生物攜帶細(xì)菌性病原體的NGS檢測(cè)前處理方法，分別獲得單個(gè)媒介生物體內(nèi)外攜帶的細(xì)菌性病原體DNA，使用篩選的用于鑒定媒介生物攜帶細(xì)菌性病原體的最佳可變區(qū)或多個(gè)可變區(qū)組合，利用優(yōu)化的PCR擴(kuò)增方法，并采用新一代測(cè)序平臺(tái)，一次性高通量的檢測(cè)醫(yī)學(xué)媒介生物攜帶細(xì)菌性病原體，實(shí)現(xiàn)對(duì)輸入性醫(yī)學(xué)媒介生物的DNA條形碼鑒定及攜帶病原體的檢測(cè)，或采用特異性引物檢測(cè)輸入性媒介生物所攜帶的病毒性病原體或者寄生蟲(chóng)；

(8)、結(jié)果反饋：物種檢疫鑒定中心通過(guò)物種鑒定系統(tǒng)將鑒定結(jié)果推送反饋至口岸GLIMS業(yè)務(wù)管理系統(tǒng)客戶端，并按委托方的要求返還樣本，寄送檢測(cè)報(bào)告，或者在征得送檢方同意的前提下將樣品保存在物種檢疫鑒定中心。

優(yōu)選，所述的樣品采集管，有大、中、小三種規(guī)格，直徑分別為60mm、30mm、10mm，分別適用于不同大小的醫(yī)學(xué)媒介生物，包括蓋子、管體、泡沫填充、昆蟲(chóng)針及唯一性條碼標(biāo)識(shí)，所述的泡沫填充需填充于管體最下部，所述的唯一性條碼標(biāo)識(shí)被印刷于管體外壁上，所述的泡沫填充可被樣品保存劑來(lái)替代，制成可密封保存的液體浸泡采集管，所述的樣品保存劑為非凍型組織DNA保存液或無(wú)液氮RNA樣品儲(chǔ)存液。

優(yōu)選，所述的采集管運(yùn)輸裝置也有大、中、小三種規(guī)格，分別適用于不同大小的采集管，包括上蓋、箱體、采集管固定槽及卡扣，所述的卡扣位于上蓋的邊緣位置，所述的采集管固定槽陳列在箱體內(nèi)，箱體內(nèi)部放置有冷凍液，可較長(zhǎng)時(shí)間位置-20℃的環(huán)境。

樣品采集管和采集管運(yùn)輸裝置解決了目前采集裝置不統(tǒng)一、不方便保存標(biāo)本和送樣檢測(cè)的問(wèn)題，可以直接將唯一性條碼標(biāo)識(shí)印刷在采集管上，從而解決貼標(biāo)簽?zāi)：磺寤蛞酌撀涞膯?wèn)題；采集管運(yùn)輸裝置與采集管大小配套使用，可固定采集管，卡扣設(shè)計(jì)方便采集管的放入，扣緊后可保證運(yùn)輸過(guò)程中采集管不易搖晃及灑落，解決了目前已有的送樣裝置非定制不統(tǒng)一、運(yùn)輸不用型號(hào)和外觀的采集管產(chǎn)生搖晃等情況導(dǎo)致標(biāo)本損壞的問(wèn)題。

優(yōu)選，所述的漏斗形昆蟲(chóng)采樣裝置，包括漏斗形裝置和廣口瓶，所述的漏斗形裝置中間開(kāi)口，邊緣光滑，并卡扣在廣口瓶上，所述的廣口瓶?jī)?nèi)壁光滑。

所述的漏斗形昆蟲(chóng)采樣裝置使用時(shí)，需將廣口瓶埋入地下，瓶口幾乎與地面齊平，放誘餌于廣口瓶底部，然后將漏斗形裝置卡住瓶口處即可，昆蟲(chóng)被誘餌誘導(dǎo)通過(guò)漏斗形裝置的底口鉆進(jìn)廣口瓶中，由于廣口瓶?jī)?nèi)壁光滑，故昆蟲(chóng)不易逃脫且能夠在被檢測(cè)前保持形體的完整性。

優(yōu)選，步驟(3)所述的取標(biāo)本部分組織，有以下要求：對(duì)于媒介昆蟲(chóng)，采集一條腿保存在樣品采集管中，對(duì)于鼠類，剪2cm的鼠尾、鼠肝或鼠肺保存在樣品采集管中，對(duì)于體積非常小的寄生性醫(yī)學(xué)媒介生物，如螨、蜱、蚤，如果是活體，將媒介生物饑餓處理，放入樣品采集管中，如果是死亡個(gè)體，則直接放入樣品采集管中。饑餓處理是為了減少由于吸食寄主的血液對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成污染。

優(yōu)選，步驟(7)所述的多基因聯(lián)合，具體步驟為：分別從樣本取1條后足，進(jìn)行基因組DNA提取，PCR擴(kuò)增所用引物為：COⅠ：GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATATTGG，TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA；COII：CCTCGTCGTTATTCAGATTATCCTGA，TCAGGATAATCTGAATAACGTCGACC；12S：TTAGGTGAAAGCGACGGGCGAT，AATTTGTGCCAGCAGYCGCGGT；16S：CGCCTGTTTATCAAAAACAT，CCGGTCTGAACTCAGATCACGT；Cytb：GGWTAYGTWYTWCCWTGRGGWCARAT，GCRTAWGCRAAWARRAARTAYCAYTCWGG；ITS2：GCATCGATGAAGAACGCAGC，GCTGCGTTCTTCATCGATGC，PCR反應(yīng)體系：10×PCR buffer 5μl20μmol/L濃度的正向引物2.5μl，10μmol/L濃度的dNTP 1.5μl，Ex-TaqDNA聚合酶1μl，模板DNA 2μl，無(wú)菌水定容到50μl；擴(kuò)增條件：94℃變性5min；94℃40s，54℃40s，72℃1min，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；PCR結(jié)束后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行兩端雙向測(cè)序，序列分析與比對(duì)測(cè)序結(jié)果經(jīng)校對(duì)無(wú)誤后用于后續(xù)分析，所得序列上傳至GenBank，將序列在GenBank和BOLD中進(jìn)行序列比對(duì)，進(jìn)行種類鑒定，用軟件進(jìn)行分析，以Kimura 2-parameter模式構(gòu)建鄰接法系統(tǒng)樹(shù)，輔助進(jìn)行種類的鑒定。

所述的便攜耐用的野外采集昆蟲(chóng)工具，其結(jié)構(gòu)及使用方法如中國(guó)專利ZL201520094555.7所示。所述的電動(dòng)吸蚊器、雙層疊帳、誘蚊器、粘鼠板、Ⅱ號(hào)鼠夾、鼠籠、非凍型組織DNA保存液、無(wú)液氮RNA樣品儲(chǔ)存液均可在市面上購(gòu)買得到。

步驟(1)所述的物種鑒定系統(tǒng)擁有軟件著作權(quán)，軟著登字第0564334。

所述的雙面觀顯微裝置其結(jié)構(gòu)及使用方法如中國(guó)專利ZL201420701647.2所示，所述的昆蟲(chóng)無(wú)損照相的裝置其結(jié)構(gòu)及使用方法如中國(guó)專利ZL201520006169.8所示。

步驟(7)所述的提取DNA，對(duì)于整體或組織較大的樣品，取部分組織研磨后，提取樣品組織的基因組DNA，對(duì)于個(gè)體非常小的媒介生物，參考中國(guó)專利ZL201310375667.5的方法提取DNA，直接獲得DNA條形碼片段。參考中國(guó)專利申請(qǐng)201610147895.0的方法，在不破壞憑證標(biāo)本的前提下，獲取蜱螨這些微小媒介生物的DNA條形碼數(shù)據(jù)，所述的組織研磨。使用中國(guó)專利ZL201420855384.0的拋棄型微量生物組織研磨工具。

目前，物種鑒定中心已經(jīng)收集了全國(guó)大陸28個(gè)省份的口岸及周邊地區(qū)的近400種7萬(wàn)余頭媒介生物，原始取得DNA條形碼數(shù)據(jù)萬(wàn)余條。本發(fā)明建立媒介生物DNA條形碼檢疫鑒定新模式，實(shí)現(xiàn)輸入性醫(yī)學(xué)媒介生物的快速準(zhǔn)確鑒定。解決了醫(yī)學(xué)媒介生物尤其是媒介昆蟲(chóng)的檢測(cè)受發(fā)育狀態(tài)、肢體殘缺的不全限制、近緣種難以準(zhǔn)確鑒定、某些雌性昆蟲(chóng)無(wú)法鑒定以及輸入性醫(yī)學(xué)媒介生物由于缺少參考資料和參比標(biāo)本無(wú)法準(zhǔn)確快速鑒定的難題，為防控輸入性媒介生物入侵，保障我國(guó)公共衛(wèi)生和生態(tài)安全提供技術(shù)支持。

本發(fā)明建立了標(biāo)準(zhǔn)化的采樣、送樣、檢測(cè)等流程，保證了樣品或樣品組織的統(tǒng)一不會(huì)被污染，從而更加高效、準(zhǔn)確的獲得鑒定結(jié)果。

附圖說(shuō)明：

圖1是大號(hào)采集管的結(jié)構(gòu)示意圖，A為裝有泡沫填充的干制樣品保存管，B為帶有樣品保存劑的液體浸泡采集管；

圖2是中號(hào)采集管的結(jié)構(gòu)示意圖，A為裝有泡沫填充的干制樣品保存管，B為帶有樣品保存劑的液體浸泡采集管；

圖3是小號(hào)采集管的結(jié)構(gòu)示意圖，A為裝有泡沫填充的干制樣品保存管，B為帶有樣品保存劑的液體浸泡采集管

圖4是采集管運(yùn)輸裝置的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖5是漏斗形昆蟲(chóng)采樣裝置的結(jié)構(gòu)示意圖；

其中，1：蓋子，2：管體，3：昆蟲(chóng)針；4：條碼標(biāo)識(shí)；5：泡沫填充；6：樣品保存劑；7：上蓋；8：箱體；9：采集管固定槽；10：卡扣；11：漏斗形裝置；12：廣口瓶；13：底口。

具體實(shí)施方式：

以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1：

物種檢疫鑒定中心的運(yùn)行模式，包括以下步驟：

(1)、統(tǒng)一發(fā)放樣品采集工具、樣品采集管及其運(yùn)輸裝置、樣品采集信息記錄表、物種鑒定系統(tǒng)客戶端至一線口岸，所述的樣品采集工具包括一種便攜耐用的野外采集昆蟲(chóng)工具(參考中國(guó)專利ZL201520094555.7)、漏斗形昆蟲(chóng)采樣裝置、電動(dòng)吸蚊器(天牌)、雙層疊帳(YWJC-01DZ)、誘蚊器、粘鼠板(15×15cm)(達(dá)豪)、Ⅱ號(hào)鼠夾、鼠籠(18×18×38cm)，所述的樣品采集信息表包括輸出國(guó)、啟運(yùn)港、中轉(zhuǎn)港、到達(dá)港、貨物類型和數(shù)量、貨物包裝種類和數(shù)量、啟運(yùn)時(shí)間、到港時(shí)間，所述的物種鑒定系統(tǒng)客戶端是以物種檢疫鑒定中心已有的GLIMS業(yè)務(wù)管理系統(tǒng)為基礎(chǔ)的手機(jī)版APP或其他接口；

(2)、進(jìn)行樣品采集：如若發(fā)現(xiàn)活體標(biāo)本，放置于-20℃冰箱中冷凍處理，待其死亡后，依據(jù)檢測(cè)需求，將標(biāo)本保存于對(duì)應(yīng)的樣品采集管中，已死亡的個(gè)體或殘肢同樣依據(jù)不同的檢測(cè)需求裝入不同的樣品采集管中，采集樣品后需填寫(xiě)步驟(1)的樣品采集信息記錄表，并掃描樣品采集管上的唯一性條碼標(biāo)識(shí)將樣品單號(hào)錄入至物種鑒定系統(tǒng)，對(duì)采樣現(xiàn)場(chǎng)和采集的樣本進(jìn)行拍照記錄，記錄采集現(xiàn)場(chǎng)的環(huán)境情況，了解樣本入境的方式；

(3)、樣品送檢的前處理：根據(jù)采集到樣本的種類以及口岸的意愿，可選擇整體樣本送檢或者組織送檢，蠅類、蚤類、螨類、蜱類體積較小的媒介生物，可以直接將標(biāo)本保存在含樣品保存劑的樣品采集管中，對(duì)于身體表面鱗片較多，而且鱗片形成的體表花紋具有重要分類意義的生物，以送干制標(biāo)本為宜，如果需要進(jìn)行病原體尤其是RNA病原體的檢測(cè)，則需盡快將樣品低溫處死，在覆蓋一層保鮮膜的冰盤(pán)中快速分揀種類，以液氮或干冰冷凍方式2小時(shí)之內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，或者將新鮮采集并分揀后的樣品放入無(wú)液氮RNA樣品儲(chǔ)存液(RNAfixer GK3132)(上海捷瑞生物工程有限公司)中，盡快送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)；如果口岸需保存標(biāo)本，也可取標(biāo)本部分組織保存于含樣品保存劑的樣品采集管中，取樣的原則是對(duì)標(biāo)本的外部形態(tài)破壞降到最低，標(biāo)本的其余部分在做好唯一性條碼標(biāo)識(shí)后，貼上與送檢樣品采集管上的一一對(duì)應(yīng)的條碼標(biāo)志和樣品采集標(biāo)簽，所述的樣品采集標(biāo)簽包括采集地、采集時(shí)間、采集人和采集管對(duì)應(yīng)的條碼標(biāo)志，妥善保管，以備后用；

(4)、送樣：將已采樣的樣品采集管放入專門的樣品采集管運(yùn)輸裝置中，附上填寫(xiě)完整的步驟(2)的采集信息記錄表通過(guò)郵寄或者專人送達(dá)的方式將標(biāo)本送至物種檢疫鑒定中心；

(5)、收樣：物種檢疫鑒定中心在樣品送達(dá)后，掃描唯一性條碼標(biāo)志錄入單號(hào)，并將步驟(2)的采集信息記錄表內(nèi)容錄入物種鑒定系統(tǒng)，同時(shí)物種鑒定系統(tǒng)更新檢測(cè)進(jìn)度，將收樣信息發(fā)至送樣口岸物種鑒定系統(tǒng)客戶端，口岸物種鑒定系統(tǒng)客戶端可隨時(shí)登錄系統(tǒng)查看進(jìn)度；

(6)、送檢樣品物理信息的采集：物種檢疫鑒定中心利用雙面觀顯微裝置(參考中國(guó)專利ZL201420701647.2)及昆蟲(chóng)無(wú)損照相的裝置(參考中國(guó)專利ZL201520006169.8)對(duì)采集標(biāo)本的圖像等物理信息進(jìn)行處理，并錄入系統(tǒng)；

(7)、樣品DNA條形碼的檢測(cè)：提取DNA，對(duì)于整體或組織較大的樣品，取部分組織研磨后，提取樣品組織的基因組DNA，對(duì)于個(gè)體非常小的媒介生物，參考中國(guó)專利ZL201310375667.5的方法提取DNA，直接獲得DNA條形碼片段，參考中國(guó)專利申請(qǐng)201610147895.0的方法，在不破壞憑證標(biāo)本的前提下，獲取蜱螨這些微小媒介生物的DNA條形碼數(shù)據(jù)，所述的組織研磨。使用中國(guó)專利ZL201420855384.0的拋棄型微量生物組織研磨工具；然后采用通用的DNA條形碼基因片段對(duì)送檢樣本進(jìn)行檢測(cè)鑒定(鑒定方法參考岳巧云，邱德義，胡佳，等.DNA條形碼—醫(yī)學(xué)媒介生物快速準(zhǔn)確鑒定的利器[J].檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊，2013(5):60)，對(duì)于難區(qū)分的近緣種，物種檢疫鑒定中心將聯(lián)合采用線粒體COI、COII、12S、16S和Cytb基因、核糖體ITS2基因多基因聯(lián)合對(duì)送檢的樣本進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定，利用醫(yī)學(xué)媒介生物攜帶病原體快速檢測(cè)技術(shù)(具體方法參考陳健等《NGS法檢測(cè)大頭金蠅攜帶細(xì)菌性病原體的研究》)，采用改進(jìn)的媒介生物攜帶細(xì)菌性病原體的NGS檢測(cè)前處理方法，分別獲得單個(gè)媒介生物體內(nèi)外攜帶的細(xì)菌性病原體DNA，使用篩選的用于鑒定媒介生物攜帶細(xì)菌性病原體的最佳可變區(qū)或多個(gè)可變區(qū)組合(具體方法參考Chakravorty S,Helb D,Burday M,et al.A detailed analysis of 16S ribosomal RNA gene segments for the diagnosis of pathogenic bacteria[J].Journal of microbiological methods,2007,69(2):330-339.)，利用優(yōu)化的PCR擴(kuò)增方法并采用新一代測(cè)序平臺(tái)(Illumina(HiSeq 2500/4000)測(cè)序平臺(tái)，深圳華大基因公司)，一次性高通量的檢測(cè)醫(yī)學(xué)媒介生物攜帶細(xì)菌性病原體，實(shí)現(xiàn)對(duì)輸入性醫(yī)學(xué)媒介生物的DNA條形碼鑒定及攜帶病原體的檢測(cè)，或采用特異性引物檢測(cè)輸入性媒介生物所攜帶的病毒性病原體或者寄生蟲(chóng)(具體方法參考楊美芬,王玉明,黃永坤,等.用細(xì)菌16S rRNA熒光定量PCR法檢測(cè)腸道菌群的變化[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志,2006,18(4):266-269)；

(8)、結(jié)果反饋：物種檢疫鑒定中心通過(guò)物種鑒定系統(tǒng)將鑒定結(jié)果推送反饋至口岸GLIMS業(yè)務(wù)管理系統(tǒng)客戶端，并按委托方的要求返還樣本，寄送檢測(cè)報(bào)告，或者在征得送檢方同意的前提下將樣品保存在物種檢疫鑒定中心。

所述的樣品采集管，有大、中、小三種規(guī)格(分別如圖1、2、3所示)，直徑分別為60mm、30mm、10mm，分別適用于不同大小的醫(yī)學(xué)媒介生物，包括蓋子1、管體2、泡沫填充5、昆蟲(chóng)針3及唯一性條碼標(biāo)識(shí)4，所述的泡沫填充5需填充于管體2最下部，所述的唯一性條碼標(biāo)識(shí)4被印刷于管體2外壁上，所述的泡沫填充5可被樣品保存劑6來(lái)替代，制成可密封保存的液體浸泡采集管，所述的樣品保存劑6為非凍型組織DNA保存液或無(wú)液氮RNA樣品儲(chǔ)存液。

所述的采集管運(yùn)輸裝置也有大、中、小三種規(guī)格，分別適用于不同大小的采集管，如圖4所示，包括上蓋7、箱體8、采集管固定槽9及卡扣10，所述的卡扣10位于上蓋7的邊緣位置，所述的采集管固定槽9陳列在箱體8內(nèi)，箱體8內(nèi)部放置有冷凍液，可較長(zhǎng)時(shí)間位置-20℃的環(huán)境。

樣品采集管和采集管運(yùn)輸裝置解決了目前采集裝置不統(tǒng)一、不方便保存標(biāo)本和送樣檢測(cè)的問(wèn)題，可以直接將唯一性條碼標(biāo)識(shí)印刷在采集管上，從而解決貼標(biāo)簽?zāi)：磺寤蛞酌撀涞膯?wèn)題；采集管運(yùn)輸裝置與采集管大小配套使用，可固定采集管，卡扣設(shè)計(jì)方便采集管的放入，扣緊后可保證運(yùn)輸過(guò)程中采集管不易搖晃及灑落，解決了目前已有的送樣裝置非定制不統(tǒng)一、運(yùn)輸不用型號(hào)和外觀的采集管產(chǎn)生搖晃等情況導(dǎo)致標(biāo)本損壞的問(wèn)題。

所述的漏斗形昆蟲(chóng)采樣裝置，如圖5所示，包括漏斗形裝置11和廣口瓶12，所述的漏斗形裝置11中間開(kāi)口，邊緣光滑，并卡扣在廣口瓶12上，所述的廣口瓶12內(nèi)壁光滑。

所述的漏斗形昆蟲(chóng)采樣裝置使用時(shí)，需將廣口瓶埋入地下，瓶口幾乎與地面齊平，放誘餌于廣口瓶底部，然后將漏斗形裝置卡住瓶口處即可，昆蟲(chóng)被誘餌誘導(dǎo)通過(guò)漏斗形裝置的底口13鉆進(jìn)廣口瓶中，由于廣口瓶?jī)?nèi)壁光滑，故昆蟲(chóng)不易逃脫且能夠在被檢測(cè)前保持形體的完整性。

步驟(3)所述的取標(biāo)本部分組織，有以下要求：對(duì)于媒介昆蟲(chóng)，采集一條腿保存在樣品采集管中，對(duì)于鼠類，剪2cm的鼠尾、鼠肝或鼠肺保存在樣品采集管中，對(duì)于體積非常小的寄生性醫(yī)學(xué)媒介生物，如螨、蜱、蚤，如果是活體，將媒介生物饑餓處理，放入樣品采集管中，如果是死亡個(gè)體，則直接放入樣品采集管中。饑餓處理是為了減少由于吸食寄主的血液對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成污染。

步驟(7)中的多基因聯(lián)合鑒定，具體方法為：分別從樣本取1條后足，采用TIANGEN公司生產(chǎn)的Universal Genomic DNA Extraction試劑盒(編號(hào)：DP302-02)，按照試劑盒的使用手冊(cè)進(jìn)行基因組DNA提取。PCR擴(kuò)增所用引物為：COⅠ：GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG，TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA；COII：CCTCGTCGTTATTCAGATTATCCTGA，TCAGGATAATCTGAATAACGTCGACC；12S：TTAGGTGAAAGCGACGGGCGAT，AATTTGTGCCAGCAGYCGCGGT；16S：CGCCTGTTTATCAAAAACAT，CCGGTCTGAACTCAGATCACGT；Cytb:GGWTAYGTWYTWCCWTGRGGWCARAT，GC RTAWGCRAAWARRAARTAYCAYTCWGG；ITS2：GCATCGATGAAGAACGCAGC，GCTGCGTTCTTCATCGATGC。由寶生物工程(大連)有限公司合成。Ex-Taq DNA聚合酶、dNTP等PCR試劑均從TIANGEN公司購(gòu)置。PCR反應(yīng)體系(50μl)：10×PCR buffer 5μl；正向引物(20μmol/L)2.5μl；dNTP(10mmol/L)1.5μl；Ex-TaqDNA聚合酶1μl；模板DNA 2μl；無(wú)菌水定容到50μl。擴(kuò)增條件：94℃變性5min；94℃40s，54℃40s，72℃1min，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR結(jié)束后將PCR產(chǎn)物送上海立菲科技有限公司進(jìn)行兩端雙向測(cè)序。序列分析與比對(duì)測(cè)序結(jié)果經(jīng)校對(duì)無(wú)誤后用于后續(xù)分析。所得序列上傳至GenBank，將序列在GenBank和BOLD中進(jìn)行序列比對(duì)，進(jìn)行種類鑒定。用Mega 6.06軟件進(jìn)行分析，以Kimura 2-parameter模式構(gòu)建鄰接法系統(tǒng)樹(shù)，輔助進(jìn)行種類的鑒定。