本發(fā)明涉及一種多功能復(fù)合納米顆粒及其制備方法和應(yīng)用。更具體地說，涉及一種親和素修飾的核酸功能化磁性復(fù)合納米顆粒及其制備方法和應(yīng)用。該納米顆粒可用作基因載體、活細(xì)胞內(nèi)核酸修復(fù)酶的原位成像和藥物載體，屬于納米顆粒制備技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

納米材料具有優(yōu)良的電學(xué)、光學(xué)、力學(xué)性能，形貌可控且表面易修飾。生物分子具有特異性強、結(jié)合位點豐富等特點(Eugenii Katz,Itamar Willner.Integrated Nanoparticle-Biomolecule Hybrid Systems:Synthesis,Properties,and Applications.Angew.Chem.Int.Ed(2004),43,6042–6108)。隨著納米技術(shù)和生物技術(shù)的蓬勃發(fā)展，將納米材料與生物分子相結(jié)合制成各種各樣的復(fù)合納米材料，可用來對生物體進行診斷、治療、修復(fù)或替換其病損組織，并在細(xì)胞成像、生物傳感等方面展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。

親和素與生物素之間的結(jié)合作用是目前發(fā)現(xiàn)的生物分子間最牢固的結(jié)合體系(Buller,HR.,Gallus,AS.,Pillion,G.,Prins,MH.,Raskob,GE.Enoxaparin followed by once-weekly idrabiotaparinux versus enoxaparin plus warfarin for patients with acute symptomaticpulmonary embolism:a randomised,double-blind,double-dummy,non-inferiority trial.Lancet(2012),379,123–129)，可以抵抗有機溶劑、表面活性劑、蛋白水解酶、極端的溫度和pH的影響等(Green,N.Michael.Avidin.Advances in Protein Chemistry Volume(1975),29,85-133)。將親和素與修飾了羧基的硅納米顆粒共價連接，然后將生物素化的DNA通過親和素與生物素之間的親和作用修飾到共價連接了親和素的硅納米顆粒表面，可以大大提高納米顆粒表面DNA的數(shù)量，并且增強了DNA與納米載體的牢固性。

DNA或藥物轉(zhuǎn)導(dǎo)是指借助外源介導(dǎo)作用將DNA或藥物導(dǎo)入到癌細(xì)胞或靶細(xì)胞中。目前病毒載體雖可以達到較高的轉(zhuǎn)染效率，但存在強免疫原性、高致突變風(fēng)險、小容量等缺點，限制了其在生物及臨床治療中的應(yīng)用。而非病毒載體，尤其是納米顆粒不僅可以克服以上缺點，并且具有合成簡便、重復(fù)性高、多種物理化學(xué)性質(zhì)和易表面修飾等優(yōu)點，實現(xiàn)納米載體的多功能化。

磁納米顆粒不僅易修飾，還具有磁場效應(yīng)和熒光猝滅效應(yīng)，將磁納米顆粒將其他顆粒相結(jié)合并修飾上生物分子，便可以解決納米顆粒分離時間長和轉(zhuǎn)染時間長的問題(Liu,YB.,Fang,SM.,Zhai,JQ.,Zhao,MP.Construction of antibody-like nanoparticles for selective protein sequestration in living cells.NANOSCALE(2015),7(16):7162-7167)。硅納米顆粒不僅具有生物相容性好、多孔性，易反應(yīng)的優(yōu)點，還可以保護修飾在納米顆粒表面的DNA不受DNase I酶的干擾(Roy,I.,Ohulchanskyy,TY.,Bharali,DJ.,Pudavar,HE.,Mistretta,RA.,Kaur,N.,Prasad,PN.Opticaltracking oforganically modifiedsilica nanoparticles as DNA carriers:A nonviral,nanomedicine approachfor gene delivery.PNAS(2005),102(2):279-284)，因此將磁納米顆粒與硅納米顆粒相結(jié)合，不僅實現(xiàn)了快速高效的轉(zhuǎn)染效率，減少了生物毒性，還保護了被修飾的DNA能夠完整的被轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。

目前已經(jīng)有的利用硅納米顆粒將DNA導(dǎo)入細(xì)胞的方法，有共價連接DNA(Cai L,Chen Z Z,Chen M Y,et al.MUC-1aptamer-conjugated dye-doped silica nanoparticlesforMCF-7cells detection[J].Biomaterials,2013,34(2):371-381.)和利用靜電相互作用連接(Qian R,Ding L,Ju H.Switchablefluorescent imaging of intracellular telomerase activity using telomerase-responsive mesoporous silica nanoparticle.Journal of the American Chemical Society,2013,135(36):13282-13285.)等方法。此類方法主要用于與細(xì)胞內(nèi)miRNA或mRNA的雜交(Zhang P,Cheng F,Zhou R,et al.DNA‐hybrid‐gated multifunctional mesoporous silica nanocarriers for dual‐targeted and microRNA‐responsive controlled drug delivery.Angewandte Chemie International Edition,2014,53(9):2371-2375.)，由于硅納米顆粒對DNA的保護作用(He X,Wang K,Tan W,et al.Bioconjugated nanoparticles for DNA protection from cleavage.Journal of the American Chemical Society,2003,125(24):7168-7169.)，這些納米顆粒通常都抑制了DNA與細(xì)胞內(nèi)核酸酶的反應(yīng)，從而難以用于核酸酶的活性分析和原位成像。另外，目前利用納米顆粒導(dǎo)入miRNA藥物，缺乏針對癌細(xì)胞特異性的釋放調(diào)控作用(Mura S,Nicolas J,Couvreur P.Stimuli-responsive nanocarriersfor drug delivery.Nature materials,2013,12(11):991-1003.)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種磁性復(fù)合納米顆粒的制備方法和應(yīng)用。該磁性復(fù)合納米顆粒不僅可以在體外對溶液中的目標(biāo)蛋白進行特異性的識別和定量分析，更為重要的是，可以在磁場作用下快速地進入活細(xì)胞，對其中的目標(biāo)蛋白進行原位的熒光成像，通過熒光顯微鏡對其在細(xì)胞中的分布進行示蹤。若將熒光集團替換為抗癌藥物，還可以實現(xiàn)對癌癥進行針對性治療。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案。

一種磁性復(fù)合納米顆粒，由內(nèi)向外依次包括磁核、二氧化硅殼層和生物分子修飾層，所述磁核為鐵磁性納米顆粒，所述二氧化硅殼層為表面修飾有羧基的二氧化硅，所述生物分子修飾層為親和素及與之(即親和素)結(jié)合的生物素化的含有脫堿基空位的雙鏈DNA(biotinylated-AP-DNA)。

進一步地，所述鐵磁性納米顆粒為四氧化三鐵納米顆粒或γ-三氧化二鐵納米顆粒。

進一步地，所述磁性復(fù)合納米顆粒的TEM粒徑為40-60nm，其DLS粒徑為65-75nm。

進一步地，所述磁核的直徑為20-30nm，所述二氧化硅殼層的厚度為10-15nm，所述生物分子修飾層的厚度小于或等于20nm。

進一步地，所述磁性復(fù)合納米顆粒的表達式為Fe₃O₄@SiO₂@AVD-AP-DNA或γ-Fe₂O₃@SiO₂@AVD-AP-DNA。其中Fe₃O₄代表四氧化三鐵磁核，γ-Fe₂O₃則代表γ-三氧化二鐵磁核；SiO₂代表二氧化硅殼層；AVD代表親和素層；AP-DNA代表生物素化的含有脫堿基空位的雙鏈DNA(biotinylated-AP-DNA)層。

進一步地，所述生物素化的含有脫堿基空位的雙鏈DNA(biotinylated-AP-DNA)的兩條單鏈的序列分別為：

5’-GGGGACGACTCCATCGACCTCAAGCAGTTGATCCTTTGGAAAAAAA-Biotin-3’和5’-GTCGATGGAGXCGTCCCC-FAM-3’，其中X表示脫堿基位點，Biotin表示生物素標(biāo)記，F(xiàn)AM為羧基熒光素標(biāo)記。

本發(fā)明還提供了上述磁性復(fù)合納米顆粒的制備方法，包括：先在二氧化硅殼層的外層共價連接上親和素，然后通過親和素與生物素的強親和作用，將生物素化的含U堿基的雙鏈DNA(dsDNA)修飾在二氧化硅包覆的鐵磁性納米顆粒表面，最后再利用UDG酶將U堿基切除，產(chǎn)生含脫堿基空位的雙鏈DNA(AP-DNA)。

進一步地，上述制備方法的具體步驟如下：

1)將羧基修飾的二氧化硅殼層包覆的鐵磁性納米顆粒超聲分散在純水中，分別加入EDC和NHS，室溫(以下均指15-28℃)下震蕩反應(yīng)，作為溶液A。

2)在溶液A中加入親和素，室溫下震蕩反應(yīng)。磁分離洗滌除去未反應(yīng)的物質(zhì)，然后將得到的反應(yīng)物重新超聲分散在純水中，作為溶液B。

3)在溶液B中加入生物素化的含U堿基的雙鏈DNA，室溫下孵育30-90分鐘。磁分離并洗滌，除去未反應(yīng)的物質(zhì)，然后將得到的含U堿基的雙鏈DNA修飾的磁性納米顆粒重新超聲分散在PBS溶液中，作為溶液C。

4)將溶液C加入到buffer 1.1緩沖溶液中，加入UDG酶切除DNA雙鏈中的U堿基，得到磁性復(fù)合納米顆粒。

進一步地，步驟1)中，羧基修飾的二氧化硅殼層包覆的鐵磁性納米顆粒超聲分散在純水中的終濃度為0.5-2mg/mL。

進一步地，步驟1)中超聲時間需超過10分鐘。

進一步地，步驟1)中EDC的濃度為0.5-2mg/mL，NHS的濃度為1-5mg/mL，EDC、NHS與羧基修飾的二氧化硅殼層包覆的鐵磁性納米顆粒的重量比為4:10:1。

進一步地，為使二氧化硅殼層表面的羧基充分活化，EDC和NHS要加入略過量，活化時間不要過短或過長，根據(jù)室溫的不同，優(yōu)選活化時間為15-45分鐘。

進一步地，步驟2)中親和素的濃度為0.1-0.2mg/mL，優(yōu)選0.1mg/mL。加入親和素使納米顆粒與親和素在混合溶液中終濃度的(重量)比為5：1，室溫下震蕩反應(yīng)8-12個小時，超聲分散時間為5分鐘。

其中，在二氧化硅層外共價連接親和素時，為使納米顆粒充分分散，納米顆粒的濃度不要過高，優(yōu)選濃度為0.5-1mg/mL。

步驟2)反應(yīng)結(jié)束后，為了除去反應(yīng)體系中的未反應(yīng)物，可以用去離子水洗1-3遍，然后再超聲分散在純水中。

進一步地，步驟3)中，在將生物素化的含U堿基的雙鏈DNA(dsDNA)修飾到納米顆粒表面上時，為使dsDNA的構(gòu)象更穩(wěn)定一致，首先將其進行升溫退火(95℃下孵育90s，75℃下孵育90s,50℃下孵育90s，最后在37℃下孵育600s)，然后將dsDNA加入到溶液B中。

進一步地，步驟3)中，加入的生物素化的含U堿基的雙鏈DNA在溶液B中的終濃度為0.2-1μM。

為使dsDNA連接到納米顆粒表面的數(shù)量最多，可優(yōu)化其濃度，使最終濃度為1μM。

進一步地，步驟3)中，將得到的含U堿基的雙鏈DNA修飾的磁性納米顆粒重新超聲分散在0.1M的PBS溶液中，超聲分散時間為5分鐘，如不立即使用，則應(yīng)置于4℃保存。

進一步地，步驟4)中，buffer 1.1緩沖溶液的組成為：10mM Bis Tris Propane-HCl,10mM MgCl₂,100μg/ml BSA，pH 7.0(25℃)。

加入的UDG酶在包含溶液C的buffer 1.1緩沖溶液中的終濃度1.0-100U/mL,反應(yīng)時間范圍是0.5-10min。

本發(fā)明還提供了上述磁性復(fù)合納米顆粒在體外酶活性測定、活細(xì)胞內(nèi)核酸修復(fù)酶的原位成像中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果為：

四氧化三鐵或γ-三氧化二鐵磁核作為復(fù)合顆粒的內(nèi)核，其特點是：對一些熒光基團具有猝滅作用、有助于在顆粒制備過程中對顆粒進行分離、洗滌、而且在導(dǎo)入細(xì)胞時，可以借助外加磁場的作用加速納米粒子進入細(xì)胞的過程。表面修飾有羧基的二氧化硅層能夠提高納米顆粒的親水性和生物相容性，提供羧基與親和素發(fā)生共價連接反應(yīng)，并保證當(dāng)熒光團遠(yuǎn)離顆粒表面時能夠釋放熒光。親和素(AVD)與biontinylated-ds DNA上的biotin有強親和作用，這種作用可以將ds DNA拉近到納米顆粒表面，使ds DNA能夠成功并有效的修飾在納米顆粒上。最為重要的是，我們在研究中發(fā)現(xiàn)并確證，AVD與脫堿基核酸內(nèi)切酶I(APE1)之間存在特異性的親和作用，這種相互作用可以使AVD將溶液中的APE1吸引到納米顆粒表面，作用于DNA上的脫堿基位點，有效切割脫堿基位點5’側(cè)的磷酸二酯鍵，從而釋放連接在DNA上的熒光基團或藥物。DNA在這里作為納米載體的分子臂，不僅可連接熒光基團用于對APE1進行熒光檢測或細(xì)胞內(nèi)成像，還可以連接藥物分子，并能保證只有在APE1存在的情況下才釋放出熒光基團或藥物分子等，從而保證了復(fù)合納米顆粒在可以在APE1表達過量的癌細(xì)胞當(dāng)中有效發(fā)揮作用，而減少甚至避免對正常細(xì)胞的副作用。

本發(fā)明合成了一種磁性多功能復(fù)合納米顆粒，粒徑均一，直徑40-60nm，表面連接的含脫堿基位點DNA雙鏈可被目標(biāo)蛋白脫堿基核酸內(nèi)切酶I(APE1)特異性地識別和切割，釋放出熒光基團或藥物分子。所獲得的納米顆粒具有良好的分散性、穩(wěn)定性和生物相容性，從而可用于活細(xì)胞內(nèi)APE1的原位熒光成像。另外由于癌細(xì)胞通常過表達APE1，上述納米顆?？梢栽诎┘?xì)胞內(nèi)更有效地釋放藥物，有望實現(xiàn)針對癌細(xì)胞的精準(zhǔn)治療。

附圖說明

圖1為磁性復(fù)合納米顆粒的制備過程及原理示意圖。

圖2為納米探針A(Fe₃O₄@SiO₂@AVD-AP-DNA納米顆粒)的透射電鏡圖。

圖3為MNPs(Fe₃O₄@SiO₂)，MNP@AVD(Fe₃O₄@SiO₂@AVD)和納米探針A(Fe₃O₄@SiO₂@AVD-AP-DNA)三種顆粒在0.1mg/mL水溶液中的zeta電勢。

圖4a為納米探針A對不同濃度APE1響應(yīng)的時間曲線；圖4b為納米探針A檢測APE1活性的線性擬合曲線。

圖5為納米探針A對各種常見核酸酶的選擇性。

圖6為納米探針A磁轉(zhuǎn)染30分鐘到HeLa細(xì)胞中后隨時間變化的熒光圖。

圖7為細(xì)胞內(nèi)對照探針的熒光圖及在不同藥物作用下細(xì)胞內(nèi)熒光信號的變化圖。

圖8為納米探針A對細(xì)胞的毒性。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和具體實施方式對本發(fā)明做詳細(xì)說明。以下具體實施方式將有助于理解發(fā)明，但并不限制本發(fā)明的內(nèi)容。

實施例1、制備磁性復(fù)合納米顆粒Fe₃O₄@SiO₂@AVD-AP-DNA(納米探針A)

本發(fā)明制備磁性復(fù)合納米顆粒的的過程如圖1所示，具體包括以下步驟：

將1.0mg Fe₃O₄@SiO₂在室溫，40KHz下(本發(fā)明中均采用該超聲頻率，根據(jù)需要調(diào)整為不同的超聲時間)超聲20分鐘，分散在2.0mL純水中配成0.5mg/mL的溶液，加入4.0mg EDC和10.0mg NHS活化羧基，室溫下震蕩反應(yīng)30分鐘。加入0.1mL濃度為2.0mg/mL的親和素，室溫下振蕩反應(yīng)8個小時。磁分離，除去未反應(yīng)的物質(zhì)，用去離子水洗三次，重新超聲分散在2.0mL純水中。加入終濃度為1μM的生物素化的含U堿基的雙鏈DNA，室溫下孵育1小時。磁分離，用PBS(pH 7.4，0.1M)洗三次除去未反應(yīng)的DNA，將得到的含U堿基的雙鏈DNA修飾的磁性納米顆粒重新超聲分散在2.0mL0.1M PBS(pH 7.4)中繼續(xù)使用或保存于4℃。在50μLPCR管中，加入5μL 1.0mg/mL上述分散在0.1M PBS中含U堿基的雙鏈DNA修飾的磁性納米顆粒溶液，5μL10×Buffer1.1緩沖液，補加去離子水使得總體積為47μL，然后加入1μL 500U/mL的UDG酶，反應(yīng)2min，得到多功能復(fù)合納米顆粒Fe₃O₄@SiO₂@AVD-AP-DNA(納米探針A)，立即用于APE1的活性測定或?qū)爰?xì)胞實驗。

通過透射電子顯微鏡表征復(fù)合納米顆粒Fe₃O₄@SiO₂@AVD-AP-DNA如圖2所示，可見復(fù)合納米顆粒大小均一，分散性好，其粒徑在60nm左右。從原納米顆粒Fe₃O₄@SiO₂(MNPs)，中間體Fe₃O₄@SiO₂@AVD(MNP@AVD)和復(fù)合納米顆粒Fe₃O₄@SiO₂@AVD-AP-DNA(納米探針A)的zeta電勢值可知(圖3)，原納米顆粒成功連接上AVD和biotinylated-AP-DNA。

實施例2、對溶液中的APE1活性直接進行檢測

在該實施例中，設(shè)計的DNA探針序列如下：

5’-GGGGACGACTCCATCGACCTCAAGCAGTTGATCCTTTGGAAAAAAA-Biotin-3’

5’-GTCGATGGAGXCGTCCCC-FAM-3’

其中X表示脫堿基位點，Biotin表示生物素標(biāo)記，F(xiàn)AM為羧基羧基熒光素標(biāo)記。

實驗步驟如下：

1.在200μL PCR管中，加入10μL 0.5mg/mL實施例1制備得到的磁性復(fù)合納米顆粒的溶液，5μL 10×Buffer1.1緩沖液，補加去離子水使得總體積為48μL，然后加入2μL不同濃度的APE1溶液，使APE1的終濃度分別為0，0.01，0.05，0.1，0.2，0.5，1U/mL，檢測復(fù)合納米顆粒的響應(yīng)。

采用Stratagene Mx3000P熒光PCR儀，37℃下每5s采集熒光，激發(fā)波長為470nm，在510nm下測發(fā)射信號，并擬合反應(yīng)初始50s內(nèi)熒光上升速率與APE1濃度的工作曲線。

檢測結(jié)果如圖4a所示，擬合結(jié)果如圖4b所示，復(fù)合納米顆?？梢詸z測到0.01U/mL的APE1，具有靈敏的響應(yīng)。隨著APE1濃度的增加，其熒光上升速率與APE1濃度呈線性關(guān)系，R²＝0.996，工作范圍是0.01-1.0U/mL。

2.在200μLPCR管中，加入10μL 0.5mg/mL實施例1制備得到的磁性復(fù)合納米顆粒的溶液，5μL 10×DNase I緩沖液，補加去離子水使得總體積為48μL，加入2μL 125U/mL DNase I溶液，使DNase I的終濃度為5U/mL，檢測復(fù)合納米顆粒的響應(yīng)。

采用Stratagene Mx3000P熒光PCR儀，37℃下每5s采集熒光，激發(fā)波長為470nm，在510nm下測發(fā)射信號。磁性復(fù)合納米顆粒對其它酶的響應(yīng)檢測過程與此相同，只是將緩沖液替換為其最合適的條件。

檢測結(jié)果如圖5所示，各種酶測定的終濃度分別為APE1:2.0U/mL；DNase I:5.0U/mL；Exo III:4.0U/mL；Lambda exo:66.7U/mL；Exo I:12.5U/mL；T5:5U/mL；T7 50U/mL)?？梢园l(fā)現(xiàn)復(fù)合納米顆粒在APE1的存在下，AP-DNA中的脫堿基位點可以被切割從而釋放出遠(yuǎn)端帶有FAM的核苷酸，使得熒光上升速率較快，而對其他的酶，特別是DNase I等則響應(yīng)很慢。說明復(fù)合納米顆粒對APE1具有很好的選擇性。值得說明的是，Exo III是由細(xì)菌表達的、同時具有3’外切活性和脫堿基位點內(nèi)切活性的核酸酶，從圖5中也可以看到磁性復(fù)合納米顆粒對其有一定的響應(yīng)。

實施例3、復(fù)合納米顆粒在磁場作用下快速導(dǎo)入細(xì)胞并釋放熒光信號

制備得到的磁性復(fù)合納米顆粒具有較好的穩(wěn)定性、生物相容性，在磁場作用下通過細(xì)胞內(nèi)吞作用可以快速導(dǎo)入Hela細(xì)胞并對APE1進行成像。

實驗步驟如下：

1.在含有1％青霉素-鏈霉素雙抗和10％失活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)箱條件為37℃以及5％CO₂/95％空氣。當(dāng)細(xì)胞長至覆蓋培養(yǎng)瓶的70％-80％時，加入0.25％的胰酶在37℃下處理4min然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移96孔平底玻璃板上，每個孔含有0.1mL細(xì)胞培養(yǎng)液，約有10⁴個細(xì)胞。在實驗前將細(xì)胞培養(yǎng)24h使得其貼壁。

2.用DPBS緩沖液對細(xì)胞進行洗滌，然后加入實施例1制備得到的磁性復(fù)合納米顆粒的溶液，使其終濃度為50μg/mL。將96孔板置于Chemicell公司的MagnetoFACTOR-96磁板上，在37℃以及5％CO₂/95％空氣的培養(yǎng)箱中放置30min。移去磁板后，吸走96孔板中的溶液，用DPBS緩沖液洗滌細(xì)胞5次，充分洗去沒有進入細(xì)胞的磁納米顆粒。

3.在導(dǎo)入磁性復(fù)合納米顆粒的細(xì)胞中加入含有無色DMEM培養(yǎng)基，在37℃以及5％CO₂/95％的在線培養(yǎng)裝置中培養(yǎng)，采用配備Evolve-EMCCD的Olympus IX 71熒光顯微鏡以及100倍物鏡下拍攝細(xì)胞，用相應(yīng)的熒光光柵拍攝對應(yīng)不同探針的熒光圖片(曝光時間10ms，發(fā)射增益值EM gain為100)。用ImageJ軟件進行結(jié)果處理，如圖6所示。隨著磁轉(zhuǎn)染結(jié)束后孵育時間的增加，HeLa細(xì)胞中的(綠色)熒光分布的區(qū)域增加，熒光強度也增加，在120分鐘處達到最大。180分鐘后熒光分布區(qū)域和熒光強度逐漸減少。說明納米探針A進入到了HeLa細(xì)胞中。

4.為進一步證明細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的熒光信號確實來自細(xì)胞內(nèi)APE1對磁性復(fù)合納米顆粒上DNA序列中脫堿基位點的定點切割，我們將未經(jīng)UDG酶處理的含U堿基的雙鏈DNA修飾的磁性納米顆粒直接導(dǎo)入細(xì)胞進行對照實驗。另外，還選擇了兩種藥物對細(xì)胞進行處理，其中叔丁基過氧化氫(TBHP)為APE1酶激活劑，7-硝基吲哚-2-羧酸(NCA)為APE1酶活性抑制劑，觀察在藥物作用下細(xì)胞內(nèi)酶活性的變化情況。從圖7可以看到，不經(jīng)UDG酶處理，直接將含U堿基的雙鏈DNA修飾的磁性納米顆粒導(dǎo)入細(xì)胞，經(jīng)過120min后仍未出現(xiàn)熒光信號。而將含脫堿基位點的納米探針A導(dǎo)入細(xì)胞后，經(jīng)過同樣時間看到了明顯的熒光信號。表明本發(fā)明所制備的磁性復(fù)合納米顆粒在細(xì)胞內(nèi)也具有良好的選擇性。另外，從圖7還可以看到，用NCA抑制劑處理后的細(xì)胞，在導(dǎo)入納米探針A后幾乎看不到熒光信號，而用TBHP處理過的細(xì)胞，熒光信號明顯增強，且隨著TBHP加入量的增加，熒光信號進一步增強。上述結(jié)果進一步證實，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)的熒光信號是由APE1酶對于磁性復(fù)合納米顆粒中的DNA脫堿基位點產(chǎn)生了特異性切割作用后產(chǎn)生的。

實施例4、磁性復(fù)合納米顆粒的細(xì)胞毒性研究

將終濃度為25-100μg/mL的納米探針A對HeLa細(xì)胞進行磁轉(zhuǎn)染實驗，孵育120分鐘。然后加入CCK-8試劑孵育1小時，將不加入納米探針的組作為對照組，將既不加入納米探針也不進行DPBS緩沖液洗滌操作的組作為空白組。在450nm下檢測培養(yǎng)液中的紫外吸收，然后計算細(xì)胞的活性。從圖8中可以看出，當(dāng)納米探針的濃度為100μg/mL時，仍有80％的細(xì)胞保持活性。證明了此復(fù)合納米顆粒即納米探針A的低毒性。