專(zhuān)利名稱(chēng):采用雜交測(cè)定人體t細(xì)胞白血病病毒i和ii的制作方法
本發(fā)明涉及一種測(cè)定病毒中的核苷酸順序是否存在的方法，該病毒涉及人體T細(xì)胞白血病病毒Ⅰ型和Ⅱ型(HTLVⅠ和Ⅱ)。本發(fā)明還涉及一種用于在引物和標(biāo)記的雜交探針存在下的這樣測(cè)定的裝置。
人們已知道，某些T細(xì)胞腫瘤的發(fā)病機(jī)理中涉及到一族T細(xì)胞熱帶還原病毒，稱(chēng)為人體T細(xì)胞白血病病毒(HTLV)。目前，已知道有三種類(lèi)型的HTLV。第一，Ⅰ型(HTLVⅠ)是一種腫瘤病毒，它和在日本、加勒比海地區(qū)和非洲所發(fā)現(xiàn)的人類(lèi)成年人T細(xì)胞白血病淋巴細(xì)胞瘤(ATLL)有密切的聯(lián)系。第二，Ⅱ型(HTLVⅡ)是一種腫瘤病毒，它是從具有毛發(fā)狀細(xì)胞白血病的T細(xì)胞變株的兩個(gè)病人中分離出來(lái)的。參見(jiàn)M.Popovic等，《Science》224卷497～500頁(yè)(1984)和Rosenblatt，J.D等，New Eng.J.of Med.，8月號(hào)(1986)。第三，Ⅲ型(HTLVⅢ)是一種慢病毒，是一種引起艾滋病(AIDS)的病原體，艾滋病是一種會(huì)傳染的細(xì)胞免疫系統(tǒng)的疾病，會(huì)引起常是致命的感染。
用對(duì)付HTLV相關(guān)病毒，如艾滋病的抗體鑒定血清的免疫診斷試驗(yàn)(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第4，520，113號(hào)，Gallo等)正在血庫(kù)中被用于排除潛在感染的血液。也可參見(jiàn)WO86/01834，1986年3月27日公布(加利福尼亞大學(xué))，它是用在制備單克隆抗體中有用的還原病毒多肽去測(cè)定HTLV族中的還原病毒。因?yàn)檫@種病毒屬于一種不產(chǎn)生有效數(shù)量病毒顆粒的DNA復(fù)制品，一種測(cè)定HTLVⅠ和Ⅱ型有關(guān)的病毒的直接免疫方法用于很大部分的無(wú)征狀個(gè)體持久感染被證明是不成功的。因?yàn)樵诟腥窘M織和血液中病毒顆粒的數(shù)量可能是很少的(因?yàn)椴《镜男菝?，病毒顆粒或RNA/DNA的直接測(cè)定可能是相當(dāng)困難的，如果不是辦不到的話，不要把感染細(xì)胞與合適的T細(xì)胞系進(jìn)行共同培養(yǎng)。
美國(guó)專(zhuān)利第4，683，202號(hào)(1987年7月28日公布)中，K.Mullis描述了一種通過(guò)采用一種標(biāo)記的RNA或DNA雜交探針?lè)糯蠛怂犴樞蛞源龠M(jìn)測(cè)定的方法。在這個(gè)方法中，引物被用于得到引物延長(zhǎng)產(chǎn)物，該延長(zhǎng)產(chǎn)物用作核苷酸存在下合成附加的互補(bǔ)鏈的模板。該專(zhuān)利申請(qǐng)案中也描述了一種技術(shù)，即在探針被雜交至所需要的順序上以后，再加上一種限制性?xún)?nèi)切酶以使在所需要的順序內(nèi)的某一位置上裂解雜化物，然后對(duì)限制性消化進(jìn)行分析以了解標(biāo)記片斷。美國(guó)專(zhuān)利第4，683，194(1987年7月28日公布)，以及《生物技術(shù)》第3卷1008～1012頁(yè)(1985)中H.Erlich等和Saiki等寫(xiě)的文章中，更詳細(xì)地描述了這一后種技術(shù)。兩個(gè)專(zhuān)利申請(qǐng)案中都列舉了測(cè)定遺傳病，如鐮狀細(xì)胞貪血和β-地中海貪血癥的方法的應(yīng)用。這些方法和用于擴(kuò)增核酸順序的方法在《Science》第230卷。1350～1354頁(yè)(1985)中，Saiki等著的文章中也揭示過(guò)。
《Clin.Lab.Med》(1985)第五期。513～529頁(yè)上Landry等寫(xiě)的綜述文章中描述了核酸雜交領(lǐng)域用于病毒測(cè)定。WO86/01535(1986年3月13日公告)和歐洲專(zhuān)利173，529號(hào)(1986年3月5日公告)中都揭示3HTLVⅢ的分子的克隆和利用克隆作為探針測(cè)定艾滋病。更進(jìn)一步地，歐洲專(zhuān)利公告173，339號(hào)(1986年3月5日公告)中，揭示了用DNA探針測(cè)定被外來(lái)微生物感染的遺傳分析。歐洲專(zhuān)利185，444號(hào)(1986年6月25日公告)中，揭示了一種重組肽作為探針用于測(cè)定細(xì)胞溶解產(chǎn)物中的HTLVⅢ病毒。翁蘇公司(Qncor Inc.)在1986年9月宣布它發(fā)展了一種放射血液試驗(yàn)測(cè)定艾滋病毒。
用于測(cè)定腫瘤病毒HTLVⅠ和Ⅱ的雜交探針可能鑒定被持久感染，但不產(chǎn)生病毒的那些個(gè)人，也可能鑒定抗體陰性，但培養(yǎng)物陽(yáng)性的個(gè)人，而且測(cè)定感染的細(xì)胞不需要培養(yǎng)病毒。用擴(kuò)增法增加病毒的核酸的復(fù)制數(shù)將有利于鑒定在被感染個(gè)體中病毒的核酸。
本發(fā)明包括一種測(cè)定或檢驗(yàn)核酸順序是否存在的方法，所述核酸順序是指大量存在于HTLVⅠ或HTLVⅡ核酸的分離體中，或大量存在于HTLVⅠ和HTLVⅡ核酸兩者的分離體中，這種方法對(duì)于測(cè)定HTLVⅠ或HTLVⅡ的核酸或HTLV和HTLVⅡ兩者分離體中的核酸是特別有效的，該方法包括(a).用核酸順序的每條鏈的寡核苷酸引物、四種不同的核苷三磷酸和一種聚合作用劑在雜交條件下，一起或分別處理樣品，對(duì)核苷順序的每條鏈，合成每個(gè)引物的延長(zhǎng)物，它是與每條核酸鏈互補(bǔ)的，其中所說(shuō)的引物基本上與待測(cè)定或檢驗(yàn)的核酸順序的每一鏈互補(bǔ)，以每一個(gè)引物合成的延長(zhǎng)物，當(dāng)它從它的補(bǔ)體中分離時(shí)，可作為其他引物的延長(zhǎng)產(chǎn)物合成的模板;
(b).在變性條件下處理樣品;
(c).用寡核苷酸引物處理步驟(b)中的產(chǎn)物，將步驟(b)中所產(chǎn)生的單鏈作為模板合成引物延長(zhǎng)產(chǎn)物，結(jié)果擴(kuò)增了一個(gè)或多個(gè)特定核苷順序，如果它或它們是存在的話;和(d).測(cè)定樣品中的待測(cè)的順序是否存在。
測(cè)定產(chǎn)物的一種方法是向步驟(c)的產(chǎn)物中加入一種能與擴(kuò)增的核酸順序雜交的標(biāo)記探針;并測(cè)定探針是否已經(jīng)與核酸樣品的擴(kuò)增順序雜交了。在一個(gè)具體實(shí)施例中，這樣的測(cè)定可以以下列方式來(lái)進(jìn)行(1).用一種可識(shí)別在探針中的核酸順序中的某一位置的限制性?xún)?nèi)切酶消化雜交的混合物;和
(2).測(cè)定限制性消化物是否有與HTLVⅠ或HTLVⅡ順序的存在相關(guān)的限制性片斷。
在步驟(a)以前，病人樣品中的核酸可能被抽出來(lái)，因此，待處理的樣品實(shí)際上是一種抽提出的核酸的混合物。另外，步驟(a)中的待處理的樣品不要預(yù)先進(jìn)行這樣的過(guò)程，即樣品中的病毒是在培養(yǎng)。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及了一種測(cè)定或檢驗(yàn)核酸順序是否存在的裝置，所述的核酸是大量存在于HTLVⅠ或HTLVⅡ核酸分離體中，或大量存在于HTLVⅠ和HTLVⅡ兩者的分離體中的核酸，該裝置對(duì)于HTLVⅠ或HTLVⅡ的核酸或HTLVⅠ和HTLVⅡ兩者的分離體中核酸是有效的，核酸順序被懷疑是包含在樣品中，該裝置包括(a).對(duì)于待測(cè)核酸順序的每一條鏈，有一個(gè)寡核苷酸引物，一種或多種引物基本上是與每個(gè)特殊的核酸順序的每條鏈互補(bǔ)，因此，從一種引物合成的一種延長(zhǎng)產(chǎn)物，當(dāng)延長(zhǎng)產(chǎn)物從補(bǔ)體中分離出來(lái)時(shí)，可作為合成其它引物的延長(zhǎng)產(chǎn)物的模板;和(b).一種能與核酸順序雜交的標(biāo)記探針。
最好是，該裝置也包含一種聚合作用劑，四種不同的核苷酯和一種用于測(cè)定探針和核酸順序是否雜交的工具。
這里的試驗(yàn)裝置也可用于研究試驗(yàn)，臨床試驗(yàn)和其他的診斷應(yīng)用。另外，它也可以用于測(cè)定感染細(xì)胞而無(wú)需培養(yǎng)病毒，它在檢查用于消除傳染的各種治療劑治療病人也是有用的。
本發(fā)明涉及測(cè)定或檢驗(yàn)核酸順序的一種方法和一種裝置，所述核酸順序與被懷疑含有該順序的核酸樣品中的HTLVⅠ和HTLVⅡ病毒的任一種或兩種是相關(guān)的。對(duì)HTLVⅠ和HTLVⅡ病毒的分離體已被定好順序。待擴(kuò)增的順序必定對(duì)HTLVⅠ和HTLVⅡ病毒是特異的，即不與HTLVⅢ或其他的非HTLVⅠ或Ⅱ病毒起反應(yīng)。
HTLVⅠ病毒的完整基因組已為Seiki等在《Proc Natl Acad Sci》美國(guó)第80卷3618～3622頁(yè)(1983)中描述過(guò)。HTLVⅡ病毒的完整基因組則由Shimotohno等在《Proc Natl Acad Sci》美國(guó)第82卷3101～3105(1985)中描述過(guò)。
“大量存在于”一詞應(yīng)用于待測(cè)順序意味著該核酸順序一定是足夠地與待測(cè)的病毒的核酸互補(bǔ)，以至少在室溫，聚合作用劑和四種核苷三磷酸存在下激發(fā)聚合作用。
所使用的引物是一種任意長(zhǎng)度和順序的寡核苷酸，目的是在HTLVⅠ和Ⅱ或HTLVⅠ或Ⅱ病毒中的顯著數(shù)量的核酸上專(zhuān)門(mén)激發(fā)聚合作用。尤其是，這里所使用的“引物”一詞是一種由兩個(gè)或兩個(gè)以上脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子，最好是三個(gè)以上，當(dāng)處在一些條件下，它能起著合成激發(fā)點(diǎn)的作用，在一定條件下，即在核苷三磷酸和聚合作用劑(如DNA聚合酶)存在下，在適當(dāng)溫度和PH下，它可誘發(fā)基本與核酸鏈互補(bǔ)的引物延長(zhǎng)產(chǎn)物的合成。引物最好是單鏈的，以擴(kuò)增得到最高的效率，但也可采用雙鏈。如果是雙鏈的，引物在被用于制備延長(zhǎng)產(chǎn)物以前，首先要自行處理，以把它的鏈分開(kāi)。最好是，引物是寡脫氧核糖核苷酸。引物必須有足夠長(zhǎng)以在聚合誘導(dǎo)劑的存在下觸發(fā)延長(zhǎng)產(chǎn)物的合成。引物的確切長(zhǎng)度將取決于很多因素包括溫度、緩沖液、核苷酸組份和引物來(lái)源。為了達(dá)到發(fā)明的目的，寡核苷酸引物較典型的是含有15～25或更多的核苷酸，盡管它可能包含較少的核苷酸。
這里，所選擇的引物基本上是與被擴(kuò)增的特殊順序的每條鏈互補(bǔ)的。這就意味著引物必須是可足夠互補(bǔ)的，以在一定的條件下，允許聚合作用劑起作用，能和它們各自的鏈雜交，也就是說(shuō)，引物必須與要擴(kuò)增的鏈的順序足夠互補(bǔ)，以此雜交和形成一種用于合成其他引物的延長(zhǎng)產(chǎn)物的模板。引物可能含有一些與鏈的錯(cuò)誤配段。
可以選擇被擴(kuò)增的順序是取自大量存在于HTLVⅠ和HTLVⅡ病毒的區(qū)。因此，引物和探針可以用任何適宜的裝置加以鑒定和選擇。這種步驟可用人工方法比較HTLVⅠ和HTLV病毒基因組的核苷酸順序的區(qū)來(lái)進(jìn)行。在HTLVⅠ和HTLVⅡ病毒的X區(qū)之間的核苷酸順序同源性已在Shimotohno等《Proc Natl Acad Sci》美國(guó)第81卷6657～6661(1984)著的文中描述過(guò)。另一個(gè)方法是用計(jì)算機(jī)程序比較所述核酸順序。為了達(dá)到目的，可以方便地應(yīng)用國(guó)立生物醫(yī)學(xué)研究基金會(huì)所提供的基礎(chǔ)計(jì)算機(jī)算的商業(yè)程序，使用點(diǎn)陣式模型。這種程序包括輸入HTLVⅠ和Ⅱ病毒的核苷酸順序和規(guī)定堿基對(duì)同源性窗尺寸。該程序使用了圖解法來(lái)比較不同軸上的核酸順序，一個(gè)點(diǎn)出現(xiàn)在哪里，那里至少是實(shí)際的同源性。最好是，窗的尺寸大于6個(gè)堿基。
基因組中的X區(qū)大多數(shù)存在于兩種病毒的密碼區(qū)之中。因?yàn)檫@個(gè)X區(qū)大多數(shù)存在于密碼區(qū)之中，它是最好區(qū)，從中可選擇引物和用于測(cè)定順序的探針。不為蛋白質(zhì)編碼的病毒基因組的區(qū)也可以用于確定被用的引物的順序。為了達(dá)到最高靈敏度和最大的專(zhuān)一性的目的，待測(cè)定的順序與長(zhǎng)度足夠允許專(zhuān)一接觸抗原并大量存在于有關(guān)病毒中的順序是同源的，如果應(yīng)用一種探針和限制性?xún)?nèi)切酶，尤其是在限制裂解部位的情況是這樣的。
用于擴(kuò)增和此后測(cè)定產(chǎn)物的技術(shù)已在上述美國(guó)專(zhuān)利第4，683，201號(hào)和第4，683，194中詳細(xì)描述過(guò)，Saiki等《Biotechnology，supra》和Saiki等，《Sciene supra》中也描述過(guò)。通常，擴(kuò)增過(guò)程包括一個(gè)酶促鏈反應(yīng)，以所涉及反應(yīng)步驟數(shù)相對(duì)應(yīng)的指數(shù)增長(zhǎng)速率制備一種特定的核酸順序，對(duì)所要求的順序的末端情況應(yīng)足夠詳細(xì)地知道，以使寡核苷酸引物可以被合成，并雜交到順序的末端，少量的鏈順序可有效地引發(fā)鏈反應(yīng)。一種引物是與負(fù)(-)鏈互補(bǔ)的，另一引物是與正(+)鏈互補(bǔ)的，用酶，如DNA聚合酶Ⅰ(klenow)的大片斷和核苷酸將引物退火到變性的核酸后延長(zhǎng)，結(jié)果得到新合成的含有靶的正(+)和負(fù)(-)鏈。因?yàn)檫@些新合成的順序也是引物的模板，周期性地重復(fù)變性、引物退火和延長(zhǎng)，結(jié)果引起由引物所限定的區(qū)指數(shù)累積。鏈反應(yīng)的產(chǎn)物將是一個(gè)獨(dú)立的核酸雙鏈，它的終端是與所使用的特定的引物的終端相對(duì)應(yīng)的。
擴(kuò)增過(guò)程可用圖解法說(shuō)明，在那里，由互補(bǔ)鏈[S+]和[S-]組成的含有所需要的順序[S]的雙鏈DNA可被用作核酸。在第一和每一個(gè)后面的反應(yīng)周期內(nèi)，在原先模板上的每個(gè)寡核苷酸的延長(zhǎng)將產(chǎn)生一新的無(wú)限長(zhǎng)度的SSDNA分子產(chǎn)物，這一DNA分子產(chǎn)物長(zhǎng)度是以引物的一個(gè)引物中止。這些產(chǎn)物此后稱(chēng)為“延長(zhǎng)產(chǎn)物”，將以線性方式累積;即任意次周期后存在的數(shù)量將與周期數(shù)成正比。
由此所產(chǎn)生的長(zhǎng)產(chǎn)物在隨后的周期中可作為寡核苷酸引物的一種或另一種的模板，并將產(chǎn)生所需要的順序[S+]或[S-]的分子。這些分子也可以起著寡核苷酸引物的一種或另一種的模板作用，繼續(xù)產(chǎn)生[S+]或[S-]的分子。這些分子也可以起著寡核苷酸引物的一種或另一種的模板作用，繼續(xù)產(chǎn)生[S+]和[S-]，因此，鏈反應(yīng)可以維持，它將以與周期數(shù)相對(duì)的指數(shù)速度累積。
由寡核苷酸雜交作用所形成的副產(chǎn)物不同于想要的產(chǎn)物，它們是不能自我催化，因此，它們是以線性速度累積的。
要擴(kuò)增的特定順序[S]可以用圖解表示[S+] 5′AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCC 3′[S-] 3′TTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGG 5′適當(dāng)?shù)墓押塑账嵋锸?br>引物1 3′GGGGGGGGGG 5′引物2 5′AAAAAAAAAA 3′因此，如果含[S]的DNA....ZZZZZZZZZZZZZZZZAAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzzzzzzzz....
....ZZZZZZZZZZZZZZZZTTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGGzzzzzzzzzzzzzzzz....
被分離為單鏈和它的單鏈被雜交到引物1和2上，下列的延長(zhǎng)反應(yīng)可以在四種脫氧核糖核苷三磷酸存在下，由DNA聚合酶催化而進(jìn)行3′ 5′延長(zhǎng)物←GGGGGGGGGG 引物1....zzzzzzzzzzzzzzzzAAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzzzzzzzz....
初始模板鏈+初始模板鏈-....zzzzzzzzzzzzzzzzTTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGGzzzzzzzzzzzzzzzz....
引物2 AAAAAAAAAA→延長(zhǎng)物5′ 3′在形成的雙鏈的變性作用時(shí)，產(chǎn)物是3′ 5′....zzzzzzzzzzzzzzzzTTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGG新合成的長(zhǎng)的產(chǎn)物15′ 3′....zzzzzzzzzzzzzzzzAAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzzzzzzzz....
初始模板鏈+
3′ 5′....zzzzzzzzzzzzzzzzTTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGGzzzzzzzzzzzzzzzz....
初始模板鏈-5′ 3′AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzzzzzzzz....
新合成的長(zhǎng)產(chǎn)物2如果這四種鏈被允許在下一個(gè)周期中與引物1和2重新雜交的話，那么聚合作用劑將催化下面的反應(yīng)引物2 5′AAAAAAAAAA→延長(zhǎng)到此3′....zzzzzzzzzzzzzzzzTTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGG 5′新合成的長(zhǎng)產(chǎn)物1延長(zhǎng)物←GGGGGGGGGG 5′ 引物15′....zzzzzzzzzzzzzzAAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzzzzzz....3′初始模板鏈+引物2 5′AAAAAAAAAA→延長(zhǎng)物3′....zzzzzzzzzzzzzzzzzzzTTTTTTTTTTYYYYYYYYYGGGGGGGGGGzzzzzzzzzz....5′初始模板鏈-延長(zhǎng)到此←GGGGGGGGGG 5′ 引物15′AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzzzzzzzz..3′新合成的長(zhǎng)產(chǎn)物2
如果上述四種雙鏈可被分離，就將發(fā)現(xiàn)下面的鏈5′AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCC 3′新合成的[S+]3′....zzzzzzzzzzzzzzzzzzzTTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGG 5′第1個(gè)周期中合成的長(zhǎng)產(chǎn)物13′....zzzzzzzzzzzzzzzzzzzTTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGG 5′新合成的長(zhǎng)產(chǎn)物15′....zzzzzzzzzzzzzzzzzzzAAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzz....3′初始模板鏈+5′AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzzzzzzzz...3′新合成的長(zhǎng)產(chǎn)物23′..zzzzzzzzzzzzzzzTTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGGzzzzzzzzzzzzzzzz...5′初始模板鏈-3′TTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGG 5′新合成的[S-]5′AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCzzzzzzzzzzzzzzz...3′第一周期中合成的長(zhǎng)產(chǎn)物2可見(jiàn)，以一個(gè)引物的寡核苷酸順序和另一引物的互補(bǔ)順序中止的每條鏈?zhǔn)潜簧a(chǎn)的所需要的特定核酸順序[S]。
這個(gè)工藝的步驟可以無(wú)限地重復(fù)，它僅由引物1和2，誘導(dǎo)物和核苷酸存在的數(shù)量所限制。初始的核酸數(shù)量在整個(gè)過(guò)程中保持恒定，因?yàn)樗槐粡?fù)制。長(zhǎng)產(chǎn)物的數(shù)量呈線性增加，因?yàn)樗鼈冎粡某跏己怂嶂挟a(chǎn)生。特定順序的數(shù)量呈指數(shù)增長(zhǎng)。因此，特定的順序?qū)⒆優(yōu)橹饕姆N類(lèi)，這在下面的表中加以說(shuō)明，它表示在幾個(gè)周期后，理論上存在的這一特別順序種類(lèi)的相對(duì)量，假定每個(gè)周期中效率為100%在0～n次周期后的雙鏈數(shù)目周期數(shù) 模板 長(zhǎng)產(chǎn)物 特殊順序[S]0 - 1 -1 1 1 02 2 1 13 3 1 45 5 1 2610 10 1 101315 15 1 32，75220 20 1 1，048，555n n 1. (2n-n-1)當(dāng)把一個(gè)單鏈核酸用作為模板時(shí)，每個(gè)周期中只形成一個(gè)長(zhǎng)產(chǎn)物。
這里所用的術(shù)語(yǔ)“核酸限制性?xún)?nèi)切酶”和“限制性?xún)?nèi)切酶”系指一些細(xì)菌酶，它們能在或靠近一特定核苷酸順序上切斷雙鏈DNA。
這里的引物可能由下列指標(biāo)來(lái)選擇，它們是供考慮的因素，但不是唯一的或決定的因素。首先，引物可以從存在于HTLVⅠ和HTLVⅡ基因組的區(qū)中選擇。X區(qū)是存在于密碼區(qū)，因此，X區(qū)被選出來(lái)作初始研究。其次，引物缺乏與可能影響試驗(yàn)的病毒基因組的任何順序的同源性，例如，HTLVⅢ中的順序已在《Science》第227卷538～540頁(yè)(1985)中，由Starcich等描述的。
第三，引物最好是在擴(kuò)增的核酸中缺乏二級(jí)結(jié)構(gòu)形成，二級(jí)結(jié)構(gòu)可能干擾通過(guò)擴(kuò)增酶，如大腸桿菌DNA聚合酶的延長(zhǎng)，DNA聚合酶的部分最好是Klenow片斷。這可以通過(guò)在擴(kuò)增培養(yǎng)基中應(yīng)用約15%(按重量計(jì))，最好是5～10%(按重量計(jì))的二甲基氧化硫(DMSO)和把擴(kuò)增溫度提高到30～40℃，最好為35～40℃或把擴(kuò)增溫度提高到30～40℃，最好為35～40℃來(lái)實(shí)現(xiàn)。
第四，引物最好具有約50%含量的鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶，在引物的3′末端不含有多位相連的腺嘌呤和胸腺嘧啶基，它們可能引起雜交不穩(wěn)定。最后，如果擴(kuò)增產(chǎn)物是用限制性?xún)?nèi)切酶來(lái)測(cè)定，探針必須有一個(gè)內(nèi)部的(不是末端)限制性部位。
寡核苷酸引物可采用任何適當(dāng)?shù)姆椒▉?lái)制備，如采用上面描述的磷酸三酯和磷酸二酯法，或自動(dòng)實(shí)施法。自動(dòng)實(shí)施法中，二乙基磷酰胺亞酯被用作原材料，并用Beaucage等在《Tetrahedron Letters》第22卷，1859～1862頁(yè)中描述的方法合成，在改進(jìn)的載體上合成寡核苷酸的一種方法已在美國(guó)專(zhuān)利第4，458，066號(hào)中描述過(guò)。也可以采用一種生物源(如核酸限制內(nèi)切酶消化物)分離出來(lái)的引物。
任何純化或非純化形式的核酸源可以被用于啟動(dòng)一個(gè)或多個(gè)核酸，使核酸源含有或被懷疑含有與HTLVⅠ和HTLVⅡ或HTLVⅠ或HTLVⅡ有關(guān)的特定核酸順序。因此，這個(gè)過(guò)程也可以應(yīng)用如含信使RNA的DNA或RNA，其中DNA或RNA可以是單鏈或雙鏈的。在這過(guò)程中，RNA可被用作模板，用于把模板逆轉(zhuǎn)錄到DNA的制備，酶和/或最佳條件也被應(yīng)用。此外，也可采用含有每條鏈中一條鏈的DNA-RNA雜種體。也可使用這些核酸的任何的混合物，用相同的引物或不同的引物從先前的擴(kuò)增反應(yīng)生產(chǎn)核酸也可應(yīng)用。待擴(kuò)增的特定核酸順序可能只是大分子的一部分或初步可被看作一個(gè)個(gè)別分子，因此，特定的順序組成了完整的核酸。要擴(kuò)增的順序最初不需要是純的形式;它可能是復(fù)雜的混合物中的一個(gè)極小的部分，如在整個(gè)人DNA中所含的病毒編碼基因的一部分。啟動(dòng)核酸可能含有一種以上所需要的特定核酸順序，它們可能是相同的，也可以不同。因此，本方法不僅對(duì)于一種特定核酸順序的大量產(chǎn)生是有用的，而且對(duì)位于相同或不同的核酸分子上同時(shí)擴(kuò)增一種以上不同的特定核苷酸順序也是有用的。
核酸可以得自任何來(lái)源，如從高等有機(jī)體，象動(dòng)物體中的自然DNA或RNA。DNA或RNA可以用Maniatis等在《Molecular Cloning∶A Laboratory Manual》(紐約Cold Spring Harbor Laboratory 1982)，280～281頁(yè)中描述的各種技術(shù)，從體內(nèi)樣品，如血液、組織材料，如絨膜-絨毛、或羊膜細(xì)胞抽提得到。
如果樣品是不純的，如血漿、血清或血液，在擴(kuò)增以前，要用可有效地打開(kāi)樣品的細(xì)胞，液體，組織，病毒衣殼或動(dòng)物細(xì)胞膜，并可有效地暴露和/或分離核酸鏈的一定量的試劑處理。該暴露和分離鏈的細(xì)胞素和核酸變性步驟將使擴(kuò)增更迅速進(jìn)行。此外，在用擴(kuò)增試劑處理樣品以前，HTLVⅠ和HTLVⅡ病毒不需要放在樣品中培養(yǎng)。樣品可能被離心分離以得到淡黃色的外殼，然后再通過(guò)一根柱以得到白細(xì)胞。然后對(duì)白細(xì)胞再進(jìn)行處理以提取核酸，用作被擴(kuò)增的樣品。
任何特定的核酸順序都可以用這個(gè)方法得到。必須做到的是順序的兩個(gè)末端的堿基數(shù)要有足夠詳細(xì)了解，使得兩個(gè)寡核苷酸引物可以被制備，然后雜交到所需要的順序的不同鏈上并處在沿著順序的相對(duì)位置上，當(dāng)它從它的模板(互補(bǔ)體)分離時(shí)，從一個(gè)引物合成的一個(gè)延長(zhǎng)產(chǎn)物，它可以作為把另一個(gè)引物延長(zhǎng)至一定長(zhǎng)度核酸的模板。關(guān)于順序末端的堿基了解得越徹底，引物對(duì)于靶核酸順序的專(zhuān)一性就越強(qiáng)，因此，方法的效率也就越高。我們可以了解，在下文中所使用的引物是一個(gè)以上的，尤其是，在有關(guān)要擴(kuò)增的順序末端的資料還有一些不明確的情況下。例如，如果核酸順序是從蛋白質(zhì)順序信息中推論得到的話，那么含有代表以遺傳密碼簡(jiǎn)并為基礎(chǔ)的所有可能的密碼變化的順序的引物的收集物將被用于每條鏈。這種收集物的一個(gè)引物實(shí)際上將連接至要擴(kuò)增的需要的順序的末端。
通過(guò)采用含有那個(gè)順序的核酸所生產(chǎn)的特定核酸順序作為模板。如果樣品的靶核酸順序含有兩股鏈，那么，在它被用作模板之前，或者作為獨(dú)立的步驟或與合成引物延長(zhǎng)產(chǎn)物同時(shí)進(jìn)行時(shí)，必須將核酸鏈分離。這種鏈分離可以采用任何適宜的變性條件進(jìn)行，包括物理的、化學(xué)的或酶方法，這里使用的詞“變性”包括所有上述條件下的變性，分離核酸鏈的一種物理方法是把核酸加熱至它變性。典型的熱變性包括溫度范圍約為“80～105℃”，時(shí)間約為1～10分鐘。鏈分離也可以由一種酶促使，這種酶是從稱(chēng)為解螺旋酶或RecA酶中選出來(lái)的，后者具有解螺旋酶的活性，在核糖ATP的存在下可使DNA變性。用解螺旋酶分離核酸鏈的合適的反應(yīng)條件已由Kuhn Hoffmann-Berling在《CSH-Quentitative Biology》第43卷63頁(yè)(1978)中描述過(guò)，而采用RecA的技術(shù)則由C.Radding在《Ann.Rev.Genetics》第16卷，405～437頁(yè)(1982)中作過(guò)綜述。
如果含有要擴(kuò)增的順序的最初的核酸是單鏈的話，它的補(bǔ)體可通過(guò)向那里加入一或二個(gè)寡核苷酸引物來(lái)合成。如果一個(gè)合適的單個(gè)引物被加入，在下面描述的引物、聚合作用劑和四種核苷三磷酸存在下，就可合成引物的延長(zhǎng)產(chǎn)物。該產(chǎn)物將與單鏈的核酸互補(bǔ)，并與該核酸鏈雜交形成鏈不等長(zhǎng)的雙鏈，然后，它們可再被分離為單鏈，象如上描述的那樣，產(chǎn)生兩條單一的獨(dú)立的互補(bǔ)鏈。另一種方法是，兩種合適的引物被加到單鏈核酸上，再進(jìn)行反應(yīng)。
如最初的核酸構(gòu)成要擴(kuò)增的順序，那么，所產(chǎn)生的引物延長(zhǎng)產(chǎn)物將完全地或基本上完全地與最初的核酸鏈互補(bǔ)，并雜交形成等長(zhǎng)的雙鏈，等長(zhǎng)的兩條鏈再被分離為獨(dú)立的鏈分子。
當(dāng)一種核酸或幾種核酸的互補(bǔ)鏈被分離時(shí)，不管核酸最初是雙鏈還是單鏈的，這些鏈都準(zhǔn)備用作為附加的核酸鏈合成的模板。這種合成是在允許引物與模板雜交的條件下進(jìn)行的。通常，這種合成是在較佳PH為7～9，最佳PH為8的緩沖溶液中進(jìn)行。最好是，兩種寡核苷酸引物以克子過(guò)量(用于基因組核酸時(shí)，引物與模板比例約為108∶1)的量被加入含有分離的模板鏈的緩沖液中。我們應(yīng)該知道，如果這樣的方法被用于診斷的話，互補(bǔ)鏈的數(shù)量不可能了解，因此，與互補(bǔ)鏈數(shù)量相對(duì)的引物的量也不能確切地確定。但是，從實(shí)踐來(lái)看，當(dāng)要擴(kuò)增的順序包含在一條復(fù)雜的長(zhǎng)鏈核酸鏈的混合物時(shí)，加入引物的量通常是克分子過(guò)量于互補(bǔ)鏈模板的量，克分子過(guò)量大，可提高這種方法的效率。
脫氧核糖核苷三磷酸dATP，dCTP，dGTP和TTP也被加到合成的混合物之中，可以與引物一起加入或分開(kāi)加入，加入的量要合適，這樣所得到的溶液再被加熱到約90～100℃，約1～10分鐘，最佳為1～4分鐘。在這一加熱時(shí)間后，溶液再冷卻至適于引物雜交的室溫。往冷卻的混合物中加入可促進(jìn)引物延長(zhǎng)反應(yīng)的一種合適的作用劑(該作用劑稱(chēng)為聚合作用劑)，這種反應(yīng)可在已知技術(shù)的條件下進(jìn)行。如果聚合作用劑是熱穩(wěn)定的，則它可和其它的試劑一起加入。這種合成反應(yīng)可以在室溫到某一溫度下進(jìn)行，超過(guò)某一溫度，聚合作用劑不再起作用。例如，如果DNA聚合酶作為作用劑，溫度通常不高于40℃。最合適的是，反應(yīng)在室溫下進(jìn)行。
聚合作用劑可以是任何的化合物或體系，它能促進(jìn)完成引物延長(zhǎng)產(chǎn)物的合成，聚合作用劑包括酶類(lèi)。用于此目的合適的酶包括大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ、大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片斷、T4 DNA聚合酶，其它有效的DNA聚合酶、聚合酶突變蛋自、逆轉(zhuǎn)錄酶和其它的酶，包括熱穩(wěn)定酶(即這些酶在溫度提高到足夠引起變性后，還可促使引物延長(zhǎng))，它們將促使核苷酸以合適的方式組合，以形成與每一個(gè)核酸單鏈互補(bǔ)的引物延長(zhǎng)產(chǎn)物。通常，該合成反應(yīng)是在每一個(gè)引物的3′末端開(kāi)始，然后沿著模板鏈的5′末端進(jìn)行，直至合成終端，產(chǎn)生了不同長(zhǎng)度的分子。采用上述同樣的方法，可能還有些聚合作用劑參與，但合成反應(yīng)是在5′末端開(kāi)始，沿另一方向進(jìn)行。
在上述的雜交條件下，如果靶順序存在下，新合成的鏈和它的補(bǔ)體核酸鏈將形成一個(gè)雙鏈分子，該雜交物被用于該方法的以后的步驟。在下一步，在雜交條件下處理的樣品被置于變性條件下，使用任何上面描述的方法，在靶順序存在下，可提供單鏈的分子。
新的核酸是在單鏈分子上被合成。如果必要的話，可以加入另外的聚合作用劑、核苷酸和引物，以使反應(yīng)在如上描述的條件下進(jìn)行。同樣，合成反應(yīng)可在每個(gè)寡核苷酸引物和一個(gè)末端開(kāi)始，沿著模板單鏈進(jìn)行以產(chǎn)生附加的核酸。在這步以后，延長(zhǎng)產(chǎn)物的一半將由兩個(gè)引物結(jié)合的特定核酸順序組成。
在需要將靶核酸擴(kuò)增到用于測(cè)定所必需的程度時(shí)，變性和延長(zhǎng)產(chǎn)物合成的步驟常?？梢灾貜?fù)。如以下將進(jìn)一步詳細(xì)描述的那樣，所產(chǎn)生特定核酸順序的數(shù)量將以指數(shù)方式累積。
當(dāng)希望從第一個(gè)核酸或核酸混合物產(chǎn)生一個(gè)以上的核酸順序時(shí)，可以采用適當(dāng)數(shù)量的不同的寡核苷酸引物。例如，如果產(chǎn)生兩種不同的特定核酸時(shí)，要使用四種引物。其中兩種引物對(duì)于特定核酸順序中的一個(gè)順序是專(zhuān)一的，另外兩種引物對(duì)于第二個(gè)特定核順序是專(zhuān)一的。以這種方式，兩種不同特定順序中的每一種都可以用本發(fā)明方法指數(shù)方式累積。
本發(fā)明也可以分步的方式進(jìn)行，每一步后加入新試劑，或同步進(jìn)行，所有的試劑在初始步驟中一步加入，或部分分步和部分同時(shí)進(jìn)行，即在一定數(shù)目的步驟后，加入新試劑。如果一種變性方法，如加熱法被使用，它將使聚合作用劑失效，正如用熱不穩(wěn)定酶作聚合作用劑就是這樣;這樣一來(lái)就有必要在每一個(gè)鏈分離步驟之后，補(bǔ)充聚合作用劑。當(dāng)一個(gè)酶的方法被用于鏈分離步驟時(shí)，可使用同時(shí)進(jìn)行法。在同時(shí)進(jìn)行法中，除了含有所需要的順序的核酸鏈外，反應(yīng)混合物還可能含有鏈分解酶(如解螺旋酶)，用于鏈分解酶的適當(dāng)?shù)哪茉?，如r ATP，四種核苷三磷酸、克分子過(guò)量的寡核苷酸引物以及聚合作用劑，如大腸桿菌DNA聚合酶1的Klenow片斷。
如果在同時(shí)進(jìn)行法中，把熱用于變性，則熱穩(wěn)定劑，如熱穩(wěn)定的聚合酶可以使用，它在高的溫度下使用，最好采用50～105℃，視作用劑而定，在該溫度下，核酸將由處于平衡態(tài)的單鏈和雙鏈組成。如果核酸長(zhǎng)度較短，那么，較低的溫度，如40～50℃就可以了。溫度的提高取決于在該溫度下，酶是否降解或超過(guò)該溫度，不足水平的引物雜交是否發(fā)生。這樣的熱穩(wěn)定性酶曾被描述過(guò)，例如，A·S.Kaledin等在《Biokhimiya》，第45卷，644～651頁(yè)(1980)中描述過(guò)。在該恒定的溫度下，反應(yīng)進(jìn)行了，引物在每條鏈的6～8堿基對(duì)中具有它們的3′末端。盡管所有反應(yīng)試劑在初始時(shí)都存在，該方法的每一步還是連續(xù)地發(fā)生的。必要時(shí)，可以添加其他物質(zhì)。在適當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間以產(chǎn)生所需要的特定的核酸順序后，反應(yīng)可以通過(guò)任何已知的方式使酶失話，或?qū)⒎磻?yīng)的組份分開(kāi)使其停止。
擴(kuò)增作用也可以采用溫度周期反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)，此時(shí)，溫度逐漸地增高以允許使用熱穩(wěn)定酶用于延長(zhǎng)、退火和變性。
本發(fā)明的方法可以連續(xù)地進(jìn)行。在一個(gè)自動(dòng)法實(shí)施例中，反應(yīng)可能通過(guò)一個(gè)變性區(qū)，一個(gè)試劑添加區(qū)和一個(gè)反應(yīng)區(qū)循環(huán)。在另一個(gè)實(shí)施例中，用于引物延長(zhǎng)產(chǎn)物合成的酶可以被固定在一柱中。其它的反應(yīng)組份可以用一個(gè)泵使之連續(xù)地循環(huán)通過(guò)柱，和一個(gè)串連的旋管，因此，所產(chǎn)生的核酸可以重復(fù)地變性而不會(huì)使酶失話。
擴(kuò)增產(chǎn)物可以不采用放射性探針，而用Southern blots分析法對(duì)它分析來(lái)測(cè)定。例如，該法中，從含極少量的HTLVⅠ和Ⅱ或HTLVⅠ或HTLVⅡ順序的周?chē)毫馨图?xì)胞中得到的DNA少量樣品被擴(kuò)增并用Southen blotting技術(shù)分析。非放射性探針的應(yīng)用是由高水平的放大信號(hào)來(lái)促進(jìn)的。
另一種測(cè)定方法包括使用一種能與擴(kuò)增的核酸順序雜交的標(biāo)記探針來(lái)測(cè)定和確定探針是否發(fā)生雜交。這樣的探針必須含有一種來(lái)自HTLVⅠ和HTLVⅡ或HTLVⅠ或HTLVⅡ病毒基因組中的大量存在的核酸順序，用如上描述的方法，它被選來(lái)用于引物和擴(kuò)增順序。最好是，該探針選自HTLVⅠ和HTLVⅡ或HTLVⅠ或HTLVⅡ基因組的X區(qū)。
這樣一種探針?lè)òㄔ诿绹?guó)專(zhuān)利第4，683，194號(hào)Supra中描述過(guò)的寡聚體限制技術(shù)。在該方法中，擴(kuò)增了的核酸被變性，并在溶液中雜交到標(biāo)記的寡核苷酸探針上，它可專(zhuān)一性地雜交到靶順序(跨越引物所含有的一特殊的區(qū))上，并至少跨越一個(gè)感頭趣的限制性部位。在靶和探針之間所形成的雙鏈將重新構(gòu)成限制部位，當(dāng)用限制性?xún)?nèi)切酶，如BglⅠ，PvuⅡ，或HinfⅠ裂解時(shí)，就釋放出一個(gè)標(biāo)記探針片斷，它可以用凝膠電泳法從整個(gè)長(zhǎng)度的探針中分離出來(lái)。然后，所得的凝膠被放射自顯影照相。用這個(gè)方法分析擴(kuò)增產(chǎn)物是快速的，即結(jié)果可以在幾小時(shí)內(nèi)得到。最好的情況是，探針是30～45堿基長(zhǎng)，并被標(biāo)記，同樣，BglⅠ，PvuⅡ或HinfⅠ是優(yōu)先選用的限制性?xún)?nèi)切酶?？捎糜诜治鰯U(kuò)增產(chǎn)物的另一種方法是涂點(diǎn)法(dot bot method)。在這個(gè)方法中，擴(kuò)增的樣品直接涂點(diǎn)在膜上，并和標(biāo)記探針雜交。這種標(biāo)記物可用光譜學(xué)，光化學(xué)或用生物化學(xué)，免疫化學(xué)或化學(xué)方法測(cè)定。這些實(shí)例包括酶，如堿基磷酸酶、放射性標(biāo)記物如32P、熒光標(biāo)記物或生物素。在一個(gè)實(shí)施例中，探針是一種含生物素的探針，其中的生物素被結(jié)合到分子結(jié)構(gòu)的間隔壁(Spacer arm)上
其中Y為0，NH或N-CHO，x是1～4的數(shù)，y是2～4的數(shù)。
間隔壁反過(guò)來(lái)結(jié)合到分子的普索拉靈(Psoralen)一部分上
普索拉靈(Psoralen)一部分插入和穿過(guò)交叉為一“裂口環(huán)”探針，如Courage-Tabbe等在《Boichim Biophys Acta，第697卷1～5頁(yè)(1982)中描述的，這里，裂口環(huán)的單鏈雜交區(qū)跨越兩種引物之間所包含的區(qū)。這種生物素化作用(bioti nylatin)的詳細(xì)說(shuō)明和涂點(diǎn)法在美國(guó)專(zhuān)利第4，582，789和4，617，261號(hào)中更詳細(xì)和完全地描述了。生物素化探針可避免對(duì)放射性同位素的需要另一種方法是，如果需要的話，在預(yù)雜交的條件下，探針首先被涂點(diǎn)在膜上，然后，在雜交條件下，把擴(kuò)增產(chǎn)物以反向涂點(diǎn)方式，加到預(yù)處理的膜上。
涂點(diǎn)方法所費(fèi)時(shí)間要大于上述描述的寡聚體限制法，因?yàn)槟な紫缺仨氼A(yù)雜交，然后再雜交到探針上。但是，對(duì)于迅速突變的病毒，它具有這樣的優(yōu)點(diǎn)含有有限堿基失配的順序仍可在一合適的雜交條件下測(cè)定，采用寡聚體限制法時(shí)，任何可引起限制性?xún)?nèi)部位取消的突變株病毒，由于病毒的變異性，將難以被檢測(cè)出來(lái)。
本發(fā)明也涉及一種裝置的形式，它是一種包裝了多個(gè)容器的裝置，每個(gè)容器各盛有要使用的引物和探針。該裝置也具有一個(gè)盛有用于合成引物延長(zhǎng)產(chǎn)物的聚合作用劑，如酶的容器和一盛有四個(gè)核苷三磷酸的每種容器和一個(gè)用于測(cè)定標(biāo)記物(如，若標(biāo)記物是生物素時(shí)的一種抗生物素蛋白-酶復(fù)合物)的容器。此外，該裝置還備有一個(gè)容器，它包括含有一種或一種以上具有HTLVⅠ和HTLVⅡ或HTLVⅠ或HTLVⅡ病毒基因組的順序的核酸正控制器，和包括沒(méi)有這樣核酸的負(fù)控制器的容器。此外，該裝置備有裝盛每種限制酶的容器，限制酶能夠在探針中一個(gè)順序所含有的部位下裂解含有靶順序的核酸。
下面的例子列舉了本發(fā)明的各種實(shí)施例，但不受這些實(shí)施的限制。在實(shí)例中，除了指出外，所有部分和百分比，如果是固體，以重量百分比表示，如果是液體，以體積百分?jǐn)?shù)表示，溫度皆指攝氏溫度。
實(shí)施例1
被擴(kuò)增的所需要的順序包含11個(gè)編碼的DNA樣品中，所述DNA樣品是從地區(qū)腫瘤學(xué)中心，SUNY北部醫(yī)學(xué)中心，Syracuse，紐約13210，Bernard Poiesz博士處得到的，它們被鑒定為194BK，342，367，361，368H，207，307，308B，323，326和340。引物和探針是用HTLVⅠ病毒和具有少數(shù)錯(cuò)誤配段的HTLVⅡ病毒的X區(qū)選擇出來(lái)的，由Shimotohno等在《Proc Natl Acad Sci》美國(guó)，第81卷，6657～6661頁(yè)(1984)鑒定。
密碼樣本首先在白細(xì)胞間素2(inleukin-2)存在下培養(yǎng)，Poiesz博士用于測(cè)定病毒的存在。然后，DNA以下列方法從樣品中抽提出來(lái)。
1、1～2×108個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞置于盛有20ml十二烷基硫酸鈉溶胞緩沖液(1% SDS，150m M Na Cl，25m M Na2EDTA)的試管中進(jìn)行溶胞。
2、400ml 5mg/μl的蛋白酶K溶液加入到每一個(gè)試管中，在37℃保溫過(guò)夜。
3、DNA用酚和CHCl異戊醇連續(xù)抽提，再用乙醇沉淀。
4、DNA用玻璃棒挑出，再置于1×TE緩沖液(10mM Tris，lmM Na2EDTA，PH為7.5)中，并用1×TE緩沖液完全滲析。
Ⅰ、引物的合成下列兩種寡脫氧核糖核苷酸引物，被命名為SK43和SK44，分別用下面描述的方法制備5′-CGGATACCCAGTCTACGTGT-3′(SK43)5′-GAGCCGATAACGCGTCCATCG-3′(SK44)A.自動(dòng)合成方法由Beaucage和Caruthers[《Tetrahadron
Letters》第22卷，1859～1862頁(yè)(1981)]合成的二乙基磷酰胺亞酯被連續(xù)地縮合到一個(gè)核苷上，這種核苷是從使用Bioserch SAM-1可控的孔玻璃載體取得的。該方法包括用在二氯甲烷中的三氯醋酸進(jìn)行脫三苯甲基作用，使用苯并三唑作為激活質(zhì)子供體進(jìn)行濃縮，并用在四氫呋喃和吡啶中的醋酸酐和雙甲基氨基吡啶覆蓋。循環(huán)時(shí)間約為30分鐘。每一步驟的產(chǎn)量基本上是定量的，并通過(guò)收集和在脫三苯甲基作用過(guò)程所釋放的二甲氧基三苯甲醇的光譜檢驗(yàn)測(cè)定。
B.寡脫氧核糖核苷酸去保護(hù)和純化方法載體從柱中移出，在室溫下，暴露到密閉試管中1ml濃的氫氧化銨中保持4小時(shí)。然后，載體可通過(guò)過(guò)濾去除，含有部分保護(hù)的寡脫氧核苷酸的溶液加熱至55℃保持5小時(shí)。然后，去除氨，殘余物被置于預(yù)先制備的聚丙烯酰胺凝膠中。在30伏/cm下電泳90分鐘，之后，含有該產(chǎn)物的帶用熒光板的紫外投影法來(lái)鑒定。這個(gè)帶切下來(lái)，并且用1ml蒸餾水在4℃過(guò)夜洗提。這種溶液置于Altech RP18柱中，并在PH6.0，用1%醋酸銨緩沖液中的7～13%梯度的乙腈洗提。洗提結(jié)果通過(guò)用260nm紫外吸光率監(jiān)視，并收集合適的級(jí)分，用在固定體積的紫外吸光率定量，在真空離心機(jī)中在室溫下蒸發(fā)干燥。
C.寡脫氧核糖核苷酸的特性純的寡核苷酸試驗(yàn)整份部分是由聚核苷酸激酶和γ-32P-ATP標(biāo)記的32P。這些標(biāo)記的化合物在50伏/cm下電泳45分鐘后，通過(guò)14～20%聚丙烯酰胺凝膠的放射自顯影法檢定。這個(gè)方式可測(cè)定分子量。堿基組分可通過(guò)采用蛇毒液雙酯酶和細(xì)菌堿性磷酸酶，把寡脫氧核糖核苷酸消化為核苷酸來(lái)確定，隨后用逆相高壓液相色譜柱(HPLC)和10%乙腈，1%醋酸銨流動(dòng)相對(duì)所得到的核苷酸進(jìn)行分離和定量。
Ⅱ、擴(kuò)增反應(yīng)從來(lái)自Poiesz博士的每個(gè)11個(gè)編碼的DNA樣品得到的一微克DNA被加入到100ml緩沖液中，緩沖液是由10m M Tris-HCl，PH 7.5，50mM氯化鈉和10m M氯化鎂組成，并含有100×10-12M的引物SK43，100×10-12M引物SK44和濃度皆為150×10-9M的d ATP，dCTP，dGTP和TTP。
所得到的溶液再加熱至100℃保持10分鐘，并冷卻至室溫，保持2分鐘，隨后，2μl含有大腸桿菌DNA聚合酶的Klenow片斷的一個(gè)單位加入溶液。反應(yīng)在室溫下進(jìn)行兩分鐘，然后加熱至95℃2分鐘使酶失活。變性，引物退火，用Klenow片斷延長(zhǎng)(每個(gè)步驟為2分鐘)和加入聚合酶，重復(fù)19次。
Ⅲ.寡脫氧核糖核苷酸探針的合成和磷酸化作用順序的一個(gè)標(biāo)記的DNA探針SK455′-＊ACGCCCTACTGGCCACCTGTCCAGAGCATCAGATCCCTG-3′，其中＊表示標(biāo)記，是根據(jù)第一部分描述的方法合成的。探針是這樣標(biāo)記的將探針10×10-12M與在40μl反應(yīng)溶液中的4個(gè)單位T聚核苷酸激酶和50×10-12Mγ32P-ATP(約7200居里/毫克分子)接觸90分鐘溫度為37℃，反應(yīng)溶液含有70m M Tris緩沖液(PH7.6)、10m MMg Cl、1.5mM精胺和2.5mM二硫代蘇糖醇。然后，全部反應(yīng)液用25m MEDTA調(diào)節(jié)到100μl，取出整份部分，用于通過(guò)TCA沉淀法測(cè)定比活性。標(biāo)記的探針用高速真空器濃縮，并在Tris-硼酸-EDTA(TBE)緩沖液(89mM三羥甲基氨基甲烷，89mM硼酸，2.5mM乙二胺四乙酸，PH8.9)中，在18%聚丙烯酰胺凝膠(丙烯酰胺與BIS比例為19∶1)電泳純化500 Vhr。在放射自顯影照相法定位后，含有標(biāo)記探針的凝膠部分被切下來(lái)，壓碎并于0.2ml TE緩沖液中，在4℃過(guò)夜以洗提)。反應(yīng)產(chǎn)物的TCA沉淀物顯示比活性是2居里/毫克分子，最終濃度是20p M/ml。
Ⅳ、帶有探針和BglⅠ的擴(kuò)增基因組DNA的雜交/消化。
A、溶液中的測(cè)定10μl(微升)擴(kuò)增的DNA(含有71納克(ng)基因組DNA的預(yù)擴(kuò)增等效物)被放入一個(gè)1.5ml的微逐出管(Microfuge tube)，將20μl TE緩沖液加入至最終體積為30μl。樣品在95℃下變性，歷時(shí)100分鐘。將含有0.02PM SK45探針的10m10.6M Na Cl加入試管，輕輕地晃動(dòng)混合，在上面鋪蓋礦物油，并立即轉(zhuǎn)移到56℃的加熱塊上一小時(shí)。加入10μl 50m M的Mg Cl2和1μl BglⅠ(8個(gè)單位)，重復(fù)退火的DNA在56℃消化30分鐘。通過(guò)加入4μl 75m MEDTA和6μl徑跡染料(tracking dye)至最終體積為60μl，使反應(yīng)停止。
無(wú)機(jī)油用0.2ml三氯甲烷提取，13μl反應(yīng)混合物(約15納克基因組DNA)摻入在Hoeffer SE200容器中的30%聚丙烯酰胺小凝膠中。凝膠在約300伏的電壓下電泳1小時(shí)，直到溴酚蘭染料從起點(diǎn)朝前移開(kāi)3.0cm為止。凝膠頂端1.5cm被取出，其余部分凝膠暴露在-70℃的兩個(gè)強(qiáng)化篩(intensification)中，至少過(guò)夜。
B.用涂點(diǎn)法測(cè)定擴(kuò)增的DNA被加至Na OH和Na2EDTA的緩沖液中，最后的濃度為400mM Na OH和25m M Na2EDTA，最終體積為200μl。
將一離子膜在水中浸濕，放入到一個(gè)Bio-Rad免疫點(diǎn)真空器械中。然后抽真空，使器械保持平衡，上述的DNA樣品置于膜上。然后，用20×SSPE洗滌膜，這果SSPE是一種含有Na Cl，磷酸鈉，EDTA和Na OH組成的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液。然后將膜取出，放于20×SSPE之中，攪拌2～5分鐘。然后對(duì)膜涂點(diǎn)干燥，在紫外光中暴露6分鐘，使DNA交聯(lián)到膜上。
然后，將膜置于預(yù)雜交溶液中[預(yù)雜交溶液含有3×SSPE，5×Denhardt′s溶液，0.5%十二烷基硫酸鈉(SDS)，30%甲酰胺，用玻璃杯蒸餾水(glass-distilled water)加到10ml]，在42℃下，攪拌30分鐘。然后將預(yù)雜交溶液排出，再加入5ml雜交溶液(與加入0.5×10-12MSK45一樣)。然后在攪拌下，在42℃保溫1小時(shí)。
在雜交后，膜放在2×SSPE，0.1% SDS的溶液在室溫、攪拌條件下沖洗二次，歷時(shí)15分鐘。然后再用0.2×SSPE，0.1% SDS溶液在50℃，攪拌下沖洗10分鐘。膜被涂點(diǎn)干燥和暴露到膠片上。
Ⅴ、結(jié)果討論在溶液中和膜上測(cè)定的放射自顯影照相表明，HTLVⅠ和ⅡDNA順序只存在在下列樣品342(HTLVⅠ)367(HTLVⅠ)、361(HTLVⅠ)、307(HTLVⅠ)、308B(HTLVⅠ)、323(HTLVⅡ)和326(HTLVⅠ)。所有后來(lái)發(fā)現(xiàn)這些標(biāo)本，是HTLVⅠ或HTLVⅡDNA正鏈。另外四種樣品如下194BK＝來(lái)自白血病病人的DNA(沒(méi)有分離到病毒)，207＝進(jìn)行性白血病病人(不涉及皮膚)，340＝進(jìn)行性白血病病人(不同于207)，368H＝HTLVⅢ。
因此，所采用的引物可用于擴(kuò)增DNA以允許探針可準(zhǔn)確地測(cè)定順序。在10% DMSO(最小亞結(jié)構(gòu)分子式)存在下，在37℃擴(kuò)增也指出，HTLVⅠ和HTLVⅡ樣品是正樣品。
實(shí)施例2HTLVⅠ上述實(shí)施例1中的擴(kuò)增或雜交或消化實(shí)驗(yàn)可用擴(kuò)增Pol區(qū)3365～3483的HTLVⅠ專(zhuān)一的引物重復(fù)，這些引物是
5′-CTTCACAGTCTCTACTGTGC-3′(SK54)and5′-CGGCAGTTCTGTGACAGGG-3′(SK55).
下面的探針SK56與限制性?xún)?nèi)切酶PvuⅡ一道使用5′-CCGCAGCTGCACTAATGATTGAACTTGAGAAGGAT-3′(SK56).
放射自顯影照相表明HTLVⅠDNA順序只存在于后來(lái)鑒定為HTLVⅠ正DNAs的樣品之中。
HTLVⅡ例1中的擴(kuò)增或雜交或消化實(shí)驗(yàn)可用擴(kuò)增Pol區(qū)4198～4300HTLVⅡ?qū)Ｒ坏囊镞M(jìn)行重復(fù)，這些引物是5′-ATCTACCTCCACCATGTCCG-3′(SK58)5′-TCAGGGGAACAAGGGGAGCT-3′(SK59).
下面的探針SK60可與限制性?xún)?nèi)切酶Hinf Ⅰ一道使用5′-TAAGGGAGTCTGTGTATTCATTGAAGGTGGAAATTGGGTC-3′(SK60).
放射自顯影照相表明，HTLVⅡDNA順序只存在于后來(lái)鑒定為HTLVⅡ正DNA的樣品323之中。
權(quán)利要求
1.一種測(cè)定或檢驗(yàn)核酸順序是否存在的方法，所述核酸順序大量存在于HTLVⅠ或HTLVⅡ核酸，或HTLVⅠ和HTLVⅡ兩者的核酸分離體之中，特別適于HTLVⅠ或HTLVⅡ或HTLVⅠ和HTLVⅡ兩者分離體中的核酸，其核酸順序被懷疑是包含在樣品中，其特征在于該方法包括a、用核酸順序的每一鏈的寡核苷酸引物、四種不同的核苷三磷酸、一種聚合作用劑在雜交的條件下，一起或分別處理樣品，對(duì)于每一核酸順序鏈，每一引物的延長(zhǎng)產(chǎn)物被合成，它與要測(cè)定或檢驗(yàn)的核酸順序的每一鏈互補(bǔ)，這樣，一種引物合成的延長(zhǎng)產(chǎn)物，當(dāng)延長(zhǎng)產(chǎn)物從它的補(bǔ)體中分離出來(lái)時(shí)，可作為合成其他引物的延長(zhǎng)產(chǎn)物的模板；(b)、在變性條件下處理樣品以將引物延長(zhǎng)產(chǎn)物從它們的模板中分離出來(lái)，如果待測(cè)的順序是存在的；(c)、用寡核苷酸引物處理步驟(b)中的產(chǎn)物，將步驟(b)中所產(chǎn)生的每一條單鏈作為模板合成引物延長(zhǎng)產(chǎn)物，結(jié)果擴(kuò)增了要測(cè)定的順序，如果它是存在的話；和(d)、確定要測(cè)的順序是否存在于樣品之中。
2.如權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于所述步驟(d)包括如下幾步(1)向步驟(c)的產(chǎn)物加入一個(gè)可與擴(kuò)增的核酸順序雜交的標(biāo)記探針;和(2)確定探針是否已經(jīng)與核酸樣品中的擴(kuò)增的順序雜交。
3.如權(quán)利要求
1或2所述的方法，其特征在于步驟(b)和(c)至少重復(fù)一次，而且引物是從HTLVⅠ和HTLVⅡ基因組中的X區(qū)中選出的。
4.如權(quán)利要求
1～3的任一權(quán)利要求
所述的方法，其特征在于所述的聚合作用劑是從下列酶中選出的一種酶大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ、大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片斷，反轉(zhuǎn)錄酶、或一種在暴露到足夠使核酸變性的溫度下仍保持其酶活性以在步驟(a)和(c)的反應(yīng)溫度下，形成所述的延長(zhǎng)產(chǎn)物的酶。
5.如權(quán)利要求
1～4中任一權(quán)利要求
所述的方法，其特征在于在步驟(a)之前，樣品用可使樣品中所含有的核酸鏈裸露的試劑處理，所述鏈可同時(shí)或隨后分離。
6.如權(quán)利要求
2所述的方法，其特征在于步驟(2)包括下列幾步(1)用對(duì)探針順序內(nèi)某一位置有識(shí)別的限制性?xún)?nèi)切酶消化步驟(d)中的雜交了的混合物;和(2)確定限制消化物中是否含有與待測(cè)定的HTLVⅠ和HTLVⅡ順序或HTLVⅠ或HTLVⅡ順序存在有關(guān)的限制片斷。
7.如權(quán)利要求
6所述的方法，其特征在于步驟(1)和(2)使用了一種含有一個(gè)或一個(gè)以上具HTLVⅠ和HTLVⅡ病毒基因組或HTLVⅠ或HTLVⅡ病毒基因組的順序的核酸的正控制和/或不含有任何具從HTLVⅠ和HTLVⅡ病毒或HTLVⅠ或HTLVⅡ病毒中得到的核酸的負(fù)控制。
8.一種含有擴(kuò)增核酸順序的組成，所述順序大量存在于HTLVⅠ或HTLVⅡ核酸分離體或HTLVⅠ或HTLVⅡ兩者的核酸分離體中，特別是HTLVⅠ或HTLVⅡ或HTLVⅠ和HTLVⅡ兩者的分離體中的核酸，其特征在于，該組成是這樣產(chǎn)生的(a)、用核酸順序每條鏈的寡核苷酸先導(dǎo)物、四種不同的核苷三磷酸和一種聚合作用劑在雜交條件下，一起或分別處理含有所述核酸順序的非擴(kuò)增形式的樣品，對(duì)每一核酸順序，每一引物的延長(zhǎng)產(chǎn)物被合成，延長(zhǎng)產(chǎn)物基本上是與所要測(cè)定或檢驗(yàn)的核酸順序的每一鏈互補(bǔ)，這樣，從一個(gè)引物合成的延長(zhǎng)產(chǎn)物，當(dāng)延長(zhǎng)產(chǎn)物從它的補(bǔ)體上分離出來(lái)時(shí)，可以作為合成其他引物延長(zhǎng)產(chǎn)物的模板;(b)、將引物延長(zhǎng)產(chǎn)物從模板分離出來(lái)，在模板上，延長(zhǎng)產(chǎn)物被合成以產(chǎn)生單鏈分子;和(c)、用寡核苷酸引物處理步驟(b)中的產(chǎn)物，這樣，用步驟(b)中所產(chǎn)生的每一條單鏈作為模板合成引物延長(zhǎng)產(chǎn)物，結(jié)果導(dǎo)致了核酸順序的擴(kuò)增。
9.一種測(cè)定和檢驗(yàn)核酸順序是否存在的裝置，所述核酸順序大量存在于HTLVⅠ或HTLVⅡ核酸或HTLVⅠ和HTLVⅡ兩者核酸的分離體中，特別適于HTLVⅠ或HTLVⅡ或HTLVⅠ和HTLVⅡ兩者的分離體中的核酸，核酸順序被懷疑包含在樣品中，其特征在于該裝置包括(a)、一種用于要檢測(cè)的核酸順序的每鏈的寡核苷酸引物，它的一種或多種引物基本上與每條特定核酸順序的每條鏈互補(bǔ)，這樣，從一個(gè)引物合成的一種延長(zhǎng)產(chǎn)物，當(dāng)延長(zhǎng)產(chǎn)物從它的補(bǔ)體中分離出來(lái)時(shí)，可以作為合成其它引物延長(zhǎng)產(chǎn)物的模板;和(b)、一種能與核酸順序雜交的標(biāo)記探針。
10.如權(quán)利要求
9所述的裝置，其特征在于它進(jìn)一步包括一種聚合作用劑，四種不同的核苷三磷酸中的一種和測(cè)定所述探針和所述順序雜交物的手段。
專(zhuān)利摘要
在含有一個(gè)或一個(gè)以上核酸的樣品中，是否存在HTLVI和HTLVII兩者分離體或HTLVI或HTLVII的分離體的核酸順序，以及懷疑含有這樣的順序可通過(guò)下述方法來(lái)測(cè)定，即采用引物擴(kuò)增順序以形成延長(zhǎng)產(chǎn)物作為模板和測(cè)定擴(kuò)增的產(chǎn)物，如果它是存在的話。這可以通過(guò)把一種附加的標(biāo)記雜交探針加到已擴(kuò)增的產(chǎn)物上，或者游離于溶液中或固定在載體上來(lái)實(shí)現(xiàn)。
文檔編號(hào)C12N15/09GK87108073SQ87108073
公開(kāi)日1988年6月8日 申請(qǐng)日期1987年11月25日
發(fā)明者約翰·約瑟夫·史寧史凱, 雪利·依·瓦克, 伯納德·波意茲 申請(qǐng)人:塞特斯公司, 紐約州立大學(xué)研究基金會(huì)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan