本發(fā)明涉及分子生物學領域，特別是涉及一種用于檢測禽白血病病毒J亞群的試劑盒及其應用。

背景技術：

禽白血病(Avian Leukosis，AL)是由禽白血病病毒(Avian Loueosis virus，ALV)引起的以造血細胞惡性增生為主的一類腫瘤性疾病的總稱。根據(jù)宿主范圍、病毒囊膜抗原差異、病毒干擾試驗和基因組分子生物學特性，將ALV分為A～J 10個亞群。J亞群禽白血病毒(Avian Leukosis Viruss Subgroup J，ALV-J)是1991年首次從肉雞中分離得到的一種新型禽白血病毒，其原型株為HPRSl03。ALV-J主要引起肉雞發(fā)生髓細胞瘤變(ML)以及其它各種惡性腫瘤?；舅蓄愋偷碾u對ALV-J都易感。近年來我國主要以ALV-J感染為主，占ALV感染雞群的65-70％，且本病可垂直傳播，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大危害。

根據(jù)病毒血清中和試驗、在不同遺傳型雞胚成纖維細胞上的宿主范圍、與相同或不同亞群成員的干擾模式、囊膜糖蛋白的特性以及基因組的分子生物學特性等，將禽白血病/肉瘤病毒劃分為A、B、C、D、E、F、G、H、I、J共10個亞群。自然感染雞群的只有A、B、C、D、E和J六個亞群。這六個亞群中，相對來說，J亞群與其它亞群間的抗原性差異最大，而且外源性J亞群的致病性和傳染性最強，內(nèi)源性ALV-J普遍存在生物體內(nèi)，無致病性，通常不作為檢測目標，一般ALV-J的檢測指的是致病力較強的外源性ALV-J。

ALV-J屬于轉(zhuǎn)錄病毒科、甲型反轉(zhuǎn)錄病毒屬，病毒粒子呈球形，由外部囊膜和內(nèi)部電子致密核心組成。編碼反轉(zhuǎn)錄酶(RT)的pol基因位于核芯，該酶是前病毒DNA整合進宿主基因組所必需的。病毒的囊膜包含env基因編碼的2個糖蛋白：表面糖蛋白(SU)gp85和穿膜蛋白(TM)gp37。SU是存在于病毒顆粒表面的棒狀結(jié)構，決定病毒的亞群特異性，是病毒亞群特異性抗原。囊膜糖蛋白gp85位于病毒粒子表面呈球形結(jié)構，通過識別細胞膜上的特異性病毒受體與宿主細胞相互作用，是病毒的亞群特異性抗原，在免疫機能健全的雞體內(nèi)能夠誘導特異性抗體產(chǎn)生。gp85蛋白參與病毒中和反應，決定病毒的亞群特異性和宿主范圍。

傳統(tǒng)的ALV-J檢測方法為病理組織學檢查、病毒分離和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)等。ALV-J的靶細胞是骨髓細胞，ALV-J感染后形成肉眼可見的骨髓細胞瘤，經(jīng)HE染色后，瘤細胞形態(tài)一致，有豐富的嗜酸性細胞漿。經(jīng)典的ALV感染產(chǎn)生的是法氏囊腫瘤或淋巴細胞瘤，瘤細胞體積大，胞漿較少，呈嗜堿性染色。通過腫瘤鑒定和病毒學檢查初步診斷ALV-J在雞群中的感染，進一步可以通過病毒分離進行確診。ALV-J在雞胚成纖維細胞(CEF)上生長良好，但卻不能在哺乳動物細胞培養(yǎng)物中復制或轉(zhuǎn)化。將病雞的血液、泄殖腔拭子、胚胎或羽髓材料經(jīng)處理后接種于CEF上培養(yǎng)，ALV-J能在CEF上增殖，但是不產(chǎn)生細胞病變，分離得到的病毒可以與抗ALV-J的抗血清進行中和反應，但是該方法需要在實驗室制備抵抗內(nèi)源性疾病的CEF，不適合進行大批量樣本的檢測，而且ALV-J基因變快，其抗原性不斷發(fā)生變化，需要篩選匹配的ALV-J特異性的血清進行中和試驗，給檢測增加了難度。

隨著分子生物技術的飛速發(fā)展，RT-PCR被應用于ALV-J的檢測中，其敏感性比ELISA高。Smith EJ等通過設計E元件和3’LTR特異性的引物，建立了特異性檢測ALV-J前病毒DNA的PCR擴增方法，由于其靈敏性和特異性高，可以替代常規(guī)的病毒分離。研究表明，用特異性引物對ALV-J進行RT-PCR擴增不失為一種快速、準確的檢測方法，該方法省時省力，不僅能用于養(yǎng)殖場中ALV-J的快速檢測，還可以用于生物制品、SPF雞胚、家禽肉制品等的ALV-J快速檢測。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個目的在于提供用于檢測禽白血病病毒J亞群的特異性引物。

本發(fā)明的第二個目的在于提供檢測禽白血病病毒J亞群的試劑盒。

本發(fā)明以HLJ13SH01(GenBank登錄號為KM376510)基因組序列作為參考設計引物，可特異性擴增ALV-J env基因序列，其上游引物序列位于pol基因的末端，下游引物位于gp85基因的末端，擴增長度約1091bp的序列，上游引物在5296nt-5315nt之間，下游引物在6363nt-6383nt之間。在眾多備選的引物中，經(jīng)過多次篩選，比對試驗，以排除引物與其他物種序列可能存在的非特異性匹配，最終獲得優(yōu)化后的引物對。

本發(fā)明提供的優(yōu)選的特異性引物對，其序列為：

上游引物：5’-GGATGAGGTGACTAAGAAAG-3’(SEQ ID NO.1)；以及下游引物：5’-GGTAAAGTTAGGAGAGAGCAT-3’(SEQ ID NO.2)。

提取樣本總RNA并進行反轉(zhuǎn)錄(RT)合成cDNA后，利用上述引物進行聚合酶鏈式反應(PCR)，采用下列反應程序：起始變性94℃5min，30個循環(huán)(94℃45s，55℃45s，72℃70s)，最后經(jīng)過72℃10min延伸，對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，利用紫外凝膠成像儀檢測目的條帶，如果擴增出目的條帶則證明為禽白血病病毒J亞群陽性，否則為陰性。

本發(fā)明提供了上述特異性引物對在制備檢測禽白血病病毒J亞群試劑盒中的應用。

本發(fā)明提供了上述特異性引物對在禽類生物制品質(zhì)量控制中的應用。

含有SEQ ID NO.1-2所示特異性引物對的檢測試劑屬于本發(fā)明的保護范圍。

含有SEQ ID NO.1-2所示特異性引物對的試劑盒屬于本發(fā)明的保護范圍。

進一步地，本發(fā)明的試劑盒其PCR階段的工作程序為：94℃5min；94℃45s，55℃45s，72℃70s，30個循環(huán)；72℃10min。

本發(fā)明的上述試劑盒是對待測樣本進行RT-PCR檢測后，擴增產(chǎn)物若有1091bp大小的條帶，則待測樣本中含有禽白血病病毒J亞群。

本發(fā)明還提供了一種檢測禽白血病病毒J亞群的非診斷目的方法，包括以下步驟：

(1)提取待測樣本的總RNA，反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA；

(2)利用SEQ ID NO.1-2所示特異性引物對對步驟(1)的cDNA進行PCR擴增，根據(jù)擴增結(jié)果判斷待測樣本中是否有禽白血病病毒J亞群。

其中，步驟(2)中陽性樣本擴增的目的片段為1091bp。

本發(fā)明的優(yōu)點在于，1)擴增的目的片段位于ALV-J env基因的高度保守區(qū)，長度為1091bp，敏感性好、操作方便、對的ALV-J能較好檢出；2)將ALV-J病毒樣本cDNA進行10倍系列稀釋，發(fā)現(xiàn)進行10000倍稀釋后利用本方法仍能檢測到ALV-J特異性條帶，表明該方法具有較高的靈敏度；3)利用本方法只能擴增出外源性ALV-J，降低內(nèi)源性ALV-J對檢測結(jié)果的干擾，提高檢測效率；4)該方法對其它常見禽病病原，如禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性法氏囊病毒、禽呼腸孤病毒、禽腺病毒、傳染性喉氣管炎病毒、禽白血病A//B亞群、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒、馬立克氏病毒和禽傳染性貧血病病毒的檢測結(jié)果皆為陰性，沒有交叉反應，表明該方法亦具有良好的特異性；5)本發(fā)明方法適用于養(yǎng)禽生產(chǎn)中進行ALV-J的檢測。由于J亞群禽白血病屬免疫抑制疾病，可垂直傳播，因此疫苗、SPF雞胚等生物制品均需對其進行檢測，本方法適用于對ALV-J大批量樣品的檢測。試驗證明此方法具有高特異性、高靈敏度、高效率、低成本的特點，可在6.5h內(nèi)對臨床病料進行快速鑒別診斷，克服了傳統(tǒng)檢測方法耗時較長的缺點，可為ALV-J的早期快速診斷提供技術手段，為做好雞群白血病凈化提供保障。

附圖說明

圖1是最佳擴增引物篩選電泳結(jié)果。點樣順序為M：Marker III；1：引物1(1091bp)；2：引物2(1147bp)；3：引物3(981bp)。

圖2是RT-PCR反應最佳退火溫度篩選電泳結(jié)果。點樣順序為M：Marker III；1：49℃；2：52℃；3：54℃；4：55℃；5：56℃；6：58℃。

圖3是RT-PCR反應最佳循環(huán)數(shù)篩選電泳結(jié)果。M：Marker III；1：28循環(huán)；2：29循環(huán)；3：30循環(huán)；4：31循環(huán)；5：32循環(huán)；6：33循環(huán)。

圖4是該引物對ALV-J進行檢測的電泳結(jié)果。點樣順序為M：DNA Maker III；P：陽性對照；N：陰性對照；1：樣品1(2015年山東分離株)；2：樣品2(2016年河北分離株)；3：樣品3(2014年廣東分離株)；4：樣品4(2016年遼寧分離株)。

圖5是對該引物對ALV-J的靈敏度電泳檢測結(jié)果。點樣順序為M：DNA maker III；P：陽性對照；N：陰性對照；1：cDNA稀釋10倍；2：cDNA稀釋10²倍；3：cDNA稀釋10³倍；4：cDNA稀釋10⁴倍；5：cDNA稀釋10⁵倍。

圖6是對其它常見禽病病原進行檢測的電泳結(jié)果。其中M：DNA Maker III；P：陽性對照；N：陰性對照；1：H5亞型禽流感病毒；2：H7亞型禽流感病毒；3：H9亞型禽流感病毒；4：新城疫病毒(NDV)；5：傳染性支氣管炎病毒(IBV)；6：傳染性法氏囊病毒(IBDV)；7：禽呼腸孤病毒(REOV)；8：禽腺病毒(FadV)；9：傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)；10：禽白血病A亞群(ALV-A)；11：禽白血病B亞群(ALV-B)；12：禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒(REV)；13：馬立克氏病毒(MDV)；14：禽傳染性貧血病病毒(CAV)。

圖7現(xiàn)有技術進行PCR特異性檢測結(jié)果，樣品順序：M：Marker III；P：陽性對照；N：陰性對照；1：雞胚尿囊液。

圖8采用現(xiàn)有技術進行PCR特異性檢測結(jié)果，樣品順序：M：

Marker II；P：陽性對照；N：陰性對照；1：雞胚尿囊液。

具體實施方式

以下實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。

若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。

下列實施例中常規(guī)的實驗方法，參見Sambrook等編寫的分子克隆。儀器的使用參照儀器操作說明。LEGEND MICRO 17R低溫臺式離心機，為Thermo公司產(chǎn)品；VS-1渦旋振蕩器購自鼎昊源科技有限公司；TL-2010S組織研磨震蕩器購自鼎昊源科技有限公司。反轉(zhuǎn)錄酶(Reverse Transcriptase)200U/μl(Promega)、核酸酶抑制劑(Rnase Inhibitor)50U/μl(Takara)、5倍體積的反應緩沖液(5×Reaction Buffer)、dNTP混合物2.5mM和隨機引物(Random Primer)500μg/ml(Promega)，購自北京愛普銳晟科技有限公司；DEPC處理水，購自北京明豪至遠有限公司。Marker II DNA Ladder購自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司。Veriti 96-Well Thermal Cycler PCR擴增儀為Applied Biosystems公司產(chǎn)品，購自北京誠茂興業(yè)科技發(fā)展有限公司；MINI-Smart小型臺式離心機為HERO公司產(chǎn)品；HW·SYII-KP3型電熱恒溫水槽購自北京長風儀器儀表公司。

本發(fā)明實施例中選用的生物材料如下：禽流感病毒、傳染性法氏囊病毒、禽傳染性支氣管炎病毒、禽呼腸孤病毒、禽腺病毒和禽傳染性喉氣管炎病毒，新城疫病毒BJ14(基因VI型)、La Sota(基因II型)、aSG10(基因VII型)、F48E8(基因IX型)均由中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院保藏和提供。

實施例1用于檢測禽白血病病毒J亞群的特異性引物的設計

NCBI數(shù)據(jù)庫中HLJ13SH01(GenBank登錄號為KM376510)基因組序列作為參考，設計特異性引物。在眾多備選的引物中(表1所示)，經(jīng)過多次篩選，比對試驗，以排除引物與其他物種序列可能存在的非特異性匹配，經(jīng)反復篩選和驗證，最終獲得優(yōu)化后的引物對，各引物擴增電泳結(jié)果如圖1所示。選擇擴增目的條帶最亮，無非特異性雜帶的引物對1為最佳引物，其上游引物序列位于pol基因的末端，下游引物位于gp85基因的末端，擴增長度約1091bp的序列，上游引物在5296nt-5315nt之間，下游引物在6363nt-6383nt之間。

表1用于檢測J亞群禽白血病病毒的備選引物序列

本發(fā)明提供的優(yōu)選特異性引物對，其序列為：上游引物：5’-GGATGAGGTGACTAAGAAAG-3’(SEQ ID NO.1)；以及下游引物：5’-GGTAAAGTTAGGAGAGAGCAT-3’(SEQ ID NO.2)。

實施例2檢測J亞群禽白血病病毒的RT-PCR檢測方法最佳退火溫度的摸索

1、檢測樣品的預處理

(1)組織樣品處理：取100mg臟器組織樣品加入0.5ml滅菌生理鹽水并用研磨器進行研磨混懸，組織懸液3000rpm離心30min后取上清用于檢測分析。

(2)泄殖腔或口咽拭子樣品處理：將拭子樣品加入0.5ml滅菌生理鹽水并用渦旋振蕩器振蕩混懸，樣品懸液3000rpm離心30min后取上清用于檢測。

2、樣品總RNA的提取

參照Trizol RNA提取試劑盒(Invitrogen)說明書進行提取。

3、反轉(zhuǎn)錄為cDNA

在0.2ml離心管內(nèi)加入下列成分：RNA溶液4μl，隨機引物1μl，輕輕混勻，70℃水浴5min，冰浴2min，然后依次加入下列成分：5×反應緩沖液4μl，dNTP混合物2μl，核酸酶抑制劑1μl，反轉(zhuǎn)錄酶0.5μl，DEPC處理水7.5μl，輕輕混勻，37℃作用1h，得到樣本cDNA。

4、PCR檢測

利用實施例1最終確定的引物對進行聚合酶鏈式反應(PCR)，

在0.2ml離心管中加入下列成分：

輕輕混勻后，以不同的退火溫度分別進行如下反應：94℃預變性5min，94℃45s，(49℃、52℃、54℃、55℃、56℃和58℃)45s，72℃70s，進行30個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束72℃延伸10min。

PCR反應結(jié)束后，用1×TAE電泳緩沖液制備1％瓊脂糖凝膠并按照參考比例混入熒光染料Gelsafe，取7μl PCR產(chǎn)物加入凝膠孔中，選擇合適的電壓(4V/cm-10V/cm)進行電泳，電泳時間為20-30min，電泳結(jié)束后將凝膠塊置于紫外凝膠成像儀上觀察并拍照，根據(jù)電泳結(jié)果確定樣品中能否擴增出目的條帶，如果擴增出目的條帶長度為1091bp則證明待測樣品為禽白血病病毒J亞群檢測陽性，否則為檢測陰性。

電泳結(jié)果如圖2所示，55℃為擴增目的條帶最亮，結(jié)合退火溫度過高不利于引物與模板結(jié)合，所以選擇該溫度為最佳溫度。

實施例3檢測J亞群禽白血病病毒的RT-PCR檢測方法最佳循環(huán)數(shù)摸索

檢測樣品的預處理、樣品總RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄為cDNA參見實施例2對應的方法。利用實施例1和2確定的條件，設計6個不同的循環(huán)數(shù)(28、29、30、31、32和33)對ALV-J進行RT-PCR。

在0.2ml離心管中加入成分參見實施例2。輕輕混勻后，采用下列反應程序：起始變性94℃5min，30個循環(huán)(94℃45s，55℃45s，72℃70s)，最后經(jīng)過72℃10min延伸，PCR反應結(jié)束后，用1×TAE電泳緩沖液制備1％瓊脂糖凝膠并按照參考比例混入熒光染料Gelsafe，取7μl PCR產(chǎn)物加入凝膠孔中，選擇合適的電壓(4V/cm-10V/cm)進行電泳，電泳時間為20-30min，電泳結(jié)束后將凝膠塊置于紫外凝膠成像儀上觀察并拍照，根據(jù)電泳結(jié)果確定樣品中能否擴增出目的條帶，如果擴增出目的條帶長度為1091bp則證明待測樣品為禽白血病病毒J亞群檢測陽性，否則為檢測陰性。電泳結(jié)果如圖3所示，30個循環(huán)數(shù)擴增目的條帶條帶與更多循環(huán)數(shù)亮度相似，且沒有非特異性雜帶，能節(jié)省時間、提高檢測效率，因此選擇其為最佳循環(huán)數(shù)。

實施例4檢測禽白血病病毒J亞群的RT-PCR檢測方法的建立

檢測樣品的預處理、樣品總RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄為cDNA參見實施例2對應的方法。在0.2ml離心管中加入成分參見實施例2。輕輕混勻后，采用下列反應程序：起始變性94℃5min，30個循環(huán)(94℃45s，55℃45s，72℃70s)，最后經(jīng)過72℃10min延伸，PCR反應結(jié)束后，用1×TAE電泳緩沖液制備1％瓊脂糖凝膠并按照參考比例混入熒光染料Gelsafe，取7μl PCR產(chǎn)物加入凝膠孔中，選擇合適的電壓(4V/cm-10V/cm)進行電泳，電泳時間為20-30min，電泳結(jié)束后將凝膠塊置于紫外凝膠成像儀上觀察并拍照，根據(jù)電泳結(jié)果確定樣品中能否擴增出目的條帶，如果擴增出目的條帶長度為1091bp則證明待測樣品為禽白血病病毒J亞群檢測陽性，否則為檢測陰性。

利用上述方法對不同分離株的ALV-J進行檢測，結(jié)果均有較好的檢出，樣品1(2015年山東分離株)；樣品2(2016年河北分離株)；樣品3(2014年廣東分離株)；樣品4(2016年遼寧分離株)如圖4所示。

實施例5檢測禽白血病病毒J亞群的RT-PCR檢測方法的敏感性檢測

按照實施例4建立的方法進行。

將cDNA溶液進行10倍系列稀釋，稀釋度為10、10²、10³、10⁴和10⁵倍，分別以稀釋后的模板按如下體系進行PCR反應。94℃預變性5min，94℃45s，55℃45s，72℃70s，進行30個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束72℃延伸10min。

PCR反應結(jié)束后，用1×TAE電泳緩沖液制備1％瓊脂糖凝膠并按照參考比例混入熒光染料Gelsafe。取7μl PCR產(chǎn)物加入凝膠孔中，選擇合適的電壓(4V/cm-10V/cm)進行電泳，電泳時間為20-30分鐘，電泳結(jié)束后將凝膠塊置于凝膠成像儀上觀察并拍照，根據(jù)電泳結(jié)果確定樣品中能否擴增出目的條帶1091bp，如果擴增出目的條帶則證明為禽白血病病毒J亞群檢測陽性，否則為禽白血病病毒J亞群檢測陰性。

利用上述方法對禽白血病病毒J亞群進行檢測，結(jié)果顯示對反轉(zhuǎn)錄的禽白血病病毒J亞群cDNA稀釋10⁴倍后，仍能檢測到病毒DNA，如圖5所示，表明本方法具有良好的敏感性。

實施例6檢測禽白血病病毒J亞群的RT-PCR檢測方法對禽常見病病原的特異性檢測

1、利用實施例4建立方法對其它常見的禽病病原：禽白血病病毒A亞群、禽白血病病毒B亞群、禽流感病毒H5H7H9、新城疫病毒、禽傳染性支氣管炎病毒、傳染性法氏囊病毒、禽呼腸孤病毒、禽腺病毒、禽傳染性喉氣管炎病毒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒、馬立克氏病病毒和禽傳染性貧血病病毒進行檢測，結(jié)果如圖3所示，結(jié)果顯示，除陽性對照(ALV-J)外，其他實驗對象的檢測結(jié)果皆為陰性，表明本方法在檢測禽類常見的其他病原體過程中，實施例4建立的方法針對禽白血病病毒J亞群具有良好的特異性。

2、與現(xiàn)有技術公開的檢測ALV-J方法特異性的對比

現(xiàn)有技術公開了一種檢測ALV-J的PCR方法，所采用的引物序列為：ALV-J-545-F：GGATGAGGTGACTAAGAAAG，ALV-J-545-R：CGAACCAAAGGTAACACACG。因SPF雞胚和臨床病料中通常攜帶內(nèi)源性ALV-J，其不具有致病性，不做為檢測目標，所以發(fā)明人采用上述引物進行了SPF雞胚中外源性ALV-J檢測，結(jié)果如圖7所示，專利申報引物特異性好，僅能擴增出外源性ALV-J的目的片段，而不會擴增出雞胚尿囊液中內(nèi)源性白血病。如圖8，與本發(fā)明實施例4的檢測效果相比，該文獻所用引物特異性差，能擴增出SPF雞胚中內(nèi)源性ALV-J，出現(xiàn)假陽性。將擴增出的陽性片段進行測序比對其與內(nèi)源性ALV-J同源性最高。