本發(fā)明涉及EGF在篩選用于診斷或治療種植轉(zhuǎn)移癌的藥物中的用途，屬于醫(yī)學領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

卵巢癌(OC)是全美婦科排名第二的常見腫瘤及主要死亡原因之一。高死亡率主要是由于卵巢癌在早期(I/II)診斷困難，直至其擴散進展至晚期(III/IV)后方能確診。我們已報道過OC患者從I期到IV的確診率分別為7.19％、8.63％、72％和72.18％。OC患者的預(yù)后不良，各期OC患者五年平均生存率為42％。對III期和IV期患者的長期隨訪觀察后發(fā)現(xiàn)其五年生存率低于10％。但對于早期(I-II)確診的患者，特別是那些腫瘤局限于原發(fā)部分的患者，其五年生存率達92.7％。研究顯示OC患者5年生存率與10年前相比上升不到2％。廣泛腹腔和盆腔內(nèi)種植轉(zhuǎn)移是OC預(yù)后不良的主要原因，手術(shù)治療通常不能完全將這些病灶清除干凈。在這種情況下，對大多數(shù)OC患者來說腫瘤細胞減滅術(shù)成為最后的選擇。到目前為止尚沒有發(fā)現(xiàn)有效的特定靶向藥物對種植轉(zhuǎn)移有所療效，而現(xiàn)在用于OC的化療藥物極易誘發(fā)藥物耐藥性且治療后患者的長期預(yù)后并不理想，因此，弄清OC種植轉(zhuǎn)移的機制很有必要，其對于治療OC種植轉(zhuǎn)移靶向新藥物的研發(fā)以及提高OC患者生存率都至關(guān)重要。

腫物增大破入腹膜表面后腫瘤細胞從原位癌上脫落下來，隨著腹水在腹腔中進行轉(zhuǎn)運直至定植在腹腔中，這是目前對腹膜種植轉(zhuǎn)移現(xiàn)象最為普遍認同的解釋。許多研究認為種植轉(zhuǎn)移的過程分為如下幾個步驟：1)細胞脫落、存活及抵抗失巢凋亡；2)躲避免疫監(jiān)視；3)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化；4)球狀體形成；5)腹水形成以及6)腹膜種植。但是，自由脫落的腫瘤細胞在種植轉(zhuǎn)移環(huán)境中如何生存以及種植轉(zhuǎn)移初期球體形成的機制仍不清楚。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

一方面，本發(fā)明的目的在于通過小鼠原位卵巢癌模型揭示出OC種植轉(zhuǎn)移的相關(guān)機制，對腫瘤相關(guān)巨噬細胞(TAMs)在OC種植轉(zhuǎn)移中所起作用有一定新認識，從而提供阻斷腫瘤種植轉(zhuǎn)移的新靶點。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了EGF在篩選用于診斷或治療種植轉(zhuǎn)移癌的藥物中的用途。

作為對上述技術(shù)方案的進一步改進，所述種植轉(zhuǎn)移癌的種植轉(zhuǎn)移與巨噬細胞相關(guān)。

作為對上述技術(shù)方案的進一步改進，所述種植轉(zhuǎn)移癌為卵巢癌、胰腺癌或大腸癌。

作為對上述技術(shù)方案的進一步改進，所述藥物通過降低EGF水平、阻滯EGF的受體或阻斷EGF的下游信號來治療種植轉(zhuǎn)移癌。

作為對上述技術(shù)方案的進一步改進，所述阻斷EGF的下游信號通過抑制VEGF-C、阻滯VEGF-C的受體、抑制ICAM-1或抑制αMβ2整合蛋白來進行。

另一方面，本發(fā)明還提供了EGF抑制劑、EGF的受體阻滯藥或EGF的下游信號拮抗藥在制備用于治療種植轉(zhuǎn)移癌的藥物中的用途。

作為對上述技術(shù)方案的進一步改進，所述EGF抑制劑為EGF中和抗體或抑制EGF基因表達的siRNA。

作為對上述技術(shù)方案的進一步改進，所述EGF的受體阻滯藥為厄洛替尼、吉非替尼和西妥昔單抗中的至少一種。

作為對上述技術(shù)方案的進一步改進，所述EGF的下游信號拮抗藥為VEGF-C抑制劑、VEGFR-3受體阻滯藥、ICAM-1抑制劑、αMβ2整合蛋白抑制劑中的至少一種。

作為對上述技術(shù)方案的進一步改進，所述VEGF-C抑制劑為VEGF-C抗體；所述VEGFR-3受體阻滯藥為VEGFR3拮抗劑MAZ51；所述ICAM-1抑制劑為抗ICAM-1抗體；所述αMβ2整合蛋白抑制劑為αMβ2整合蛋白中和抗體。

需要說明的是，本發(fā)明中出現(xiàn)的中和抗體也即普通抗體，之所以稱為中和抗體主要從抗體的治療角度命名。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明表明了TAMs在卵巢癌種植轉(zhuǎn)移球狀體形成過程中起到必不可少的作用。TAM能分泌大量EGF從而激活周圍腫瘤細胞中的EGFR，激活的EGF/EGFR信號通路能上調(diào)VEGF-C，其反過來又上調(diào)整合蛋白和ICAM-1從而形成自分泌正反饋環(huán)路，從而促進腫瘤細胞增生、分化、粘附、形成球狀體及腹膜轉(zhuǎn)移，揭示出球狀體形成的關(guān)鍵機制，為抑制種植轉(zhuǎn)移提供了一種新策略以及改善OC患者的預(yù)后情況。

附圖說明

圖1顯示了巨噬細胞(TAMs)在原位卵巢癌模型中參與球體的形成；將穩(wěn)定表達mCherry熒光蛋白標記的ID8OCs植入8周大的tomato^lyz-cre受體小鼠體內(nèi)，在瘤細胞分別植入2，4，6及8周時檢測滲入腹腔的Cherry⁺腫瘤細胞和GFP⁺細胞；其中，A為顯示將腹腔細胞涂于切片上后置于熒光顯微鏡下觀察的熒光圖，每個時間點取n＝5只小鼠；B為對GFP⁺細胞總數(shù)進行量化，插圖為對從0到20天對GFP⁺細胞總數(shù)進行量化的統(tǒng)計圖，每個時間點取n＝5只小鼠；C為對Cherry⁺腫瘤細胞總數(shù)進行量化，插圖為0到20天對Cherry⁺腫瘤細胞總數(shù)進行量化的統(tǒng)計圖，每個時間點取n＝5只小鼠；D-G顯示巨噬細胞和球體形成，3至6周時的典型熒光圖像如D所示，圖E為對球體總數(shù)[球體/100μl腹水]的量化統(tǒng)計圖，圖F為對球體體積[細胞數(shù)/球體]的量化統(tǒng)計圖，每個時間點取n＝5只小鼠，已證實在3周時開始啟動球體形成；G為用APC(647nm)-結(jié)合型抗-CD68和DAPI對8周時采集的球體進行免疫染色后以共焦成像技術(shù)所得的圖像，對GFP⁺和CD68⁺巨噬細胞、Cherry⁺腫瘤細胞和DAPI進行細胞核染色后可見，右圖所示為融合后圖像，所有數(shù)據(jù)結(jié)果以均值±標準差形式表示,n＝5,星號*為P<0.05，星號**為P<0.01，星號***為P<0.001。

圖2顯示了M2型腫瘤相關(guān)巨噬細胞(TAMs)聚合與卵巢癌的進展相關(guān)；原位卵巢癌模型中F4/80⁺CD11b⁺巨噬細胞來自于指定時間(1,4和8周)點的單個細胞群或球體；A為用qRT-PCR技術(shù)對M1型特異性和M2型特異性的標志物進行檢測的統(tǒng)計圖，以外周血單核細胞作為對照，與1周內(nèi)單個細胞體內(nèi)的基因表達相比，所有數(shù)據(jù)結(jié)果以均值±標準差形式表示，n＝5，星號*為P<0.05，星號**為P<0.01，星號***為P<0.001(雙側(cè)t分布檢驗)；B-C為用FACS法對第1和8周個體細胞群內(nèi)CD163和CD206在巨噬細胞中的表達情況的統(tǒng)計分析結(jié)果圖，所有數(shù)據(jù)結(jié)果以均值±標準差形式表示,n＝5,星號*為P<0.05，星號**為P<0.01，星號***為P<0.001。

圖3顯示了腹腔球體形成及卵巢癌腫瘤細胞生長所必需；將小鼠ID8細胞注入C57BL/6雌性受體小鼠腹腔內(nèi)建立原位小鼠OC模型，然后小鼠分別予脂質(zhì)體(ID8組)或氯膦酸二鈉脂質(zhì)體(ID8+LC組)治療，一半供體小鼠接受了ID8細胞加上從患癌供體小鼠球體中分離出來的TAMs及脂質(zhì)體(ID8+TAM)或者氯膦酸二鈉脂質(zhì)體(ID8+TAM+LC)；A-D顯示氯膦酸二鈉脂質(zhì)體和TAM對腫瘤生長的效應(yīng)，A為在指定時間(0-60天)小鼠體重的增加曲線圖；B-C顯示在第60天時測量腹水體積和腫瘤凈重的統(tǒng)計結(jié)果圖，數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示,n＝10，星號***為P<0.001；D為監(jiān)測小鼠狀態(tài)對其生存率的量化統(tǒng)計圖，每組n＝24只小鼠，用對數(shù)秩和檢驗進行Kaplan-Meier分析，星號***為P<0.001；E-G顯示氯膦酸二鈉脂質(zhì)體和TAM對球體形成的影響作用，圖E為8周時從腹水中收集球體進行H&E染色圖，圖F為球體總數(shù)統(tǒng)計圖，圖G為球體大小統(tǒng)計圖；H-J顯示氯膦酸二鈉脂質(zhì)體和TAM對腫瘤細胞生長作用，H為采集8周時單個細胞群和球體，用抗-Ki67、抗-CD68和DAPI對其進行免疫染色后以共焦成像技術(shù)觀察的染色結(jié)果圖，H顯示在ID8組內(nèi)CD68⁺巨噬細胞被Ki67⁺腫瘤細胞包圍，而在ID8+LC組未見，比例尺為25μm；圖I為對單個細胞群總體和總的球體中Ki67⁺進量化的統(tǒng)計結(jié)果圖；圖J為對單個細胞群總體和總的球體中CD68⁺細胞進行量化的統(tǒng)計結(jié)果圖，n＝5只小鼠，每只小鼠提供10個球體，所有數(shù)據(jù)結(jié)果以均值±標準差形式表示,星號***為P<0.001(雙側(cè)t分布檢驗)。

圖4顯示TAMs中EGF與腫瘤細胞中EGFR表達相互上調(diào)對卵巢癌生長起到關(guān)鍵作用；A-C顯示TAMs促進體外ID8細胞增殖，當腫瘤細胞植入8周后從OC-模型小鼠體內(nèi)腹水中采集球體。將TAMs與ID8腫瘤細胞(PE-ID8)分離開，單獨培養(yǎng)PE-ID8細胞或者與TAMs在transwell中一起培養(yǎng)但不與其直接接觸，原始ID8細胞作為對照；A為在指定時間細胞總數(shù)的統(tǒng)計結(jié)果圖；B為細胞生長用Ki67染色后的染色結(jié)果圖，比例尺25μm；C為對Ki67⁺腫瘤細胞進行量化的統(tǒng)計結(jié)果圖，n＝9；D為qRT-PCR檢測PE-ID8以及球體中EGF,FGF,PDGFs,HGF及VEGFs的基因表達量的柱狀統(tǒng)計圖；E為TAMs中的EGF與PE-ID8細胞中的EGFR的表達情況統(tǒng)計圖，用qRT-PCR對TAMs及PE-ID8組中的EGF和EGFR基因表達進行檢測，外周血單核細胞和原始ID8腫瘤細胞分別作為對照組，相關(guān)基因表達呈現(xiàn)倍數(shù)增長，將單核細胞數(shù)作為1.0，n＝3；F為用EGF或EGFR對分離自O(shè)C小鼠腹水中的球體CD68細胞進行免疫染色的染色圖，n＝5只小鼠其球體的典型圖像如圖所示；G為ELISA檢測4周和8周腹水上清的EGF蛋白表達量的柱狀統(tǒng)計圖，血漿作為陰性對照；H為ELISA檢測腫瘤細胞、球體或腫瘤細胞加球體共培養(yǎng)的培養(yǎng)基上清中EGF蛋白表達水平的柱狀統(tǒng)計圖；I-J通過siRNAs使EGF沉默表達，TAMs被EGF siRNAs或參照siRNA轉(zhuǎn)染48小時，I為經(jīng)qRT-PCR法檢測TAMs中EGF mRNA水平的統(tǒng)計結(jié)果圖；J為用ELISA法檢測TAMs與ID8細胞共培養(yǎng)體系上清液中的EGF蛋白水平的統(tǒng)計結(jié)果圖；K-L顯示分別在無EGFR拮抗劑及存在拮抗劑(10或20μM)的情況下用EGF處理ID8細胞12小時，以相應(yīng)抗體通過蛋白質(zhì)印跡法對磷酸化的和總的EGFR以及ERK1/2進行檢測，總EGFR、ERK1/2和GAPDH均進行了檢測，對相對磷酸化水平進行了量化，K為蛋白質(zhì)印跡結(jié)果圖，L為統(tǒng)計結(jié)果圖；M-N顯示TAMs用參照siRNA或EGFsiRNA進行了預(yù)轉(zhuǎn)染，將PE-ID8細胞單獨或與TAMs在缺乏或存在EGF(20ng/ml)或EGFR拮抗劑(20μM)的情況下進行共培養(yǎng)12小時，圖M為用Ki67對增生的PE-ID8細胞進行染色的染色結(jié)果圖，比例尺100μm；圖N為對Ki67細胞進行量化的統(tǒng)計結(jié)果圖，所有試驗均進行了三組獨立實驗，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±SEM來表示，星號**為P<0.01，星號***為P<0.001。

圖5顯示OC患者EGF+TAMs及EGFR+腫瘤細胞與球體形成間的臨床相關(guān)性；A為對從OC患者中分離出來的原位腫瘤和球體進行H&E及CD68IHC染色的染色結(jié)果圖，比例尺分別為50μm(H&E)和25μm(CD68)；B為對OC患者原位腫瘤和球體中CD68陽性細胞的統(tǒng)計分析結(jié)果圖，n＝128，數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示，星號***為P<0.001(雙側(cè)t分布檢驗)；C-D顯示巨噬細胞和癌細胞在球體中生長的相關(guān)性；C為分別對人的小、中和大體積OC球體中CD68和Ki67進行免疫染色的染色結(jié)果圖，其中DAPI用于細胞核染色，比例尺5μm；D為對球體內(nèi)CD68和Ki67陽性細胞進行量化的統(tǒng)計結(jié)果圖，n＝30，小球體(0-50個細胞/球體)，中等細胞集群(50-500個細胞/球體)，大球體(≥500個細胞/球體)，數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，星號**為P<0.01,星號***為P<0.001,小體積球體與中、大體積球體相比較P<0.001(雙側(cè)t分布檢驗)；E為對OC患者腹水中的球體進行免疫熒光染色的熒光染色圖，采用EGF或EGFR與CD68聯(lián)合染色，來自n＝128例OC患者球體的典型圖像如圖所示，箭頭所指位置為球體中央的CD68+EGF+TAMs，比例尺,10μm；F為在不同分化程度的OC球體中其CD68+細胞的統(tǒng)計結(jié)果圖；G為128例OC患者球體中低(<14.5％)或高(≥14.5％)CD68⁺細胞百分比與總體存活率Kaplan-Meier曲線間關(guān)系圖(以對數(shù)秩和檢驗進行分析)。

圖6顯示在小鼠模型中阻斷EGFR減少球體形成、細胞增殖及卵巢癌生長；通過向雌性受體裸鼠腹腔內(nèi)注射人SKOV3 OCs建立起原位小鼠模型，接著對小鼠不做處理(CON)或予厄洛替尼進行治療，LC作為治療對照組；A-E顯示厄洛替尼對SKOV3腫瘤生長的影響；A為在相應(yīng)時間點監(jiān)測小鼠體重的統(tǒng)計結(jié)果圖，箭頭所指為使用LC治療的不同起始治療時間(在腫瘤細胞植入2,4或8周時)；B為在相應(yīng)時間點監(jiān)測小鼠體重的統(tǒng)計結(jié)果圖，箭頭所指為使用厄洛替尼治療的不同起始治療時間(在腫瘤細胞植入2,4或8周時)；C為CON、LC及厄洛替尼治療組小鼠的全身典型照片；D為14周時稱量小鼠腹水體積的統(tǒng)計結(jié)果圖；E為14周時稱量小鼠腫瘤凈重的統(tǒng)計結(jié)果圖；其中A-E中數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，每組中n＝10，星號***為P<0.001；ns:無顯著性差異；F為厄洛替尼組合對照組的總體存活率Kaplan-Meier曲線間關(guān)系圖；G-I顯示厄洛替尼對SKOV3球體形成的作用，G為14周時收集腹水中的球體并置于涂片上，對球體進行H&E染色的染色結(jié)果圖，比例尺100μm；H為對球體總數(shù)進行量化的統(tǒng)計結(jié)果圖；I為對球體體積進行量化的統(tǒng)計結(jié)果圖；J-K顯示厄洛替尼對SKOV3腫瘤細胞增殖的作用，對14周時采集的球體用抗-Ki67、抗-CD68和DAPI進行免疫染色，接著以共焦成像技術(shù)進行觀察；J為含有Ki67⁺腫瘤細胞和CD68⁺巨噬細胞球體的免疫熒光染色圖；K為對球體內(nèi)Ki67⁺和CD68⁺細胞進行量化的統(tǒng)計結(jié)果圖，n＝5只小鼠，每只小鼠中采集10個球體，數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示,星號***為P<0.001。

圖7顯示TAMs通過分泌EGF促進腫瘤細胞的遷移；A-B為ID8細胞在transwell小室單獨培養(yǎng)，或與小鼠單核細胞或與TAMs共培養(yǎng)，用劃痕實驗定量分析ID8細胞的遷移能力，A為腫瘤細胞遷移的代表性圖片，B為統(tǒng)計分析結(jié)果圖，n＝3，標尺100μm；C-D為ID8細胞在transwell小室單獨培養(yǎng)，或與小鼠單核細胞或與TAMs共培養(yǎng)，計數(shù)穿過transwell小室的細胞數(shù)來定量分析ID8細胞的遷移能力，C為對穿過transwell小室的腫瘤細胞進行蘇木素染色的染色圖，D為對細胞遷移數(shù)的統(tǒng)計分析結(jié)果圖，n＝3，標尺50μm；E-F為TAMs預(yù)轉(zhuǎn)染對照siRNA或EGF siRNAs 48小時后，進而將ID8細胞與轉(zhuǎn)染的TAMs細胞在transwell小室共培養(yǎng)，在PE-ID8培養(yǎng)液體系中加或不加EGF(20ng/ml)或EGFR抑制劑厄洛替尼(20μM)，E為對穿過transwell小室的腫瘤細胞進行蘇木素染色的染色結(jié)果圖，F(xiàn)為統(tǒng)計分析結(jié)果圖，標尺100μm，數(shù)據(jù)以平均值±標準誤表示，n＝3；星號***為P<0.001(雙尾t檢驗)。

圖8顯示在卵巢癌巨噬細胞中EGF上調(diào)VEGF-C-VEGFR3信號，A-B為實時定量qRT-PCR檢測從小鼠體內(nèi)分離的TAMs和PE-ID8腫瘤細胞中VEGF-C和VEGFR3的mRNA表達水平，A為VEGF-C的mRNA相對表達量統(tǒng)計結(jié)果圖，B為VEGFR3的mRNA相對表達量統(tǒng)計結(jié)果圖，以單核細胞的mRNA表達水平為1，其他組細胞的VEGF-C和VEGFR3的相對mRNA表達水平的倍數(shù)變化，n＝3；C為免疫蛋白印跡檢測ID8和PE-ID8細胞中VEGF-C、磷酸化的VEGFR3和總VEGFR3的蛋白水平的蛋白印跡圖，將采用或不用VEGF-C(20ng/ml)處理的淋巴血管內(nèi)皮細胞(LECs)作為陽性對照；D為定量分析VEGF-C和磷酸化的VEGFR3的蛋白相對表達量的柱形圖；E-F為小鼠ID8細胞和人SKOV3卵巢癌細胞用EGF(20ng/ml)處理不同時間(0-12h)，用實時定量qRT-PCR檢測兩組VEGF-C mRNA表達量的柱形圖，以未處理組的VEGF-C mRNA表達量為1，其他時間點VEGF-C mRNA表達量以倍數(shù)變化顯示；G-H為不同時間點時用EGF處理ID8細胞，G為對VEGF-C、磷酸化的VEGFR3和總VEGFR3蛋白水平進行檢測的蛋白印跡圖，H為對VEGF-C和磷酸化的VEGFR3的相對蛋白表達水平進行量化的統(tǒng)計結(jié)果圖；I為分別在EGFR拮抗劑(20uM)或ERK拮抗劑(PD98059，20uM)加入及缺失的情況下，用EGF對SKOV3細胞進行12小時的處理，I為用qRT-PCR方法對VEGF-C mRNA進行檢測的統(tǒng)計結(jié)果圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，若將未處理組結(jié)果作為1.0，以未處理組為標準來計算EGFR拮抗劑或ERK拮抗劑組的VEGF-C相對mRNA水平(以GADPH作為內(nèi)參)的倍數(shù)變化；J為分別在EGFR拮抗劑厄洛替尼(20uM)存在及缺失的情況下用EGF對ID8細胞處理12小時，對磷酸化的VEGFR3和總VEGFR3蛋白的蛋白印跡圖，以VEGF-C處理(濃度為20ng/ml，時間5分鐘)作為對照，所有數(shù)據(jù)以均值±標準誤表示,n＝3，星號***為P<0.001(雙側(cè)t檢驗)。

圖9顯示EGF通過自分泌VEGF-C/VEGFR3信號途徑促進EGFR+腫瘤細胞遷移；A為對OC小鼠腹水球體中的VEGF-C或VEGFR3與CD68進行免疫熒光染色的染色結(jié)果圖，來自n＝5只小鼠的球體典型圖像；B-C顯示PE-ID8細胞與EGF或VEGF-C(20ng/ml)分別在不加入或加入EGFR拮抗劑厄洛替尼或VEGFR3拮抗劑MAZ51(10nM)的情況下進行12小時的transwell遷移實驗；B為采用蘇木素染色的染色結(jié)果圖，比例尺150um；C為細胞遷移實驗的統(tǒng)計結(jié)果圖；D-F顯示從荷瘤tomato^lyzM-cre小鼠球體中分離出的小鼠GFP⁺F4/80⁺CD206⁺TAMs與參照-siRNA或EGF-siRNA進行48小時的預(yù)轉(zhuǎn)染，接著將TAMs與ID8細胞在厄洛替尼或MAZ51(20nM)存在的情況下于3D共培養(yǎng)體系中進行聯(lián)合培養(yǎng)，D為熒光結(jié)果圖，比例尺50um，可見局部GFP⁺細胞(TAMs)位于對照組球體中央但未見于siEGF組，E為48小時后對球體數(shù)量(每孔)進行量化的統(tǒng)計結(jié)果圖，F(xiàn)為48小時后對球體大小(面積)進行量化的統(tǒng)計結(jié)果圖；G-I顯示從人卵巢癌患者球體分離出的CD14⁺TAMs與參照-siRNA或EGF-siRNA進行了48小時的預(yù)轉(zhuǎn)染，用于與人OC SKOV3細胞進行3D共培養(yǎng)，G為熒光結(jié)果圖，比例尺為25um；H為對48小時的球體數(shù)量進行量化的統(tǒng)計結(jié)果圖；I為對48小時的球體體積進行量化的統(tǒng)計結(jié)果圖，所有試驗均進行了三次獨立實驗，數(shù)據(jù)以平均值±標準差的形式記錄,星號***為P<0.001。

圖10顯示CD11a、CD11b、CD11c及ITGβ2在TAMs的mRNA表達水平。在第8周從球體中分離出浸潤生長卵巢癌模型的TAMs和PE-ID8細胞，A為用qRT-PCR檢測TAMs以及PE-ID8細胞中的CD11a、CD11b、CD11c和ITGβ2整合蛋白的mRNA表達水平的統(tǒng)計結(jié)果圖，以原始ID8細胞作為對照，所有數(shù)據(jù)以平均值±標準誤的形式表示，n＝5,星號**為P<0.01，星號***為P<0.001(雙側(cè)t檢驗)；B為用FACS技術(shù)對腹腔內(nèi)CD11b+和CD11c+巨噬細胞進行分析的結(jié)果圖，C為分別對CD11b+和CD11c+細胞以百分比％進行統(tǒng)計的統(tǒng)計結(jié)果圖,n＝5,星號***為P<0.001，ns：無顯著性差異(雙側(cè)t檢驗)，所有實驗重復(fù)三次，數(shù)據(jù)以平均值±標準誤表示,星號**為P<0.01，星號***為P<0.001。

圖11顯示EGF/EGFR-VEGF-C/VEGFR3信號通路誘導球體ICAM-1表達，在指定時間(8周時)從球體中分離出浸潤生長卵巢癌模型的TAMs和PE-ID8細胞，A為用qRT-PCR檢測ICAM-1和ICAM-2的mRNA表達水平的統(tǒng)計結(jié)果圖，以外周血單核細胞作為對照，所有數(shù)據(jù)以平均值±標準誤表示，n＝5，星號**為P<0.01(雙側(cè)t檢驗)；B為用EGF處理ID8細胞不同時間，用qRT-PCR技術(shù)分析ICAM-1的mRNA表達水平的統(tǒng)計結(jié)果圖，進行三次獨立重復(fù)試驗，數(shù)據(jù)以平均值±標準誤表示，星號**為P<0.01，星號***為P<0.001(雙側(cè)t檢驗)；C-D為用EGF對ID8細胞處理不同時間，C為用免疫印跡方法檢測ICAM-1的蛋白表達的蛋白印跡圖，D為定量統(tǒng)計分析ICAM-1的蛋白表達水平的柱形圖；E-F為用VEGF-C對ID8細胞進行處理不同時間，E為用免疫印跡方法檢測ICAM-1的蛋白表達的免疫印跡圖，F(xiàn)為定量統(tǒng)計分析ICAM-1的蛋白表達水平的柱形圖，所有實驗重復(fù)三次，數(shù)據(jù)以平均值±標準誤，n＝3，星號***為P<0.001(雙側(cè)t檢驗)；G為分別在加入VEGFR3拮抗劑(MAZ51)及其缺失的情況下，用EGF或VEGF-C對ID8細胞進行24小時的處理，以qRT-PCR方法對ICAM-1的mRNA表達進行檢測并進行定量分析的柱形圖，所有實驗重復(fù)三次，數(shù)據(jù)以平均值±標準誤表示，星號**為P<0.01，星號***為P<0.001(雙側(cè)t檢驗)。

圖12顯示TAMs通過整合蛋白αMβ2與ICAM-1相互作用促進與EGFR+腫瘤細胞相黏附；A為對CD68以O(shè)C小鼠腹水球體中提取的ICAM-1進行免疫熒光染色的染色結(jié)果圖，來自n＝5只；B-C顯示PE-ID8細胞與EGF分別在缺乏或存在EGFR拮抗劑厄洛替尼或ERK拮抗劑PD98059(10nM)的情況下處理24小時，B為用免疫印跡法檢測ICAM-1蛋白表達的免疫印跡圖，C為對ICAM-1相對含量進行量化的統(tǒng)計結(jié)果圖；D-E顯示ID8細胞與EGF或VEGF-C分別在缺乏或存在MAZ51(VEGFR3拮抗劑)的情況下處理24小時，D為用免疫印跡法檢測ICAM-1蛋白表達的免疫印跡圖，E為對ICAM-1相對含量進行量化的統(tǒng)計結(jié)果圖；F-K顯示ICAM-1中和抗體對球體形成的影響，F(xiàn)-H為加入抗小鼠ICAM-1情況下對小鼠TAM–ID8進行3D共培養(yǎng)，F(xiàn)為免疫熒光結(jié)果圖，比例尺50μm；G為48小時后檢測球體數(shù)量的統(tǒng)計結(jié)果圖；H為48小時后檢測球體大小的統(tǒng)計結(jié)果圖；I-K為加入抗人ICAM-1情況下對人TAM-SKOV3進行3D共培養(yǎng)，I為免疫熒光結(jié)果圖，比例尺25μm；J為48小時后檢測球體的數(shù)量的統(tǒng)計結(jié)果圖；K為48小時后檢測球體的大小的統(tǒng)計結(jié)果圖，統(tǒng)計結(jié)果均進行3項獨立實驗，數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示，星號**為P<0.01，星號***為P<0.001；L-Q顯示通過給C57BL/6雌性受體小鼠腹腔內(nèi)注入小鼠ID8OCs細胞而建立原位小鼠模型，接著將小鼠予腹腔注入IgG或抗小鼠ICAM-1抗體治療，L為在指定時間(0-50天)測量小鼠體重增加情況的曲線圖；M為在指定時間(0-50天)測量小鼠腹水體積的統(tǒng)計結(jié)果圖；N為在指定時間(0-50天)測量小鼠腫瘤重量的統(tǒng)計結(jié)果圖；O為對球體進行H&E染色的染色結(jié)果圖；P為對球體的總數(shù)進行量化的統(tǒng)計結(jié)果圖；Q為對球體的大小進行量化的統(tǒng)計結(jié)果圖，數(shù)據(jù)以平均值±SEM形式表示,n＝10,星號***為P<0.001。

圖13顯示球體形成中TAM-腫瘤細胞相互作用模型，A為EGF、VEGF-C、ICAM-1、αMβ2相互作用調(diào)節(jié)的示意圖，顯示在OC種植轉(zhuǎn)移和腫瘤生長的早期，脫落的OC細胞誘導巨噬細胞浸潤到腹腔中，在腹腔環(huán)境下巨噬細胞與OC細胞相互作用形成球體同時誘導巨噬細胞為M2亞型腫瘤相關(guān)巨噬細胞(TAMs)，TAMs位于球體中央或許為OC逃避失巢凋亡提供了最初的基質(zhì)支持，重要的是，TAMs能分泌大量EGF從而激活EGFR，這會上調(diào)腫瘤細胞的表達，激活的EGF/EGFR信號通路能誘導VEGF-C表達，其反過來激活VEGFR3信號轉(zhuǎn)導通路和誘導腫瘤細胞內(nèi)整合蛋白/ICAM-1表達從而形成一個正向自分泌反饋環(huán)路，因而促進了腫瘤遷移、粘附和球體形成；B為TAMs和OC細胞分子間相互作用的示意圖。

具體實施方式

為更好的說明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點，下面將結(jié)合具體實施例及附圖對本發(fā)明作進一步說明。

實施例

1.材料與方法

1.1研究批準

所有動物實驗均由耶魯大學動物管理委員會機構(gòu)批準后進行。從知情同意患者提供的腹水中采集晚期(即III-IV期)卵巢癌患者的人腫瘤球體，以上完成于耶魯大學醫(yī)學院，紐黑文,康涅狄格州(HIC協(xié)議#1111003959)。臨床石蠟標本由中國哈爾濱醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院倫理審查委員會批準后使用。

1.2動物模型

所有動物實驗均由耶魯大學動物管理委員會批準后施行。所有的小鼠均為C57BL/6系列。溶菌酶Cre小鼠與tomato(mT/mG)小鼠進行雜交以便用譜系標記溶菌酶提取細胞。裸鼠購于Jackson實驗室。將細胞培養(yǎng)基上100ul小鼠卵巢癌ID8或人卵巢癌SKOV3細胞(1×10⁶/ml)注入到C57BL/6系小鼠或裸鼠的腹腔內(nèi)。小鼠體重增加、腹水體積和腫瘤重量變化情況均由電子天平稱量。9周后將小鼠處死，腫瘤球體和腫瘤移植物進行組織學分析。

1.3臨床樣本

經(jīng)資格審查委員會批準，2005年1月至2009年12月在哈爾濱醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院就診的共128例晚期上皮性卵巢癌(EOC)患者其中符合我們納入標準的入組我們的研究對象。納入合格標準包括如下幾方面:(1)病理檢查證實為III期EOC；(2)有完整的基本臨床資料；(3)癌癥尚未經(jīng)過任何治療；(4)未出現(xiàn)嚴重并發(fā)癥或其他惡性疾?。?5)告知病人及其家屬病情且在治療前簽署知情同意書。所有患者均進行了完整的腫瘤細胞減滅術(shù)治療。晚期(即III-IV期)卵巢癌患者的腫瘤球體通過自愿的形式從患者腹水中采集得到(HIC協(xié)議#1111003959)。

1.4細胞培養(yǎng)

ID8(小鼠卵巢癌上皮細胞株)來自Drs.Jack Lawler和哈佛醫(yī)學院貝斯以色列女執(zhí)事醫(yī)療中心的Carmelo Nucera的贈送，SKOV3(人卵巢腺癌細胞株)從ATCC取得。SK-OV-3對腫瘤壞死因子及幾種細胞毒藥物包括白喉毒素，順鉑和阿霉素等具有抵抗力。ID8和SKOV3細胞在達爾伯克氏改良伊格爾氏培養(yǎng)基(DMEM)(美國加利福利亞，生命科技公司)中培養(yǎng)，其中再加入10％小牛血清(FBS)、100U/mL青霉素以及100μg/mL的鏈霉素，保持溫度37℃并置于5％CO₂與95％空氣混合的濕潤環(huán)境中。每隔2天更換一次培養(yǎng)基，當80-90％的細胞發(fā)生融合時將其分離。所有試驗中，細胞以合理密度種植且在實驗開始進行前達到80-90％的細胞融合。C57BL/6系小鼠在不同時間點上予腹腔注入ID8細胞，此后從其腹腔中分離得到原代小鼠的腫瘤相關(guān)巨噬細胞(TAMs)和PE-ID8細胞。

1.5統(tǒng)計方法

Western-blot、qRT-PCR、細胞增殖實驗、免疫染色、FACS以及腫瘤生長均采用T檢驗分析。OC患者人口因素差異由卡方檢驗或Fisher’s精確檢驗進行統(tǒng)計分析。Kaplan-Meier法用于評估OS，同時，用單因素分析法的對數(shù)秩和檢驗校正預(yù)后因素間可能存在的差異。多變量Cox回歸(比例分析模型)用于確定預(yù)后和獨立因子CD68水平對OS。此項研究使用SAS軟件進行統(tǒng)計學分析(9.1.4版本，SAS軟件研究所，北卡羅萊納州，新喀里多尼亞)。所有統(tǒng)計檢驗均采用雙側(cè)檢驗同時以P值小于0.05認為有統(tǒng)計學意義。

1.6重組蛋白及拮抗劑

重組人和小鼠EGF、VEGF-C采購自R&D Systems。MAZ51(VEGFR3拮抗劑)購買于EMD Millipore公司。厄諾替尼(EGFR拮抗劑)從Roche公司購買。用于清除巨噬細胞的中性氯氟松氯膦酸二鈉脂質(zhì)體購自FormuMax Scientific公司(產(chǎn)品代碼#:F70101-N)。

1.7免疫染色

用于免疫組化和免疫熒光染色的抗體列于表一中。共聚焦顯微鏡圖像由Zeiss-LSM 700顯微鏡拍攝并由ZEN2010軟件進行處理。對于平均熒光強度的測量、共聚焦顯微鏡圖像分析由ImageJ軟件負責。細胞切片用蔡司Axiovert200熒光顯微鏡觀察(卡爾蔡司縮微成像；索恩伍德，紐約)，圖像由Openlab3軟件捕捉(Improvision,列克星敦,馬薩諸塞州)。在冰凍、OCT包埋的組織上進行5μm連續(xù)切片后將其置于-20℃條件下用丙酮固定10分鐘、干燥15分鐘。

表一 抗體信息表

1.8蛋白提取及蛋白質(zhì)印跡分析

將新鮮切割未固定的組織在裂解緩沖液中均質(zhì)化，裂解產(chǎn)物在4℃、13,000g條件下，離心10分鐘，收集上清液用Bradford蛋白濃度測定試劑盒(Bio-Rad公司,赫拉克勒斯,加利福利亞州)進行滴定。將細胞裂解物用SDS-PAGE分析，然后與特異性抗體一起以免疫印跡法處理(Immobilon P；Millipore公司,米爾福德,馬薩諸塞州)，最后以增強化學發(fā)光試劑盒(Amersham生命科學公司,阿靈頓高地,伊利諾伊州)進行檢測。所有用于蛋白免疫印跡法的抗體均在表一中列出。

1.9熒光激活細胞分離技術(shù)(FACS)

通過FACS分析小鼠細胞表面CD11b、F4/80，CD3e，CD206和CD163以及人細胞表面CD14和CD326的表達，此前已有文獻報道。將小鼠的TAMs混懸劑與小鼠CD11b-FITC，F(xiàn)4/80-PE，CD3e-APC，PE-CD206，APC-CD163和人CD14，CD326抗體在冰上短暫地混合15分鐘。同種抗體作為陰性對照。流式細胞術(shù)用FACSCalibur(BD生命科學)完成。數(shù)據(jù)用BD CellQuestPro軟件進行分析。所有用于FACS的抗體列于表一中。

1.10遷移實驗

使用transwell離體細胞培養(yǎng)系統(tǒng)(Corning公司，孔徑尺寸，0.3或8μm)對巨噬細胞和腫瘤細胞的遷移能力進行檢測，為了完成ID8細胞的驅(qū)化遷移實驗，將1x10⁴ID8細胞接種于transwell小室表面上。不同的化學趨化物(VEGFC或EGF)或巨噬細胞(TAM)置于小室下方位置。在12小時孵化期后，用棉簽拭去transwell膜上層的ID8細胞，在transwell膜底面的細胞用4％PFA進行固定后用蘇木素-伊紅染色，然后在顯微鏡(200X)下隨機選取5個視野進行遷移細胞的計數(shù)。

1.11定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)

所有從人體中提取的RNA使用RNeasy Plus Mini Kit(74134,Qiagen公司)，然后在生產(chǎn)商說明書指導下用High Capacity cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(4368814,Applied Biosystems公司)將其轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNAs。定量PCR使用RT2 SYBR Green(330500,SA Biosciences)試劑盒及CFX-96(Bio-Rad)儀器完成。qRT-PCR中用到的所有引物均在表二中列出。所有的值均以GAPDH的豐度進行標準化。數(shù)據(jù)以三組平均值±標準差的形式表示。

表二引物信息表

1.12TAM和ID8細胞3D共培養(yǎng)系統(tǒng)

小鼠F4/80⁺CD206⁺TAMs通過FACS從患癌供體tomato^lyzM-cre小鼠的球體中分揀而來，采集到晚期(即III-IV期)卵巢癌患者的人腫瘤球體后(IHC協(xié)議#1111003959)，接著用FACS鑒定和分揀出CD14+TAMs。如上所述在24孔板上鋪基質(zhì)膠，TAMs和ID8cells(比例為1:10但細胞總數(shù)固定為40,000細胞/孔)的混合物直接接種在鋪滿基質(zhì)膠的24孔板上。細胞在37℃下培養(yǎng)48小時保證聚合物/球體的形成。在共培養(yǎng)6小時后加入EGFR拮抗劑厄洛替尼、VEGFR3拮抗劑MAZ51(每次20nM)或抗-ICAM-1抗體(20ug/ml)。從6-48小時拍攝熒光顯微圖像進行形態(tài)學分析。沒有細胞的小孔含有培養(yǎng)基作為實驗的陰性對照。所有實驗至少做3次且每次要做三份。使用蔡司Axiovert 200熒光顯微鏡(卡爾蔡司微縮成像；索恩伍德，紐約)觀察所有顯微鏡圖像，圖像由Openlab3軟件捕捉(Improvision,列克星敦,馬薩諸塞州)。

2.結(jié)論

2.1巨噬細胞在卵巢癌生長過程中參與球體形成

為了確定巨噬細胞是否在種植轉(zhuǎn)移過程中參與OC腫瘤細胞的存活、增殖以及定植等環(huán)節(jié)，本申請人將小鼠ID8細胞注入C57BL/6雌性受體小鼠腹腔內(nèi)從而建立原位小鼠OC模型；為了追蹤觀察這段時期內(nèi)癌細胞及受體小鼠的單核/巨噬細胞情況，將ID8OC細胞以穩(wěn)定表達的mCherry熒光蛋白進行標記，與此同時，將作為受體小鼠的tomato^lyzM-cre小鼠體內(nèi)包括巨噬細胞在內(nèi)的髓細胞以綠色熒光蛋白進行標記(GFP)。

結(jié)果如圖1的A-B所示，處于基礎(chǔ)狀態(tài)下(在腫瘤細胞注入前)或在腫瘤細胞注入早期時間段內(nèi)(<1周)的受體tomato^lyzM-cre小鼠腹腔內(nèi)幾乎不能檢測出GFP⁺細胞，但是，在注入瘤細胞后的第2、4、6及8周時滲入腹腔內(nèi)的GFP⁺細胞有了大幅增加，在2、4、6及8周時GFP⁺細胞總數(shù)分別為3×10⁶、16×10⁶、18×10⁶及20×10⁶。

如圖1中C-D所示，我們亦在晚期(6周)腹水中檢測到CD11b⁺Gr1⁺髓源性抑制細胞(MDSCs)的數(shù)量有所增加，這組原位卵巢癌模型中，注入的癌細胞首先進入休眠期(0-2周)隨后進入快速增長期(在癌細胞注入2-8周時)(如圖1C)，酷似人卵巢癌的II-III期。有趣的是，我們觀察到在注入瘤細胞的最初2小時至2周時間內(nèi)腹膜內(nèi)腫瘤細胞數(shù)量有所減少，可能為失巢凋亡所致。

如圖1中D-F所示，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)球體包含GFP⁺巨噬細胞與mCherry腫瘤細胞，二者比例為1:10；球體數(shù)量與體積隨腫瘤生長而增加。有趣的是，如圖1G所示，球體切面免疫染色顯示大球體內(nèi)的mCherry腫瘤細胞圍繞在位于球體中心位置的GFP⁺CD68⁺巨噬細胞周圍，在CD11b⁺Gr1⁺MDSCs中得到同樣的結(jié)果。

以上結(jié)果均提示髓系細胞和ID8細胞的相互作用促進卵巢癌種植轉(zhuǎn)移過程中球體的形成。

2.2M2型腫瘤相關(guān)巨噬細胞(TAMs)聚合與卵巢癌的進展相關(guān)

在將瘤細胞注入小鼠體內(nèi)2小時后我們在其腹腔內(nèi)發(fā)現(xiàn)了巨噬細胞，但巨噬細胞似乎在瘤細胞進入機體3周形成巨噬細胞-腫瘤球體后才能促進腫瘤細胞的生長，此前有報道在體內(nèi)外環(huán)境下卵巢癌細胞都將巨噬細胞極化為M2型，我們推測巨噬細胞在球體形成期與初始期相比有不同的基因表達譜和表現(xiàn)型。為了證明這點，我們采集卵巢癌不同生長階段(瘤細胞注入1,4和8周時)的F4/80⁺CD11b⁺巨噬細胞，通過qRT-PCR檢測一組M1型-特異標志物和M2型-特異標志物，將外周血單核細胞作為對照組。

結(jié)果顯示最初由腫瘤細胞誘導產(chǎn)生的浸潤性巨噬細胞(1周時)大量表達M1樣標記基因(Ly6G/C,CCR2,IFNαR,iNOS)，但這些標志物在4周后消失不見。但是，浸潤性巨噬細胞在腫瘤進展過程中(4-8周時)逐漸獲得表達M2型標記基因[CD206(甘露糖受體),CX3CR1，精氨酸酶1和CD163(清道夫受體富含半胱氨酸1型蛋白質(zhì)M130)]的能力。顯然，如圖2A所示，無論是單個還是球體相關(guān)性巨噬細胞在末期(8周時)均有相似的基因表達譜；如圖2B、2C所示，F(xiàn)ACS分析確定了早期CCR2⁺和晚期CD163⁺,CD206⁺及CX3CR1⁺腫瘤誘導的巨噬細胞不同的表達方式。

以上結(jié)果表明在卵巢癌進展過程中TAMs在腹腔微環(huán)境下極化為M2亞型。

2.3TAMs為腹腔球體形成及卵巢癌腫瘤細胞生長所必需

為了探討TAMs在卵巢癌種植轉(zhuǎn)移過程中所起作用，我們用氯膦酸二鈉脂質(zhì)體對荷瘤小鼠進行處理。如圖3A-C所示，表型分析顯示氯膦酸二鈉脂質(zhì)體明顯減少小鼠體重、腹水體積以及從腹水中分離出來的腫瘤細胞濕重，因此，經(jīng)過氯膦酸鹽治療的小鼠生存率大大提高(圖3D)，尤其是氯膦酸鹽組的球體數(shù)量及平均大小與脂質(zhì)體組相比都明顯減少(圖3，E-G)，進一步研究表明球體中Ki67⁺是圍繞在CD68⁺TAMs周圍的腫瘤細胞，經(jīng)過氯膦酸鹽治療后CD68⁺TAMs和Ki67⁺細胞數(shù)量均有減少(圖3，H-J)。

進而我們對TAMs能否促進球體形成及卵巢癌進展進行了直接檢測。為達到目的，將從供體患癌小鼠球體中分離出的F4/80⁺CD206⁺M2 TAMs(1×10⁶)與ID8細胞(1×10⁶)一起注入新的受體小鼠腹腔中，受體小鼠以脂質(zhì)體或氯磷酸二鈉脂質(zhì)體治療，注入TAMs或ID8細胞作為對照組。單獨注入TAMs不引起腫瘤，說明分離的為純粹未受ID8污染的TAMs細胞。TAMs⁺ID8組與ID8組相比，前者明顯增大腫瘤體積、增加腹水以及腫瘤濕重。但是，氯膦酸二鈉脂質(zhì)體治療組與TAM⁺ID8相比而言，前者體重、腹水以及腫瘤質(zhì)量的增加不及后者，甚至低于ID8組(圖3，A-C)。以上數(shù)據(jù)說明磷酸二鈉脂質(zhì)體能削弱內(nèi)外源性TAMs對卵巢癌生長的影響。TAMs同時也縮短了荷瘤小鼠的存活時間，但氯膦酸二鈉脂質(zhì)體卻能將時間延長(圖3D)。此外，TAMs明顯增加球體的數(shù)量和體積、球體內(nèi)CD68⁺巨噬細胞和Ki67⁺腫瘤細胞但磷酸鈉鹽能削弱上述作用(圖3，E-G)。TAMs同樣增加粘附或圍繞在球體內(nèi)CD68⁺巨噬細胞周圍的Ki67+腫瘤細胞數(shù)量。但是，氯膦酸鹽治療能減少Ki67⁺細胞以及CD68⁺巨噬細胞的數(shù)量(圖3，H-J)。

以上結(jié)果說明，巨噬細胞為卵巢癌腹腔內(nèi)球體形成和細胞增殖所必需。

2.4TAMs中EGF與腫瘤細胞中EGFR表達相互上調(diào)對卵巢癌生長起到關(guān)鍵作用

為了研究TAMs促進OC增殖的分子機制，我們通過transwell實驗測定F4/80⁺CD206⁺M2 TAMs對分離自腹腔中球體ID8細胞(PE-ID8)的作用效應(yīng)，實驗過程中巨噬細胞和腫瘤細胞沒有直接接觸。體外已培育好的ID8OC細胞(原始ID8)作為對照組。如圖4A所示，雖然F4/80⁺CD206⁺TAMs對原始ID8細胞僅有微弱作用，計算細胞總數(shù)后發(fā)現(xiàn)F4/80⁺CD206⁺TAMs明顯增加PE-ID8細胞生長。使用Ki67免疫染色發(fā)現(xiàn)F4/80⁺CD206⁺TAMs促進腫瘤細胞增殖(圖4，B-C)。

我們推斷球體內(nèi)TAMs提供生長因子EGF促進球體形成和腫瘤細胞增殖。因而我們采用定量RT-PCR法對從腹腔中提取的TAMs和ID8(PE-ID8)癌細胞內(nèi)的多種生長因子表達方式進行篩選。發(fā)現(xiàn)僅僅EGF能在TAMs中被檢測到，而其他生長因子如FGFs,HGF,IGF,TNF-α,TGF-β或VEGFs卻不能(圖4D)。通過定量RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)EGF在球體源性的F4/80⁺CD206⁺TAMs而非球體源性的PE-ID8中大量表達。相反，EGFR在球體源性PE-ID8細胞中高表達，而非TAMs內(nèi)(圖4E)。對球體免疫染色發(fā)現(xiàn)在TAMs中能特異性檢測到被EGFR⁺腫瘤細胞包圍的EGF(圖4F)。的確，ELISA法檢測發(fā)現(xiàn)腹水中分泌型EGF與血漿中EGF相比保持在較高濃度(圖4G)。與qRT-PCR得出的結(jié)果一致，在培養(yǎng)球體源性PE-ID8的上清液中未檢測到EGF。EGF在F4/80⁺CD206⁺TAMs的上清液中檢測到，并且通過與ID8腫瘤細胞共培養(yǎng)后數(shù)量明顯增加(圖4H)。

接下來我們對F4/80⁺CD206⁺TAMs是否通過EGF–EGFR軸促進PE-ID8腫瘤細胞增殖進行測定。為此，用siRNAs降解EGF在TAMs中的表達，相反PE-ID8中的EGFR信號轉(zhuǎn)導通路用EGFR拮抗劑厄洛替尼阻斷。通過兩套siRNAs使TAMs中的EGF基因表達沉默并用qRT-PCR和ELASA法檢驗核實(圖4,I-J)。通過EGFR和ERK1/2的磷酸化作用驗證厄洛替尼對ID8細胞內(nèi)EGF–EGFR信號通路的作用(圖4,K-L。重要的是,無論是使TAMs中的EGF沉默表達還是用厄洛替尼對ID8進行治療都能完全鈍化TAMs刺激的PE-ID8腫瘤細胞增殖(圖4，M-N)。

2.5OC患者EGF+TAMs及EGFR+腫瘤細胞與球體形成間的臨床相關(guān)性

為了探討我們所觀察到的球體形成與EGF⁺TAMs和OC患者體內(nèi)存在的EGFR⁺腫瘤細胞有關(guān)，我們對128例從OC患者腹水中提取的球體進行了檢測。對CD68進行IHC染色顯示巨噬細胞幾乎出現(xiàn)在我們采集的所有球體中。此外，球體中巨噬細胞的數(shù)量明顯多于原位癌中巨噬細胞的數(shù)量(圖5,A-B)。與小鼠模型相似，大部分CD68⁺巨噬細胞采集自球體中心(圖5C)，說明巨噬細胞在OC種植轉(zhuǎn)移中球體初始形成過程中起重要作用。對從腹水不同大小(小,中和大)球體中分離得到的CD68和Ki67進行染色，它們?yōu)榫奘杉毎驮鲋臣毎臉擞浳铮l(fā)現(xiàn)TAMs和增生腫瘤細胞間呈明顯正相關(guān)性(圖5，C-D)。

為了解卵巢癌中TAM相關(guān)球體和臨床病理間可能存在的聯(lián)系，我們對128例高、中、低組織分化的OC患者球體中TAMs所占百分比進行了分析。OC患者球體中CD68⁺細胞數(shù)量與淋巴血管侵犯(LVI；p＝0.013)、腹水體積(p＝0.009)以及血清癌胚抗原125(CA-125:一種女性卵巢癌早期標志物與疾病發(fā)生風險有較高相關(guān)性)(p＝0.0043)呈正相關(guān)性。對高、中、低分化OC患者球體中的CD68陽性細胞進行量化可看出：從高到低分化球體中其CD68陽性細胞百分比明顯增加，說明與高分化OC相比低分化OC在球體形成中能吸引更多的巨噬細胞(圖5，E-F)。生存分析顯示球體中CD68陽性細胞占較高百分比(>14.5％)的患者其5年總體生存率(OS)明顯低于CD68陽性細胞占較低百分比(<14.5％)的患者(圖5G)。

2.6在小鼠模型中阻斷EGFR減少球體形成及卵巢癌生長

考慮到球體形成與EGF⁺TAMs和EGFR⁺腫瘤細胞的相互作用有關(guān)，這在小鼠模型和人OC患者中皆如此，我們對EGFR阻滯劑能否阻斷球體形成和腫瘤生長進行檢測。厄洛替尼(EGFR阻滯劑)抑制大多數(shù)卵巢癌細胞系生長，與其相反，吉非替尼和西妥昔單抗則抑制部分卵巢癌細胞系。我們選擇厄洛替尼來說明EGFR在卵巢癌種植轉(zhuǎn)移過程中所起的作用。為此,我們首先在上述ID8模型和異種移植小鼠模型中驗證了厄洛替尼對OC進展的作用情況，異種移植即SKOV3人OCs經(jīng)腹腔注入雌性受體小鼠模型中所得，厄洛替尼與腫瘤細胞一起注入受體小鼠腹腔內(nèi)。類似同系小鼠模型，用氯膦酸二鈉脂質(zhì)體(LC)清除TAMs后人OC的生長速度明顯減慢。此外，與晚期(4-8周)注射LC相比而言早期予LC治療(腫瘤細胞植入2周后)時其對腫瘤生長的抑制作用更為顯著(圖6A)。與LC類似，早期注射EGFR阻滯劑厄洛替尼對徹底鈍化卵巢癌生長有更好效果(圖6B)。兩組小鼠模型中厄洛替尼治療組與未治療組相比，前者腹水體積和腫瘤重量明顯減少同時伴隨著生存率的提高(圖6,C-F)。我們進一步分析厄洛替尼治療組的球體形成、癌細胞增殖以及卵巢癌進展情況。接受厄洛替尼治療的小鼠組其球體數(shù)量和體積均明顯減少(圖6,G-I)。厄洛替尼能大幅減少游離或在球體中TAMs與Ki67⁺增殖型癌細胞的總數(shù)(圖6,J-K)。這些結(jié)果說明TAM分泌的EGF在卵巢癌早期種植轉(zhuǎn)移球體的形成、癌細胞增殖以及腫瘤生長等方面起到重要作用。

2.7EGF通過VEGF-C/VEGFR3信號途徑促進EGFR+腫瘤細胞遷移和腫瘤-TAM球體形成

接下來我們對TAMs產(chǎn)生的EGF如何介導球體形成進行實驗，EGF對最初OC的生長是必不可少的。數(shù)據(jù)顯示TAMs位于細胞群中央，OC模型中EGFR抑制劑厄洛替尼能明顯減少球體的數(shù)量和體積?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)，我們作出TAMs分泌型EGF介導腫瘤細胞向TAMs遷移和黏附的假設(shè)，這是球體形成的先決條件之一。為了搞清楚TAMs促進OC遷移的分子機制，我們分別用劃痕法和transwell法檢測F4/80⁺CD206⁺TAMs對腹腔中球體(PE-ID8)分離的ID8細胞作用。F4/80⁺CD206⁺TAMs,而非單核細胞，在兩組實驗中均明顯促進PE-ID8細胞遷移(圖7,A-D)。但是，當TAMs中EGF基因沉默表達或ID8接受厄洛替尼治療后，TAMs刺激下的腫瘤遷移效應(yīng)將變遲鈍(圖7,E-F)。這些結(jié)果表明TAMs中EGF與腫瘤細胞中EGFR表達相互上調(diào)在TAMs促使的卵巢腫瘤細胞遷移中起關(guān)鍵作用。

有報道稱VEGF-C/VEGFR3信號轉(zhuǎn)導通路在肺癌模型中促進腫瘤細胞遷移。我們發(fā)現(xiàn)在ID8細胞中VEGFR3處于較高水平。有趣的是，我們在腹腔源性的ID8(PE-ID8)中檢測到VEGF-C，而在原始ID8細胞或TAMs中卻沒有此發(fā)現(xiàn)(圖8，A-B)。進一步免疫染色結(jié)果顯示VEGF-C和VEGFR3在ID8腫瘤細胞中高表達而在球體TAMs中卻沒有(圖9A)。免疫印跡分析法顯示PE-ID8與未活化的ID8細胞相比，前者細胞內(nèi)VEGF-C和磷酸化VEGFR3水平增加(圖8,C-D)。我們推測EGF誘導VEGF-C表達，其反過來又激活瘤細胞中的VEGFR3。的確，經(jīng)過EGF治療8周或更長時間后，經(jīng)qRT-PCR(附圖8,E-F)和蛋白印跡法(圖8,G-H)檢測后發(fā)現(xiàn)小鼠ID8和人SKOV3 OC細胞中的VEGF-C水平明顯增加；這種誘導能被EGFR阻滯劑或ERK/2阻滯劑所阻斷(圖8，I)。一如既往的，經(jīng)過EGF或VEGF-C治療能使VEGFR3磷酸化，這種活化作用被EGFR拮抗劑厄洛替尼或VEGFR3拮抗劑MAZ51所阻斷。但是，由VEGF-C誘發(fā)的VEGFR3激活卻不能被EGFR阻滯劑阻斷(圖8，J)，說明EGF/EGFR信號轉(zhuǎn)導通路于VEGF-C/VEGFR3信號通路上游發(fā)揮作用。在功能上，EGF和VEGF-C均能促進ID8細胞轉(zhuǎn)移，這與信號轉(zhuǎn)導結(jié)果一致，VEGFR3拮抗劑阻斷EGF和VEGF-C-誘導的ID8細胞遷移(圖9,B-C)。這些結(jié)果說明EGF–EGFR–VEGF-C–VEGFR3信號旁路在調(diào)劑OC細胞遷移中起到關(guān)鍵作用。

最后，我們確定了TAMs怎樣促進球體形成。為此，我們通過標準3D共培養(yǎng)系統(tǒng)建立起一個體外球體試驗，人CD14+TAMs和從患癌供體tomato^lyz-cre小鼠球體中分離出的GFP⁺F4/80⁺CD206⁺TAMs與ID8細胞在含有2％基質(zhì)膠的培養(yǎng)基中混合(TAM:ID8比例為1:10)接著接種到鋪有基質(zhì)膠的24孔培養(yǎng)板上。在這個模型中，48小時共培養(yǎng)后我們檢測到球體形成。為確定腫瘤細胞遷移是否需要球體形成，我們在3D共培養(yǎng)體系中對TAMs內(nèi)EGF siRNA以及球體EGFR或VEGFR3特異型拮抗劑效應(yīng)進行了檢驗。在小鼠細胞3D共培養(yǎng)系統(tǒng)中，EGF基因在TAMs中沉默表達以及阻斷EGFR或VEGF-C/VEGFR3信號通路都能大幅度減少球體體積和數(shù)量(圖9,D-F)。更重要的是，人OC患者中分離出的TAMs與SKOV3細胞在3D共培養(yǎng)體系下進行實驗(圖9,G-I)，得出了類似結(jié)果。我們在人和小鼠細胞進行EGF siRNA，檢測到散在分布有活性的TAMs和小型腫瘤細胞群(圖9,D和G),說明TAMs與腫瘤細胞間的聯(lián)系通過抑制EGF/EGFR和VEGF-C/VEGFR3信號通路而被阻斷。

2.8EGF通過ICAM-1-αMβ1整合蛋白的相互作用促進EGFR+腫瘤細胞與TAMs相互黏附

我們推測腫瘤細胞與TAM相互黏附是球狀體形成的必須前提。有報道指出球狀體中的TAMs提供整合蛋白促進其與腫瘤細胞間的黏附。因此我們通過熒光定量PCR技術(shù)對從腹腔中分離出的ID8卵巢癌細胞(PE-ID8)和TAMs中的多種整合蛋白表達方式進行了篩選。不出所料，我們發(fā)現(xiàn)整合蛋白αM(也稱為CD11b)及β2在球狀體相關(guān)的F4/80⁺CD206⁺TAMs中高表達，而非在腫瘤細胞內(nèi)(圖10A)。FACS分析顯示CD11b以及CD11c同樣在TAM高表達(圖10B-C)。眾所周知巨噬細胞在靠近炎性組織的過程中通過Mac-1(由整合蛋白αMβ2形成)結(jié)合到血管內(nèi)皮細胞上的細胞黏附分子-1(ICAM-1)或ICAM-2上。我們檢測ICAM-1及ICAM-2在球狀體內(nèi)的表達后發(fā)現(xiàn)了ICAM-1，但不是ICAM-2，通過qRT-PCR檢測后發(fā)現(xiàn)ICAM-1在球狀體內(nèi)高表達(圖11A)。接下來我們通過免疫染色技術(shù)確定究竟是哪種類型的細胞在球狀體內(nèi)表達ICAM-1。令我們驚訝的是，ICAM-1并非在TAMs里而是在ID8腫瘤細胞中高表達(圖12A)。.ICAM-1在原始ID8細胞中的基線表達水平是非常低的，但在EGF作用下無論是mRNA還是蛋白質(zhì)水平均大幅度上調(diào)(圖11B-D)。EGFR-或ERK1/2阻滯劑能阻止EGF誘導的ICAM-1表達(圖12，B-C)。有趣的是，EGF誘導的ICAM-1表達也能通過VEGFR3阻滯劑而被阻斷。VEGF-C誘導的ICAM-1在ID8細胞中的表達是相一致的(圖12，D-E)。

此后我們對TAMs上的整合蛋白αMβ2和腫瘤細胞上的ICAM-1間相互作用是否對初始球體形成起關(guān)鍵作用進行了檢測。為此，我們測定了ICAM-1中和抗體在3D球體形成實驗中的作用，ICAM-1中和抗體顯著減少小鼠(圖12,F-H)和人細胞(圖12,I-K)在3D共培養(yǎng)體系中球體的數(shù)量和體積，但作為參照的IgGs卻沒有此現(xiàn)象。值得注意的是，抗-ICAM-1抗體對球體的作用影響比起使EGF基因沉默表達或阻斷EGFR/VEGFR3傳導通路更為深刻，說明TAM–腫瘤細胞聯(lián)合是球體形成中早期的一步。為了探求ICAM-1中和抗體在卵巢癌治療中的效果，在已建立的原位小鼠模型中，ID8荷瘤小鼠予抗-ICAM-1抗體或作為對照的IgGs進行治療。表型分析顯示抗-ICAM-1抗體組明顯減少小鼠體重、腹水體積和從腹水中分離得到的腫瘤細胞濕重(圖12,L-N)。與EGFR阻滯劑效果類似，抗-ICAM-1抗體明顯減少球體的數(shù)量和體積(圖12，O-Q)。這些結(jié)果說明整合蛋白-ICAM-1介導的TAM-腫瘤聯(lián)合在球體形成和卵巢癌種植轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用。

3.結(jié)論分析

種植(腹腔)轉(zhuǎn)移幾乎發(fā)生在所有OC患者身上(超過90％)，尤其常見于晚期癌癥患者并由此導致死亡。種植轉(zhuǎn)移亦發(fā)生于其他許多癌癥如胰腺癌(50％)及大腸癌(32％)。因此，研究種植轉(zhuǎn)移的共同機制對提高OC以及其他種植轉(zhuǎn)移癌患者的預(yù)后至關(guān)重要。考慮到腹膜有其獨特的特點譬如空間較大、無血管或淋巴管道。脫落OC細胞怎樣得到必需的基質(zhì)供養(yǎng)而避免失巢凋亡現(xiàn)象的發(fā)生、其避免免疫細胞攻擊的適度保護機制以及哪些特異性生長因子能維持他們迅速生長及著床目前仍未研究清楚。曾有報道OC細胞能激活細胞存活通路如活化RAB25從而獲得貼壁依賴性生存能力同時上調(diào)表面免疫抑制分子(如B7-H4及補體C1抑制物)來躲避免疫系統(tǒng)的攻擊(如T細胞或補體)。球狀體形成是OC腹膜種植轉(zhuǎn)移得以啟動的另一基本步驟。但是，關(guān)于球狀體形成的詳細機制尚不明確。通過對128例III期OC患者腹水中分離的組成球狀體的細胞成分進行分析，我們發(fā)現(xiàn)巨噬細胞存在于所有球狀體中。我們還觀察到從腹水中分離的球狀體中所含巨噬細胞數(shù)目顯著多于原發(fā)腫瘤中的巨噬細胞數(shù)量。另外，我們發(fā)現(xiàn)巨噬細胞數(shù)量與其在球狀體內(nèi)的增生呈正相關(guān)，但與OC患者的預(yù)后呈負相關(guān)。我們的結(jié)果顯示球狀體相關(guān)TAMs也許在人類OC進展中起到重要作用。

TAMs在實體瘤中能通過分泌促血管新生因子和化學誘導物來促進腫瘤血管形成以及癌癥轉(zhuǎn)移，TAMs亦能分泌細胞因子促進腫瘤轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成。巨噬細胞在OC中所起作用在此前建立的小鼠模型中已進行過研究。Toni等報道腹腔內(nèi)炎癥擴散時卵巢癌腹膜轉(zhuǎn)移的危險性將增加；消耗掉腹膜巨噬細胞，但不包括中性粒及自然殺傷細胞，能減少腹膜種植轉(zhuǎn)移發(fā)生的機率。這些結(jié)果與我們從人體樣本上觀察到的結(jié)果均提示我們做出一種假設(shè)：巨噬細胞在腹膜轉(zhuǎn)移發(fā)生前球狀體形成過程中起到至關(guān)重要的作用。人及小鼠的OC樣本中TAMs均位于球狀體中央(圖13A：TAM-癌細胞在球狀體內(nèi)相互作用模型一例)，這一有趣發(fā)現(xiàn)大力支持了我們的假設(shè)。我們進一步提供有力證據(jù)表明TAMs在球狀體形成起始步驟中必不可少。在使用GFP轉(zhuǎn)基因受體小鼠建立的OC原位癌模型中，我們觀察到滲入腹腔的巨噬細胞約有80％出現(xiàn)在球體中。當TAMs使用氯膦酸鹽療法后球體細胞的大小和數(shù)目顯著減少，反過來，腹腔定植被抑制存活時間延長。相反，當孤立的TAMs注入小鼠腹腔內(nèi)后球體的體積與數(shù)量有明顯增加。有趣的是，滲入腹腔中的巨噬細胞逐漸獲得M2樣表現(xiàn)型。

在OC小鼠模型中，我們觀察到在種植轉(zhuǎn)移發(fā)生后3周內(nèi)腫瘤細胞數(shù)目的增長與腫瘤球狀體形成有關(guān)。的確，在小鼠及人OC樣本中觀察到TAM相關(guān)球狀體能促進腫瘤細胞的增生。另外，體外transwell試驗中發(fā)現(xiàn)TAMs能直接促進腫瘤細胞增殖，表明TAMs通過釋放某些調(diào)節(jié)因子來調(diào)控腫瘤的生長。通過篩選TAMs和球體相關(guān)腫瘤細胞內(nèi)的一組生長因子及它們的同源受體，我們已確認EGF/EGFR調(diào)控通路對TAM刺激下的OC增生和腫瘤進展有至關(guān)重要的作用。前期研究已報道EGFR在腹腔內(nèi)游離腫瘤細胞內(nèi)的表達和定腫瘤細胞內(nèi)相比明顯增加，說明EGFR通路在腹腔游離腫瘤細胞內(nèi)起到重要作用。眾所知周，卵巢癌患者腹腔內(nèi)腹水中有大量巨噬細胞和T淋巴細胞。此外，有報道稱來自巨噬細胞的EGF能促進乳腺癌細胞的侵襲性。我們的研究清楚的說明TAM是EGF的主要來源，其誘導EGFR陽性的OC增殖，這已在體外及小鼠模型中通過EGF基因沉默和EGFR阻滯劑得以證實。腹腔微環(huán)境下EGF在TAM中是如何被調(diào)控的尚待進一步研究。TAM-OC細胞在球體內(nèi)的相互作用很有可能增加了EGF的表達。同樣地，從腹水中分離出來的球體相關(guān)OC細胞內(nèi)的EGFR水平顯著上調(diào)。

有趣的是，在球體中EGFR-陽性O(shè)C細胞環(huán)繞在EGF-陽性TAMs周圍。這種緊密接觸說明球體中心的TAMs不僅為OC細胞避免失巢凋亡提供了最初的基質(zhì)支持，還通過EGF-EGFR旁分泌環(huán)路促進了OC細胞的增殖。此外，我們證實EGF/EGFR軸不僅對OC增殖起重要作用，還誘導VEGF-C在OC細胞內(nèi)的表達，其反過來激活VEGFR3自分泌旁路進而提高整合蛋白/ICAM-1的表達、OC細胞的遷移和球體形成(圖13B)。這個結(jié)論通過以下研究得出：1)在transwell中與TAMs細胞進行共培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)通過降低EGF值或使用EGFR阻滯劑厄洛替尼能顯著抑制OC細胞的增殖。此外，在兩只OC小鼠模型中觀察到EGFR阻滯劑能徹底鈍化球狀體形成、OC細胞增殖及腫瘤生長；2)TAM產(chǎn)生的EGF誘導OC細胞內(nèi)VEGF-C的表達，其反過來激活VEGFR3旁路；通過阻滯EGFR-ERK信號轉(zhuǎn)導能消除OC細胞內(nèi)由EGF誘導產(chǎn)生VEGF-C。重要的是，EGF與VEGF-C均能刺激ICAM-1在OC細胞中的表達以及OC細胞的分化；上述所有效應(yīng)在使用VEGFR3阻滯劑后均能被削弱。因此，在OC細胞內(nèi)VEGF-C/VEGFR3作用于EGFR信號轉(zhuǎn)導的下游部位(圖13B)。

我們的數(shù)據(jù)表明在早期消耗掉TAMs或用厄洛替尼阻滯OC細胞中的EGFR能有效預(yù)防卵巢癌的種植性轉(zhuǎn)移，但在晚期上述措施無效。這項研究結(jié)果也許能解釋為何晚期OC患者使用EGF抗體單藥治療未能取得成果。因此，OC的治療應(yīng)包括早期診斷、去除TAMs及EGF抗體療法的使用。此外，我們建立的EGF/EGFR、VEGF-C/VEGFR3和ICAM-1–αMβ2整合蛋白模型要求OC細胞增殖、遷移、粘附和球體形成具有臨床意義。因此，ICAM-1中和抗體，類似于阻斷EGF和VEGFR3信號轉(zhuǎn)導，強烈抑制體外球體的形成。而且，ICAM-1中和抗體明顯減少小鼠模型中球體的大小、數(shù)量以及腫瘤的進展。本研究表明中和ICAM-1可能為治療OC提供新的療法。

總的說來，我們的研究表明TAMs在卵巢癌種植轉(zhuǎn)移球狀體形成過程中起到必不可少的作用。TAM能分泌大量EGF從而激活周圍腫瘤細胞中的EGFR。激活的EGF/EGFR信號通路能上調(diào)VEGF-C其反過來又上調(diào)整合蛋白和ICAM-1從而形成自分泌正反饋環(huán)路，從而促進腫瘤細胞增生、分化、粘附、形成球狀體及腹膜轉(zhuǎn)移(見圖13B)。我們目前的研究揭示出球狀體形成的關(guān)鍵機制、為抑制種植轉(zhuǎn)移提供了一種新策略以及改善OC患者的預(yù)后情況。

最后所應(yīng)當說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)。