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一種用BseNI鑒定人乳腺癌MALAT1基因rs619586多態(tài)性的方法與流程

文檔序號:12109101閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種用BseNI鑒定人乳腺癌MALAT1基因rs619586多態(tài)性的方法,其特征在于,包括以下步驟:

(a)抽提樣品的基因組DNA;

(b)提供擴(kuò)增人MALAT1基因多態(tài)性rs619586位點(diǎn)附近序列的正向引物和反向引物,以所述待測人基因組DNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng),獲取擴(kuò)增產(chǎn)物;

(c)使用限制性內(nèi)切酶對所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切,獲取相應(yīng)的酶切產(chǎn)物;

(d)將酶切產(chǎn)物采用3%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,以判定MALAT1基因多態(tài)性rs619586位點(diǎn)的各基因型。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用BseNI鑒定人乳腺癌MALAT1基因rs619586多態(tài)性的方法,其特征在于,步驟(b)中所述正向引物和反向引物的設(shè)計與合成具體為:堿基序列信息從NCBI的dbSNP數(shù)據(jù)庫獲取,在CHIP網(wǎng)站上進(jìn)行核對,確定MALAT1多態(tài)位點(diǎn)堿基變異數(shù)據(jù);含MALAT1rs619586的部分基因序列如SEQ:ID:NO:1所示;基因序列的第501個堿基R代表了A/G多態(tài),即為rs619586的多態(tài)性位點(diǎn);根據(jù)rs619586的具體序列和多態(tài)性堿基的位置采用Primer Premier 6.0設(shè)計出的最有上下游引物,正向引物序列如SEQ:ID:NO:2所示;

反向引物序列如SEQ:ID:NO:3所示,其中反向引物序列中倒數(shù)第4位堿基為C,錯配后PCR產(chǎn)物中多態(tài)附近序列由ACTGTC或GCTGTC更改為ACTGGC或GCTGGC,擴(kuò)增產(chǎn)物中A等位基因片段可被識別ACTGGN序列的限制性內(nèi)切酶BseNI識別,根據(jù)片段切開情況來判斷多態(tài)基因型;按照正向引物序列和反向引物序列合成引物,引物的合成采用固相合成法,或委托生物公司合成并檢測正向和反向引物。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用BseNI鑒定人乳腺癌MALAT1基因rs619586多態(tài)性的方法,其特征在于,步驟(b)中PCR擴(kuò)增反應(yīng)中制備PCR擴(kuò)增體系具體為:2×Taq PCR Mix 7.5μl,雙蒸水5.9μl,上游引物0.3μl下游引物0.3μl以及模板DNA1.0μl,充分混勻后即得15.0μl PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系;按照第一階段:94℃變性5min,第二階段共包括35個循環(huán)三個步驟,首先94℃變性30s,57.6℃退火45s,最后72℃延伸45s,第三階段:72℃延伸5min,最終4℃儲存以備用,即得長為154bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;擴(kuò)增后的產(chǎn)物序列如SEQ:ID:NO:4所示。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用BseNI鑒定人乳腺癌MALAT1基因rs619586多態(tài)性的方法,其特征在于,步驟(c)中進(jìn)行酶切的酶切體系具體為:PCR反應(yīng)產(chǎn)物5μl,限制性內(nèi)切酶0.5μl,Buffer1.0μl以及無核酸酶純水8.5μl共計15μl酶切體系,于水浴鍋中37℃酶切1~16h,即得酶切產(chǎn)物,選擇BseNI進(jìn)行酶切鑒定。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用BseNI鑒定人乳腺癌MALAT1基因rs619586多態(tài)性的方法,其特征在于,步驟(d)瓊脂糖凝膠電泳,確定基因多態(tài)性具體為:將酶切產(chǎn)物用3%的瓊脂糖凝膠在4~10V/cm的條件下,電泳20~40min,至紫外燈下能分清明顯的條帶后并拍照鑒定;對于不同的基因型,rs619586位點(diǎn)不同基因型展現(xiàn)出不同的條帶,野生基因型AA,長為134bp,20bp兩條帶;雜合基因型AG,長為154bp,134bp及20bp三條帶;雜合基因型GG,154bp一條帶。

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