專利名稱：牛白血病發(fā)病的可能性及抗性的定判定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及對牛白血病病毒BLV所引發(fā)的白血病發(fā)病的可能性及抗性進行評價的方法。
背景技術：
主要組織相容性復合體(MHC)是在機體防御感染的機構中與識別自體-非自體成分相關的分子，它包括由α鏈和β2M構成的Ⅰ類分子和由α鏈、β鏈構成的Ⅱ類分子，在各自的α1、α2結構域和α1、β1功能存在與抗原肽結合的溝。并且有這樣的特征T細胞受體只識別該結構才結合的肽片段，識別Ⅰ類分子的CD8+細胞可誘導細胞死亡(細胞免疫)、識別Ⅱ類分子的CD4+細胞主要誘導抗體產(chǎn)物(體液免疫)。
MHC是最具多態(tài)的基因群，其單元型(haplotyre)決定了肽容納溝中這一空位的位置、形態(tài)、大小和性狀的不同，與之相伴，嵌入的肽片段的結合狀態(tài)亦變化，由此決定了每個個體的免疫應答和疾病的敏感性。談到MHC單元型與疾病抗性(抗病性)或發(fā)病可能性(易病性)的相互關系，如有關于人類免疫缺陷病毒(HIV)，成人T細胞白血病病毒(HTLV)和瘧疾的報告。
另一方面，對于牛MHC(BoLA)Ⅱ類基因，到目前為止，人們推測存在DQA、DQB、DRA、DRB、DNA、DOB、DYA和DYB基因。在DRB基因座中所鑒定出的3個基因(DRB1-B3)，已知DRB3能夠編碼功能性蛋白質，到目前為止，已明了存在73種等位基因。但是，尚無牛感染性疾病與牛MHC(BoLA)單元型相關性的報道。
特別是對于具有與人免疫缺陷病毒(HIV)同樣的病毒增殖調節(jié)基因PD、與HTLV-1最近似的逆轉錄病毒牛白血病病毒(BLV)，有這樣的報道，與牛MHC(BoLA)單元型相關，美國是抗病性的中心，而無與白血病發(fā)病可能性相關的報道。由該病毒所感染的牛的比例(日本的感染率)為10-20％，其中有1-2％，在10-15年的慢長潛伏期后發(fā)生極度惡性的地方性牛白血病，直至死亡，因此，該病毒給畜牧農(nóng)民家?guī)砗車乐氐慕?jīng)濟損失。若能通過對牛MHC(MoLA)單元型進行分析，簡單判定BLV感染后牛的發(fā)病可能性，就可能期待預選具有抗病性的牛進行飼養(yǎng)，從而能極安全地繼續(xù)牛的飼養(yǎng)。
因此，本發(fā)明的目標是解析牛白血病病毒(BLV)與牛MHC(BoLA)單元型的相關性，提供用基因步驟學方法簡單判定牛個體對牛白血病病毒(BLV)的白血病發(fā)病可能性及發(fā)病抗性的方法。另外，本發(fā)明的其它目標是提供對上述判定方法有用的引物對。
發(fā)明的公開本發(fā)明人首先解析了牛MHC(BoLA)Ⅱ類基因中DRB基因座的構造，闡明了DRB3基因(BoLA-DRB3)和該基因產(chǎn)物的構造(Biochem.Biophys.Res.Commun.,209。pp.981-988,1995)。本發(fā)明人再對該基因功能進行研究的過程中發(fā)現(xiàn)，在白血病發(fā)病牛和未發(fā)病牛中，在BoLA-DRB3中，尤其是在具有多態(tài)性的第二外顯子(β1結構域)的基因產(chǎn)物中見到明確不用存在氨基酸序列的不同部分。另外，置換該氨基酸可見到對BLV的發(fā)病可能性及發(fā)病抗性直接相關。本發(fā)明基本完成了這些見解。
也就是說本發(fā)明提供了對牛白血病病毒BLV的白血病發(fā)病可能性的判定方法，即牛MHCⅡDRβ鏈的β1結構域的75-78號氨基酸為特定Val-Asp-Thr-Tyr氨基酸序列的牛個體具有白血病的發(fā)病可能性。本發(fā)明的優(yōu)選狀態(tài)對感染了牛白血病病毒BLV的牛進行上述方法；并提供上述判定方法，兩個等位基因和牛MHCⅡDRβ鏈的β1結構域的75-78號氨基酸為特定氨基酸序列Val-Asp-Thr-Tyr的牛個體具有發(fā)病危險性。
此外，據(jù)本發(fā)明的其它狀態(tài)，提供了判定牛對牛白血病病毒BLV的白血病發(fā)病可能性的方法，包括如下步驟(1)通過聚合酶鏈式反應(PCR)對從牛中分離出的基因組DNA進行擴增，制備出包含編碼部分或全部牛MHCⅡDRβ鏈的β1結構域的DNA的PCR產(chǎn)物的步驟；及(2)判定由包含上述PCR產(chǎn)物的DNA所編碼的氨基酸序列中，相當于牛MHCⅡDRβ鏈β1結構域的75-78號氨基酸序列的氨基酸序列為Val-Asp-Thr-Tyr的牛具有白血病發(fā)病可能性的步驟。該方法的優(yōu)選狀態(tài)是包括用PstⅠ消化PCR產(chǎn)物的方法。
本發(fā)明的其它觀點提供了判定牛對牛白血病病毒BLV的白血病發(fā)病抗性的方法，即提供這樣的判定方法牛個體的牛MHCⅡDRβ鏈β1結構域的78號氨基酸為特定氨基酸Val的牛具有白血病發(fā)病抗性。據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選狀態(tài)，提供了對感染了牛白血病病毒BLV的牛實施上述方法；判定至少一方的等位基因中牛MHCⅡDRβ鏈β1結構域的78號氨基酸為特定氨基酸Val的牛具有發(fā)病抗性的上述方法；并提供判定雙方等位基因的牛MHCⅡDRβ鏈β1結構域的78號氨基酸為特定氨基酸Val的牛發(fā)病抗性高的上述方法。
此外，據(jù)本發(fā)明的其它狀態(tài)，可提供判定牛對牛白血病病毒BLV白血病發(fā)病抵抗的方法，包括如下步驟(1)通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增從牛分離出的基因組DNA，制備包含編碼牛MHCⅡDRβ鏈的β1結構域部分或全部的DNA的PCR產(chǎn)物的步驟；以及(2)判定由包含上述PCR產(chǎn)物的DNA所編碼的氨基酸序列中，相當于牛MHCⅡDRβ鏈β1結構域的78號氨基酸的氨基酸為Val的牛具有白血病抗性的步驟。該方法的優(yōu)選狀態(tài)是包括用PstⅠ消化PCR產(chǎn)物的步驟。
這些發(fā)明的優(yōu)選狀態(tài)，提供下述引物對和應用它們的上述方法，優(yōu)選對各個感染了牛白血病病毒BLV的牛實施上述方法。此外本發(fā)明可提供判定牛對牛白血病病毒BLV白血病發(fā)病可能性時應用的系列引物，包含下面引物A和引物B的系列引物(1)-(3)。引物對(1)A引物5′-TGTAAAACGACGGCCAGTCTCTCTCTGCAGCACATTTCCT-3′B引的5′-CAGGAAACAGCTATGACCCGCCGCTGCACAGTGAAACTC-3′引物對(2)A引物5′-GGAATTCCTCTCTCTGCAGCACATTTCCT-3′B引物5′-AAGTCGACCGCTGCACAGTGAAACTC-3′引物對(3)A引物5′-GAGTGTCATTTCTTCAACGGGAC-3′5′-GGAGAAGAGTTCGTGCGCTTCGA-3′及從 5′-GGAATTCCTCTCTCTGCAGCACATTTCCT-3′構成的引物群中選擇的引物。
B引物5′-AAGTCGACCGCTGCACAGTGAAACTC-3′。
附圖簡述

圖1是MHCⅡDRβ鏈的結構圖。圖中，(A)表示牛MHCⅡDRβ鏈mRNA的構造，(B)表示編碼牛MHCⅡDRβ鏈cDNA全長及該基因產(chǎn)物的氨基酸序列，β1結構域是1-94號氨基酸序列形成的特定部分。
圖2(A)-(C)是感染了牛白血病病毒BLV的未發(fā)病牛(A)為淋巴細胞增多癥牛7頭(B)和(C)是比較抗體陽性健康未發(fā)病牛24頭，來源的牛MHCⅡDRβ鏈的β1結構域的氨基酸(9-86號的特定氨基酸序列)的結果示意圖。左側的數(shù)字為牛的識別序號，圖中氨基酸用單字符表示。
圖3(A)和(B)是比較白血病發(fā)病牛(24頭)來源的牛MHCⅡDRβ鏈β1結構域的氨基酸(9-86號特定的氨基酸序列)的結果圖。左側的數(shù)字為牛的識別序號，圖中氨基酸用單字符表示。
發(fā)明的最佳實施方式本發(fā)明的方法是針對感染了牛白血病病毒BLV的?；蚋腥綛LV的牛判定其白血病發(fā)病可能性的方法。另外本發(fā)明的其它方法是針對感染了牛白血病病毒BLV的牛或未感染BLV的牛判定其白血病發(fā)病抗性的方法。
本發(fā)明的優(yōu)選狀態(tài)是從牛分離出基因組DNA后，通過PCR特異性擴增編碼部分或全部牛MHCⅡDRβ鏈β1結構域(DRB3基因的第二外顯子)的基因，對所得PCR產(chǎn)物進行測序，推測β1結構域75-78號氨基酸的特定氨基酸序列。該氨基酸序列(氨基酸序號75-78)為Val-Asp-Thr-Tyr(用單字符表示為VDTY)的牛，無論其已經(jīng)感染了牛白血病病毒BLV或是正感染牛白血病病毒BLV，該個體具有發(fā)生白血病的可能性。牛是否感染白血病病毒BLV，可用抗牛白血病病毒BLV抗體進行試驗很容易地進行確認。
為了讓上述判定更具準確性，優(yōu)選對等位基因(單元型)進行上述氨基酸序列的比較。雙方等位基因的氨基酸序列(氨基酸序號75-78)為Val-Asp-Thr-Tyr的時候(即VDTY純合分子)無論該牛已感染了牛白血病病毒BLV或感染白血病病毒BLV的情況下，其白血病發(fā)病的危險性高。另一方面，當一方等位基因中氨基酸序列為Val-Asp-Thr-Tyr(VDTY)和Val-Asp-Thr-Val(VDTV)雜合；Val-Asp-Thr-Tyr(VDTY)和Val-Asp-Trg-Val(VDRV)雜合；Val-Asp-Thr-Val純合；Val-Asp-Ang-Val(VDRV)純合；或Val-Asp-Arg-Val(VDRV)和Val-Asp-Thr-Val(VDTV)雜合的時候，無論牛已感染了牛白血病病毒BLV還是感染BLV的情況下，其白血病的發(fā)病可能性非常低。
再從白血病發(fā)病抗性的觀點來看，可推測β1結構域的氨基酸序號78為特定的氨基酸。該氨基酸(氨基酸序號78)為Val(用單字符表示為V)的牛無論其已經(jīng)感染了牛白血病病毒BLV或是感染著BLV，該牛對白血病的發(fā)病具有抗性。判定抗性的過程中也最好比較等位基因中(單元型)的上述氨基酸，若等位基因中至少一個的β1結構域的78號氨基酸為特定氨基酸Val，該牛具有白血病發(fā)病抗性，若兩個等位基因均有上述氨基酸Val，則該牛對白血病發(fā)病有高抗性。
間等(Aida,Y.等，Biochem.Biophys.Res.Commun,209,pp.981-988,1995)對牛MHCⅡDRβ鏈β1結構域的氨基酸序列有所報道。圖1中顯示了牛MHCⅡDRβ鏈mRNA的構造(A)和cDNA全長基因產(chǎn)物的氨基酸序列(B)。圖中，β1結構域是1-94號氨基酸序列所形成的特定部分，該核苷酸序列及氨基酸序列表示的是75-78號氨基酸的肽序列為“Val-Asp-Thr-Tyr”時的序列。
本發(fā)明對作為判定對象的牛無特定限制，既有感染牛白血病病毒BLV的可能性，又有因感染BLV而發(fā)生白血病的可能性，乳肉種、乳肉兼用種、肉用種、役田種及役肉兼用種，無論哪一種均可。具體而言，如可列舉黑毛日本種、日本短角等日本牛、荷斯坦牛、ジセジ-、福海特牛、安格斯牛、フリ-シセン等品種，但并不只限于這些品種。
從牛制備基因組DNA的樣品可用未梢血和臟器等。臟器如可用淋巴結等的組織片。從上述樣品中制備基因組DNA的方法，只要是本領域的人員可利用的方法無論哪一種均可。若用末梢血白細胞或末梢血淋巴細胞作樣品的時候，如可用Hughes等的方法(Hughes,S.H.等，Cell,Is,pp.1397-1410,1978)。用臟器的時候，如可用刀片將冰凍的組織片切薄之后，通過十二烷基硫酸鈉、酚-氯仿法(Mcknight,G.S.,Cell,14,pp.403-413,1978)進行制備。另外，也可用簡便方法從細胞中提取基因組DNA，具體方法在實施例中有所描述。
用PCR擴增制備的基因組織DNA時所使用的引物，只要是能擴增包含編碼牛MHCⅡDRβ鏈β1結構域75-78號部分氨基酸序列的基因或包含編碼β1結構域全長的基因的DNA，無論哪種均可應用。
作為特別適用于本發(fā)明方法的引物對，可列舉適用于循環(huán)測序法及Dynabeadl DNA直接測序等直接測序法的下述引物對(1)A引物5′-TGTAAAACGACGGCCAGTCTCTCTCTGCAGCACATTTCCT-3′；及B引物5′-CAGGAAACAGCTATGACCCGCCGCTGCACAGTGAAACTC-3′。另外，作為附加了限制性酶切位點的引物可用從引物對(2)A引物5′-GGAATTCCTCTCTCTGCAGCACATTTCCT-3′及B引物5′-AAGTCGACCGCTGCACAGTGAAACTC-3′或引物對(3)A引物5′-GAGTGTCATTTCTTCAACGGGAC-3′、5′-GGAGAAGAGTTCGTGCGCTTCGA-3′及5′-GGAATTCCTCTCTCTGCAGCACATTTCCT-3′所形成的引物群中篩選出的引物；和B引物5′-AAGTCGACCGCTGCACAGTGAAACTC-3′。特別是用PstⅠ消化用引物對(3)所擴增的PCR等位基因，通過判定酶切方式的不同而簡單判定牛是具有白血病抗性還是具有白血病發(fā)病的可能性。但本發(fā)明方法中所可能利用的引物和引物對并不限于此。
PCR法中所應用的DNA量可作適宜選擇，如用末梢血白細胞或末梢血淋巴細胞時，可用到0.1～0.5μg。另外作為上面擴增的DNA(PCR產(chǎn)物)的測序法，可利用該領域內的工作者可能應用的任一種方法，如優(yōu)選應用直接測序法。其具體例在實施例中有詳細記錄。但多數(shù)的牛為雜合體(heterozygote)，從父親或母親而來的等位基因的堿基序列不同，用直接測序法無論確定是哪一個等位基因的。這種情況下，可用限制性酶EcoRⅠ和SalⅠ消化用上述引物對(2)所擴增的PCR產(chǎn)物，之后在載體內進行亞克隆，通過只測定單方等位基因的堿基序列，進行比較，來確切測定另一個等位基因的堿基序列。為了更準確地獲得基因情報，可用PCR產(chǎn)物對雙方的等位基因進行亞克隆，分別測定其堿基序列。其具體方法及可能利用的引物在下面的實施例中有詳細記載。
實施例以下通過本發(fā)明的實施例進行具體說明，但本發(fā)明的范圍并不限定于下面的實施例。例1白血病發(fā)病可能性的討論用加入了抗凝劑的注射器從作為樣品的牛中抽取末梢血，4℃,3000rpm條件下離心20分鐘，得到白細胞層，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌所分離的白細胞層，離心，所得細胞團作為末梢血白細胞樣品。另外可用宮坂等的方法(Miyaaska,M.和Tmka.Z.,ImmunologicalMethods,Vol.3,pp.403-423,1085,Academic Press,NY)從與上面同樣采取的末梢血中獲得末梢血淋巴細胞，得到與上面同樣的團塊，從而制備出末梢血淋巴細胞的樣品。另外，在4℃、1100 rpm條件下將BLV感染的懸浮細胞液離心5分鐘，棄培養(yǎng)液，從PBS洗細胞，洗凈后離心得到團塊樣品。由從發(fā)病的牛淋巴結和腫瘤組織分離出制備組織切片用的BLV感染淋巴肉瘤，無固定的情況下在液氮內速凍，-80℃保存，作為組織切片的樣品。
在1.5ml的微離心管中，用PBS將上述各樣品細胞洗2次，用旋渦振蕩器將沉淀細胞懸浮到PBS中。在1×106個細胞中加入200μl 1×PCR緩沖液〔10mM Tris-HCl(pH8.3),50mM KCl,2.5mMMgCl2,0.5％Tween-20〕和1μl蛋白酶K(20mg/ml)，用旋渦振蕩器再懸浮，56℃培養(yǎng)45-60分鐘。由在95℃處理10分鐘后，冰浴5分鐘以上，用大約5-10μl，在PCR法中進行擴增。
在包含200μM的各種dNTR、0.2-0.4μM引物、2.5單位的Taq聚合酶(Gene Amp Kit；Perkin-Elmer Cetus)的50μl 1×PCR緩沖液〔10mM Tris-HCl(pH8.3),50mM KCl,1.5mMMgCl2,0.001％(w/v)明膠〕中溶解基因組DNA，以94℃1分、61℃1分、72℃1分為1個循環(huán)進行擴增，擴增25個循環(huán)，再在72℃處理5分鐘。引物可用通過PCR法能對牛MHCⅡDRβ鏈β1結構域(BoLA β的βl結構域DRB3基因的第2外顯子)進行特異擴增的以下引物，在B引物的5′末端進行特異的生物素化。該引物亦適用于循環(huán)測序法。
A引物A引物5′-TGTAAAACGACGGCCAGTCTCTCTCTGCAGCACATTTCCT-3′B引物5′-CAGGAAACAGCTATGACCCGCCGCTGCACAGTGAAACTC-3′用100μl的2×結合-洗凈用緩沖液(B&W緩沖液10mM Tris-HCl(pH7.5),1.0 mM EDTA,2M NaCl,0.1％Tween-20)洗凈20μl的DYNAEADS M-280鏈霉親合素(Dynal A.S,N-0212,Oslo,Nolway)，將上述PCR產(chǎn)物(50μl)加到該磁珠懸浮液中，用滴管緩緩滴入后，用旋轉慢慢邊攪拌邊在室溫培育15分鐘。將含有固化的PCR產(chǎn)物的試管置于磁石上(Dynal MPC)，用吸管移去上清石，加入100μl的2×B&W緩沖液洗凈磁珠。應用磁石再次將上清去除后，再懸浮到臨時配制的0.1M NaOH 50μl中。
用磁石將固化了的磁珠聚集到試管壁上，除去上清，用50μl的0.1MNaOH洗滌磁珠1次，用100μl的1×B&W緩沖液洗3次，用50μl的TE緩沖液洗1次，得到生物素化的鏈。全部操作中，平穩(wěn)的敲擊進行再懸浮。再用100μl的蒸餾水洗凈后除去上清，加入蒸餾水，調整容量用于測序。用BcaBEST雙脫氧測序試劑盒(タカテ·バィォメディカルズ制)，按照附加的說明書中的條件進行測序。再者，作為測序引物應用以下引物。正向引物5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′反向引物5′-CAGGAAACACAGCTATGACC-3′結果如圖2及圖3所示(圖中，牛MHCⅡDRβ鏈βl結構域的氨基酸序號為9-86，左側的數(shù)字為牛的識別序號)。感染牛白血病病毒BLV后，將來源于白血病發(fā)病?！擦馨图毎龆喟Y牛(癌前狀態(tài))7頭、未發(fā)病牛(抗體陽性健康未發(fā)病牛)24頭分別為圖2的上段和下段〕和白血病發(fā)病牛(24頭，圖3)的牛MHCⅡDRβ鏈的βl結構域的氨基酸進行比較，結果發(fā)現(xiàn)白血病發(fā)病的雙方等位基因中氨基酸序號75-78的序列有Val-Asp-Thr-Tyr(VDTY)突變這一極顯著特征。相當于氨基酸序號75-78的部位，相當于βl結構域的α螺旋上有可能引起T細胞識別部位的作用。另外計算機分析的結果表明，該突變在牛白血病病毒BLV中僅存在于pol蛋白。
以上結果如表1所示。表中基因型VDTY/VDTY等表示方法是用一文字來表示兩等位基因中的氨基酸序列(牛MHCⅡDRβ鏈βl結構域的75-78號氨基酸)。另外，BLV感染牛的感染狀態(tài)是根據(jù)Levy等(Levy,D.,等，Int.J.Cancer,19,pp.822-827,1977)和間等(Aida,Y.等，Cancer Res.,52.pp.6463-6470,1992)的標準進行分類的。
表1BLV感染狀態(tài)(陽性率)基因型 白血病發(fā)病 淋巴細胞增多癥健康VDTY/VDTY 19/24 5/7 4/24VDTY/VDTY 2/24 2/7 2/24VDTY/VDRV 2/24 0/7 14/24VDRV/VDRV 0/24 0/7 1/24VDTV/VDTV 1/24 0/7 0/24VDTV/VDRV 0/24 0/7 3/24例2白血病發(fā)病抵抗的討論與例1同樣，對白血病發(fā)病牛(24頭)、白血病未發(fā)病牛(淋巴細胞增多癥和健康牛，其31頭)的牛MHCⅡDRβ鏈β1結構域的78號氨基酸的種類進行檢測，結果如下面表2所示。另外，同樣檢測71號和74號氨基酸的種類(表中氨基酸用一文字表示。Y:Tyr,V:Val,R:Ang,E:Gllu,K:Lgs；N:Asn)。該結果表明，78號氨基酸為纈氨酸和酪氨酸雜分子的個體和78號氨基酸為纈氨酸純分子的個體對白血病發(fā)病具有抗性，尤其是，78號氨基酸為纈氨酸純分子的個體對白血病發(fā)病高抗性。另外還表明，白血病未發(fā)病牛的74號氨基酸均為Gln或Asn,71號氨基酸殘基為Lys或Arg所以具有71號氨基酸為賴氨酸或精氨酸，74號氨基酸為谷氨酸或天冬酰胺且78號氨基酸為纈氨酸這樣的個體對白血病發(fā)病具有高抗性。
表2基因型 BLV感染狀態(tài) 陽性率Y78/Y78白血病發(fā)病牛 19/24V78/Y78白血病發(fā)病牛 4/24(R71-E74-V78/Y78: 3/24)(K71-E74-V78/Y78: 1/24)(K71-N74-V78/Y78: 0/24)V78/V78白血病發(fā)病牛 1/24(R71-E74-V78/R71-E74-V78: 1/24)(K71-E74-V78/K7M-E74-V78: 0/24)(K71-N74-V78/K71-N74-V78: 0/24)Y78/Y78白血病發(fā)病牛 9/31V78/Y78白血病發(fā)病牛 18/31(R71-E74-V78/Y78: 11/31)(K71-E74-V78/Y78: 4/31)(K71-N74-V78/Y78: 3/31)V78/V78白血病發(fā)病牛 4/31(R71-E74-V78/R71-E74-V78: 3/31)(K71-E74-V78/K71-E74-V78: 1/31)(K71-N74-V78/K71-N74-V78: 0/31)例3迅速判定發(fā)病可能性和抗性的方法如上，具有牛MHCⅡDRβ鏈β1結構域的78號氨基酸為Val這樣基因的個體，對由牛白血病病毒引起的白血病具有抗性，而兩個等位基因的78號氨基酸為Tyr的個體有發(fā)生白血病的可能性。因此可利用78號的等位基因為Val的基因中存在限制性酶PstⅠ酶切位點，而78號為Tyr的等位基因不存在PstⅠ酶切位點這一特點，用PstⅠ消化擴增了的PCR等位基因，根據(jù)切斷方式的差異來簡便判定牛個體是具有白血病抗性還是有白血病發(fā)病的可能性。
用以下引物作為PCR引物。
A引物DRB40:5′-GAGTGTCATTTCTTCAACGGGAC-3′DRB100: 5′-GGAGAAGAGTTCGTGCGCTTCGA-3′ERB3: 5′-GGAATTCCTCTCTCTGCAGCACATTTCCT-3′B引物SRB3: 5′-AAGTCGACCGCTGCACAGTGAAACTC-3′PCR條件按例1的條件進行。具體而言，根據(jù)引物的不同組合，以下面的循環(huán)作一個循環(huán)擴增35個循環(huán)再在72℃處理10分鐘。針對PCR10μl的體系，基因組DNA應用100ng。
DRB40/SRB3: 94℃1分，63℃2分，72℃2分DRB100/SRB3: 94℃1分，66℃2分，72℃2分ERB3/SRB3: 94℃1分，61℃2分，72℃2分經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳確認上述PCR產(chǎn)物后，用限制性酶PstⅠ切斷(12μl中，10×限制性酶用緩沖液1.2μl，擴增后DNA 6-7μl，限制性酶PstⅠ2單位，和H2O)。限制性酶反應終止后，將各待檢的進行3％瓊脂糖凝膠電泳，從而進行判定。結果如表3所示。
表3引物-PCR產(chǎn)物 PstⅠ片段的大小(bp)(bp)Y的等位基因 V的等位基因Y/YY/VDRB40/SRB3 247 199,48247 199,48247,199,48DRB100/SRB3187 139,48187 139,48139,187,48DRB100/SRB3*292 226,48274 226,48226,247,48*因為ERB3引物中存在PstⅠ酶切部位，所以每種情況下均包含18bp的片段。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性根據(jù)本發(fā)明的判定方法，可確實預知牛個體對牛白血病病毒BLV引發(fā)的白血病發(fā)病的可能性和抗性，可以進行安全飼養(yǎng)，從而可預防牧農(nóng)家的經(jīng)濟損失。
權利要求
1．針對牛白血病病毒BLV判定牛白血病發(fā)病可能性的方法，其中判定牛MHCⅡDRβ鏈的β1結構域的75-78號氨基酸為特定氨基酸序列Val-Asp-Thr-Tyr的牛個體有白血病發(fā)病可能性。
2．權利要求1的方法，其中判定兩個等位基因的牛MHCⅡDRβ鏈β1結構域的75-78號氨基酸都為特定氨基酸序列Val-Asp-Thr-Tyr的牛有發(fā)病危險性。
3．針對牛白血病病毒BLV，判定牛的白血病發(fā)病可能性的方法，包含下面的步驟(1)通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增從牛中分離出的基因組DNA，制備出包含編碼牛MHCⅡDRβ鏈β1結構域一部分或全部的DNA的PCR產(chǎn)物的步驟；及(2)判定由上述PCR產(chǎn)物所包含DNA編碼的氨基酸序列中，牛MHCⅡDRβ鏈β1結構域的75-78號氨基酸序列為Val-Asp-Thr-Tyr的牛有白血病發(fā)病可能性的步驟。
4．權利要求3的方法，包括用PstⅠ消化PCR產(chǎn)物的步驟。
5．針對牛白血病病毒BLV判定牛白血病發(fā)病抗性的方法，其中牛的牛MHCⅡDRβ鏈β1結構域的78號氨基酸為特定氨基酸Val的個體判定為具有白血病發(fā)病抗性。
6．權利要求5的方法，判定至少一個等位基因中牛MHCⅡDRβ鏈的β1結構域的78號氨基酸為特定氨基酸Val的牛個體具有發(fā)病抗性。
7．權利要求5的方法，判定兩個等位基因中牛MHCⅡDRβ鏈β1結構域的78號氨基酸為特定氨基酸Val的牛個體發(fā)病抗性高。
8．針對牛白血病病毒BLV判定牛對白血病發(fā)病的抗性的方法，包括下面的步驟(1)通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增從牛中分離出的基因組DNA，從而制備出包含編碼部分或全部牛MHCⅡDRβ鏈β1結構域的DNA的PCR產(chǎn)物的步驟；及(2)判定由上述PCR產(chǎn)物所包含的DNA所編碼的氨基酸序列中，牛MHCⅡDRβ鏈β1結構域的78號氨基酸為Val的牛個體具有白血病發(fā)病抗性的步驟。
9．權利要求8的方法，包括用PstⅠ消化PCR產(chǎn)物的步驟。
10．判定牛對牛白血病病毒BLV所引發(fā)的白血病發(fā)病的可能性或抗性時所應用的引物對，包括(a)A引物5′-TGTAAAACGACGGCCAGTCTCTCTCTGCAGCACATTTCCT-3′(b)B引物5′-CAGGAAACAGCTATGACCCGCCGCTGCACAGTGAAACTC-3′。
11．針對牛白血病病毒BLV判定牛的白血病發(fā)病可能性或抗性時所應用的引物對，包括(a)A引物5′-GGAATTCCTCTCTCTGCAGCACATTTCCT-3′(b)B引物5′-AAGTCGACCGCTGCACAGTGAAACTC-3′。
12．針對牛白血病病毒BLV，判定牛的白血病發(fā)病可能性或抗性時所應用的引物對，包括(a)從A引物5′-GAGTGTCATTTCTTCAACGGGAC-3′5′-GGAGAAGAGTTCGTGCGCTTCGA-3′及5′-GGAATTCCTCTCTCTGCAGCACATTTCCT-3′所組成的引物組中選擇的引物；及(b)B引物5′-AAGTCGACCGCTGCACAGTGAAACTC-3′。
全文摘要
針對牛白血病病毒BLV,判定牛的白血病發(fā)病可能性的方法,即判定牛的牛MHCⅡDRβ鏈的β1結構域的75—78號氨基酸表示的為氨基酸序列Val-Asp-Thr-Tyr的個體,具有白血病發(fā)病可能性;以及針對牛白血病病毒BLV,判定牛的白血病發(fā)病抵抗的方法,即牛的牛MHCⅡDRβ鏈的β1結構域的78號氨基酸為氨基酸Val的個體,判定具有白血病發(fā)病抗性。
文檔編號C12Q1/68GK1230228SQ9719780
公開日1999年9月29日 申請日期1997年7月17日 優(yōu)先權日1996年7月19日
發(fā)明者間陽子 申請人:理化學研究所 被以下專利引用 (1),