本發(fā)明屬于復(fù)合微生物菌劑領(lǐng)域，具體涉及一種具有除臭功能的耐低溫堆肥發(fā)酵菌劑及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：我國農(nóng)業(yè)有機(jī)廢棄物的產(chǎn)生量巨大，據(jù)估計(jì)每年產(chǎn)生畜禽糞便30億噸，農(nóng)作物秸稈7億多噸，這些有機(jī)廢棄物富含大量作物生產(chǎn)所需的營養(yǎng)元素。通過好氧堆肥的方法可以將這些有機(jī)廢棄物資源化為優(yōu)質(zhì)有機(jī)肥，傳統(tǒng)堆肥方法由于初期有效微生物數(shù)量少，需要一定時(shí)間才能繁殖起來，存在發(fā)酵時(shí)間長，臭氣排放大，營養(yǎng)元素流失多，資源浪費(fèi)嚴(yán)重等問題，尤其是在北方的秋冬季，由于外界環(huán)境溫度低，堆肥發(fā)酵起溫難的問題尤為突出。另外，堆肥過程常伴隨著惡臭氣體的產(chǎn)生，使人食欲不振、頭昏腦脹、惡心、嘔吐，成為影響堆肥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要制約因素。惡臭氣體主要成分包括硫化物、氨類、低級脂肪胺、芳烴、羥基化合物、醇類、低級脂肪酸及吲哚等，其中氨氣和硫化氫是主要的惡臭氣體組成成分，這些氣體的揮發(fā)既污染了環(huán)境又損失了氮元素，降低了堆肥產(chǎn)品的肥效。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種復(fù)合微生物菌劑。本發(fā)明提供的復(fù)合微生物菌劑的活性成分為釀酒酵母Saccharomycescerevisiae、麥芽糖假絲酵母Candidamaltosa、枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis、解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens、米曲霉Aspergillusoryzae、黑曲霉Aspergillusniger、嗜熱脂肪芽孢桿菌Bacillusstearothermophilus和嗜熱側(cè)孢霉Sporotrichumthermophile。上述菌劑中，所述釀酒酵母Saccharomycescerevisiae、所述麥芽糖假絲酵母Candidamaltosa、所述枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis、所述解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens、所述米曲霉Aspergillusoryzae、所述黑曲霉Aspergillusniger、所述嗜熱脂肪芽孢桿菌Bacillusstearothermophilus和所述嗜熱側(cè)孢霉Sporotrichumthermophile的cfu的配比為(30-60)：(30-60)：500：(200-500)：(20-50)：(20-50)：(100-200)：(20-30)。上述菌劑中，所述釀酒酵母Saccharomycescerevisiae、所述麥芽糖假絲酵母Candidamaltosa、所述枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis、所述解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens、所述米曲霉Aspergillusoryzae、所述黑曲霉Aspergillusniger、所述嗜熱脂肪芽孢桿菌Bacillusstearothermophilus和所述嗜熱側(cè)孢霉Sporotrichumthermophile的cfu的配比具體為5：5：30：50：2：2：20：2或5：6：50：50：5：3：10：2。上述菌劑中，所述釀酒酵母Saccharomycescerevisiae為釀酒酵母SaccharomycescerevisiaeW052502CGMCCNo.12701；所述麥芽糖假絲酵母Candidamaltosa為麥芽糖假絲酵母CandidamaltosaW052501CGMCCNo.12702；所述枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis為枯草芽孢桿菌BacillussubtilisW11025CGMCCNo.12705；所述解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens為解淀粉芽孢桿菌BacillusamyloliquefaciensW160617CGMCCNo.12703；所述米曲霉Aspergillusoryzae為米曲霉AspergillusoryzaeW060406CGMCCNo.12627；所述黑曲霉Aspergillusniger為黑曲霉AspergillusnigerW30117CGMCCNo.12625；所述嗜熱脂肪芽孢桿菌Bacillusstearothermophilus為嗜熱脂肪芽孢桿菌BacillusstearothermophilusW10208CGMCCNo.12704；所述嗜熱側(cè)孢霉Sporotrichumthermophile為嗜熱側(cè)孢霉SporotrichumthermophileW2441CGMCCNo.12626。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種復(fù)合微生物菌劑的制備方法。本發(fā)明提供的復(fù)合微生物菌劑的制備方法為將釀酒酵母Saccharomycescerevisiae菌劑、麥芽糖假絲酵母Candidamaltosa菌劑、枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis菌劑、解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens菌劑、米曲霉Aspergillusoryzae菌劑、黑曲霉Aspergillusniger菌劑、嗜熱脂肪芽孢桿菌Bacillusstearothermophilus菌劑和嗜熱側(cè)孢霉Sporotrichumthermophile菌劑混勻得到的。上述方法中，所述釀酒酵母Saccharomycescerevisiae菌劑、所述麥芽糖假絲酵母Candidamaltosa菌劑、所述枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis菌劑、所述解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens菌劑、所述米曲霉Aspergillusoryzae菌劑、所述黑曲霉Aspergillusniger菌劑、所述嗜熱脂肪芽孢桿菌Bacillusstearothermophilus菌劑和所述嗜熱側(cè)孢霉Sporotrichumthermophile菌劑的質(zhì)量比為(1-3)：(1-3)：2：(1-3)：(1-3)：(1-3)：(1-2)：(1-2)。上述方法中，所述釀酒酵母Saccharomycescerevisiae菌劑、所述麥芽糖假絲酵母Candidamaltosa菌劑、所述枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis菌劑、所述解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens菌劑、所述米曲霉Aspergillusoryzae菌劑、所述黑曲霉Aspergillusniger菌劑、所述嗜熱脂肪芽孢桿菌Bacillusstearothermophilus菌劑和所述嗜熱側(cè)孢霉Sporotrichumthermophile菌劑的質(zhì)量比具體為12：10：14：12：10：14：15：13或12：13：8：14：15：13：8：8。上述方法中，所述釀酒酵母Saccharomycescerevisiae為釀酒酵母SaccharomycescerevisiaeW052502CGMCCNo.12701；所述麥芽糖假絲酵母Candidamaltosa為麥芽糖假絲酵母CandidamaltosaW052501CGMCCNo.12702；所述枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis為枯草芽孢桿菌BacillussubtilisW11025CGMCCNo.12705；所述解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens為解淀粉芽孢桿菌BacillusamyloliquefaciensW160617CGMCCNo.12703；所述米曲霉Aspergillusoryzae為米曲霉AspergillusoryzaeW060406CGMCCNo.12627；所述黑曲霉Aspergillusniger為黑曲霉AspergillusnigerW30117CGMCCNo.12625；所述嗜熱脂肪芽孢桿菌Bacillusstearothermophilus為嗜熱脂肪芽孢桿菌BacillusstearothermophilusW10208CGMCCNo.12704；所述嗜熱側(cè)孢霉Sporotrichumthermophile為嗜熱側(cè)孢霉SporotrichumthermophileW2441CGMCCNo.12626。上述方法中，所述釀酒酵母Saccharomycescerevisiae菌劑的制備方法如下：將釀酒酵母SaccharomycescerevisiaeW052502菌株接種于YPD培養(yǎng)基中，在29℃，200rmp的條件下培養(yǎng)20小時(shí)，然后3000r/min離心濃縮15-20min后，與沸石粉按照質(zhì)量比為1:9-1:5的比例(具體為1:7)吸附混勻，得到釀酒酵母Saccharomycescerevisiae菌劑。其中，釀酒酵母SaccharomycescerevisiaeW052502菌株的濃度為50億cfu/g。所述麥芽糖假絲酵母Candidamaltosa菌劑的制備方法為：將麥芽糖假絲酵母CandidamaltosaW052501菌株接種于YPD培養(yǎng)基中，在30℃，200rmp條件下培養(yǎng)22小時(shí)，然后3000r/min離心濃縮15-20min后，與沸石粉按照質(zhì)量比為1:9-1:5的比例(具體為1:7)吸附混勻，得到麥芽糖假絲酵母Candidamaltosa菌劑。其中，麥芽糖假絲酵母CandidamaltosaW052501菌株的濃度為60億cfu/g。所述枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis菌劑的制備方法為：將枯草芽孢桿菌BacillussubtilisW11025菌株接種牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，在30℃，230rmp條件下培養(yǎng)至芽孢形成率達(dá)85％，然后3000r/min離心濃縮15-20min后，與沸石粉按照質(zhì)量比為1:9-1:2的比例(具體為1:5)吸附混勻，得到枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis菌劑。其中，枯草芽孢桿菌BacillussubtilisW11025菌株的濃度為500億cfu/g。所述解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens菌劑的制備方法為：將解淀粉芽孢桿菌BacillusamyloliquefaciensW160617菌株接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，在31℃，230rmp條件下培養(yǎng)至芽孢形成率達(dá)85％，然后3000r/min離心濃縮15-20min后，與沸石粉按照質(zhì)量比為1:9-1:2的比例(具體為1:5)吸附混勻，得到解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens菌劑。其中，解淀粉芽孢桿菌BacillusamyloliquefaciensW160617菌株的濃度為500億cfu/g。所述米曲霉Aspergillusoryzae菌劑的制備方法為：將米曲霉AspergillusoryzaeW060406菌株接種于PDA培養(yǎng)基中，在28℃，100rmp條件下培養(yǎng)18h，然后3000r/min離心濃縮15-20min后，與沸石粉按照質(zhì)量比為1:9-1:2的比例(具體為1:5)吸附混勻，得到米曲霉Aspergillusoryzae菌劑。其中，米曲霉AspergillusoryzaeW060406菌株的濃度為50億cfu/g。所述黑曲霉Aspergillusniger菌劑的制備方法為：將黑曲霉AspergillusnigerW30117菌株接種于PDA培養(yǎng)基中，在32℃，100rmp條件下培養(yǎng)20h，然后3000r/min離心濃縮15-20min后，與沸石粉按照質(zhì)量比為1:9-1:2的比例(具體為1:5)吸附混勻，得到黑曲霉Aspergillusniger菌劑。其中，黑曲霉AspergillusnigerW30117菌株的濃度為30億cfu/g。所述嗜熱脂肪芽孢桿菌Bacillusstearothermophilus菌劑的制備方法為：將嗜熱脂肪芽孢桿菌BacillusstearothermophilusW10208菌株接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，在40℃，230rmp條件下培養(yǎng)至芽孢形成率達(dá)85％，然后3000r/min離心濃縮15-20min后，與沸石粉按照質(zhì)量比為1:9-1:2的比例(具體為1:5)吸附混勻，得到嗜熱脂肪芽孢桿菌Bacillusstearothermophilus菌劑。其中，嗜熱脂肪芽孢桿菌BacillusstearothermophilusW10208菌株的濃度為100億cfu/g。所述嗜熱側(cè)孢霉Sporotrichumthermophile菌劑的制備方法為：將嗜熱側(cè)孢霉SporotrichumthermophileW2441菌株接種于PDA培養(yǎng)基中，在45℃，100rmp條件下培養(yǎng)20h，然后3000r/min離心濃縮15-20min后，與沸石粉按照質(zhì)量比為1:9-1:2的比例(具體為1:5)吸附混勻，得到嗜熱側(cè)孢霉Sporotrichumthermophile菌劑。其中，嗜熱側(cè)孢霉SporotrichumthermophileW2441菌株的濃度為20億cfu/g。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供上述復(fù)合微生物菌劑的新用途。本發(fā)明提供了上述復(fù)合微生物菌劑在如下(1)-(8)中任一種中的應(yīng)用：(1)制備堆肥發(fā)酵劑或腐熟劑；(2)堆肥，特別是低溫條件下堆肥；(3)有機(jī)物料或有機(jī)廢棄物的發(fā)酵；(4)加快發(fā)酵堆體的升溫速度；(5)減少腐熟過程中臭味氣體的排放；(6)提高植物的株高和/或根長和/或根鮮重和/或根干重和/或產(chǎn)量；(7)降低果樹果實(shí)的畸形果率；(8)提高果樹果實(shí)的單果重和/或含糖量和/或產(chǎn)量；所述臭味氣體為硫化氫和/或二氧化硫和/或二氧化氮和/或氨氣。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種用于堆肥的腐熟劑。本發(fā)明提供的腐熟劑由上述復(fù)合微生物菌劑與載體組成。上述腐熟劑中，所述載體為稻殼粉或沸石粉或稻殼粉與沸石粉的混合物。上述腐熟劑中，所述載體的細(xì)度大于等于60目。上述腐熟劑中，所述復(fù)合微生物菌劑與所述載體的質(zhì)量比為(49-201):909。上述腐熟劑中，所述復(fù)合微生物菌劑與所述載體的質(zhì)量比具體為49:451或91:909。本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供上述腐熟劑的新用途。本發(fā)明提供了上述腐熟劑在如下1)-7)中任一種中的應(yīng)用：1)堆肥，特別是低溫條件下堆肥發(fā)酵；2)有機(jī)物料或有機(jī)廢棄物的發(fā)酵；3)加快發(fā)酵堆體的升溫速度；4)減少腐熟過程中臭味氣體的排放；5)提高植物的株高和/或根長和/或根鮮重和/或根干重和/或產(chǎn)量；6)降低果樹果實(shí)的畸形果率；7)提高果樹果實(shí)的單果重和/或含糖量和/或產(chǎn)量；所述臭味氣體為硫化氫和/或二氧化硫和/或二氧化氮和/或氨氣。本發(fā)明的第六個(gè)目的是提供一種堆肥的方法。本發(fā)明提供的堆肥的方法包括如下步驟：用上述腐熟劑處理有機(jī)物料或有機(jī)廢棄物。上述方法中，所述腐熟劑與所述有機(jī)物料或有機(jī)廢棄物的質(zhì)量比為(1-5)：1000。上述方法中，所述有機(jī)物料可以但不限于禽畜糞便、農(nóng)作物秸稈、蔬菜尾菜秸稈、蘑菇渣、糠醛渣、污泥等。本發(fā)明的第七個(gè)目的是提供一種有機(jī)肥料的制備方法。本發(fā)明提供的有機(jī)肥料的制備方法包括如下步驟：用上述腐熟劑處理有機(jī)物料或有機(jī)廢棄物，得到有機(jī)肥料。上述方法中，所述腐熟劑與所述有機(jī)物料或有機(jī)廢棄物的質(zhì)量比為(1-5)：1000。上述方法中，所述有機(jī)物料可以但不限于禽畜糞便、農(nóng)作物秸稈、蔬菜尾菜秸稈、蘑菇渣、糠醛渣、污泥等。上述方法制備得到的有機(jī)肥料也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供上述有機(jī)肥料的新用途。本發(fā)明提供了上述有機(jī)肥料在如下a1)-a3)中任一種中的應(yīng)用：a1)提高植物的株高和/或根長和/或根鮮重和/或根干重和/或產(chǎn)量；a2)降低果樹果實(shí)的畸形果率；a3)提高果樹果實(shí)的單果重和/或含糖量和/或產(chǎn)量。本發(fā)明提供了一種堆肥復(fù)合發(fā)酵劑，其所含的微生物菌群可以耐受低溫，在15-20℃可以正常生長，有利于有機(jī)物料在低溫環(huán)境中發(fā)酵氣溫，各菌種間相互促進(jìn)，產(chǎn)生相互協(xié)同效果，從而加速腐熟。通過實(shí)驗(yàn)證明：在堆肥過程中，將本發(fā)明的堆肥復(fù)合發(fā)酵劑添加到有機(jī)物料中進(jìn)行發(fā)酵，不僅提高了堆肥初期有效微生物的總數(shù)，加快了堆肥物料升溫速度，縮短了厭氧發(fā)酵時(shí)間，加快了腐熟進(jìn)程，而且減少含硫、氮化合物的排放，優(yōu)化了發(fā)酵產(chǎn)物的理化性質(zhì)，具有一定除臭功能。附圖說明圖1為實(shí)施例2中的發(fā)酵堆體的溫度變化。其中，橫坐標(biāo)為時(shí)間(h)，縱坐標(biāo)為溫度(℃)。圖2為實(shí)施例3中的發(fā)酵堆體的溫度變化。其中，橫坐標(biāo)為時(shí)間(h)，縱坐標(biāo)為溫度(℃)。圖3為菌株W11025的形態(tài)及生理生化鑒定結(jié)果。圖4為菌株W11025的16srDNA的序列。圖5為菌株W160617的細(xì)胞形態(tài)和生理生化鑒定結(jié)果。圖6為菌株W11025的16srDNA的序列。圖7為菌株W052501的理化特征。圖8為菌株W052501的rRNA基因D1D2區(qū)序列。圖9為菌株W30117的ITS序列的序列。保藏說明菌種名稱：釀酒酵母拉丁名：Saccharomycescerevisiae菌株編號：W052502保藏機(jī)構(gòu)：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏機(jī)構(gòu)簡稱：CGMCC地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號保藏日期：2016年6月22日保藏中心登記入冊編號：CGMCCNo.12701菌種名稱：麥芽糖假絲酵母拉丁名：Candidamaltosa菌株編號：W052501保藏機(jī)構(gòu)：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏機(jī)構(gòu)簡稱：CGMCC地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號保藏日期：2016年6月22日保藏中心登記入冊編號：CGMCCNo.12702菌種名稱：枯草芽孢桿菌拉丁名：Bacillussubtilis菌株編號：W11025保藏機(jī)構(gòu)：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏機(jī)構(gòu)簡稱：CGMCC地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號保藏日期：2016年6月22日保藏中心登記入冊編號：CGMCCNo.12705菌種名稱：解淀粉芽孢桿菌拉丁名：Bacillusamyloliquefaciens菌株編號：W160617保藏機(jī)構(gòu)：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏機(jī)構(gòu)簡稱：CGMCC地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號保藏日期：2016年6月22日保藏中心登記入冊編號：CGMCCNo.12703菌種名稱：米曲霉拉丁名：Aspergillusoryzae菌株編號：W060406保藏機(jī)構(gòu)：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏機(jī)構(gòu)簡稱：CGMCC地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號保藏日期：2016年6月22日保藏中心登記入冊編號：CGMCCNo.12627菌種名稱：黑曲霉拉丁名：Aspergillusniger菌株編號：W30117保藏機(jī)構(gòu)：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏機(jī)構(gòu)簡稱：CGMCC地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號保藏日期：2016年6月22日保藏中心登記入冊編號：CGMCCNo.12625菌種名稱：嗜熱脂肪芽孢桿菌拉丁名：Bacillusstearothermophilus菌株編號：W10208保藏機(jī)構(gòu)：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏機(jī)構(gòu)簡稱：CGMCC地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號保藏日期：2016年6月22日保藏中心登記入冊編號：CGMCCNo.12704菌種名稱：嗜熱側(cè)孢霉拉丁名：Sporotrichumthermophile菌株編號：W2441保藏機(jī)構(gòu)：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏機(jī)構(gòu)簡稱：CGMCC地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號保藏日期：2016年6月22日保藏中心登記入冊編號：CGMCCNo.12626具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。下述實(shí)施例中的YPD培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)及其在培養(yǎng)基中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％酵母粉、2％蛋白胨、2％葡萄糖。下述實(shí)施例中的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)及其在培養(yǎng)基中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3％牛肉膏、1％蛋白胨、2％葡萄糖、0.5％氯化鈉。下述實(shí)施例中的PDA培養(yǎng)基的制備方法為200g馬鈴薯去皮，切成小塊，于鍋中加水1000mL煮沸半個(gè)小時(shí)，用雙層紗布過濾，取其濾液加20g葡萄糖，并加水補(bǔ)足1000mL。實(shí)施例1、菌株的分離及鑒定一、菌株W11025的分離與鑒定1、菌株W11025的分離將采自堆肥的樣品(2014年10月內(nèi)蒙古五原縣)10.0g，加入帶玻璃珠的90mL的無菌水中，靜置20min，在旋轉(zhuǎn)式搖床上200r/min充分振蕩30min，即得到1×101稀釋度的菌懸液，用無菌移液管吸取5.0mL上述菌懸液加入到裝有45mL無菌水的三角瓶中，充分振蕩搖勻，得到1×102稀釋度的菌懸液，依此方法制成1×103、1×104、1×105稀釋度的菌懸液。在無菌條件下，以上各稀釋度菌懸液各取100μL涂布在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，20℃培養(yǎng)24-72h，觀察有無菌落產(chǎn)生，挑選一株生長快，形態(tài)不一樣的菌株，并將該菌株命名為菌株W11025。2、菌株W11025的鑒定(1)菌株W11025的形態(tài)及生理生化鑒定菌株W11025的形態(tài)及生理生化鑒定結(jié)果如圖3所示。(2)菌株W11025的分子鑒定提取菌株W11025的總DNA作為模板，采用通用引物27f和1492r進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到含有菌株W1102516SrDNA保守區(qū)的片段。引物序列如下：27f(上游引物)：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492r(下游引物)：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR擴(kuò)增得到的菌株W11025的16srDNA的序列如圖4所示。3、菌株W11025的保藏根據(jù)形態(tài)特征、生理生化和分子鑒定結(jié)果和分析，菌株W11025的分類命名為枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis，該菌株于2016年06月22日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為CGMCCNo.12705。二、菌株W160617的分離及鑒定1、菌株W160617的分離將采自堆肥的樣品(2014年10月內(nèi)蒙古五原縣)10.0g，加入帶玻璃珠的90mL的無菌水中，靜置20min，在旋轉(zhuǎn)式搖床上200r/min充分振蕩30min，即得到1×101稀釋度的菌懸液，用無菌移液管吸取5.0mL上述菌懸液加入到裝有45mL無菌水的三角瓶中，充分振蕩搖勻，得到1×102稀釋度的菌懸液，依此方法制成1×103、1×104、1×105稀釋度的菌懸液。在無菌條件下，以上各稀釋度菌懸液各取100μL涂布在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，20℃培養(yǎng)24-72h，觀察有無菌落產(chǎn)生，挑選一株生長快，形態(tài)不一樣的菌株，并將該菌株命名為菌株W160617。2、菌株W160617的鑒定(1)菌株W160617的形態(tài)及生理生化鑒定菌株W160617的細(xì)胞形態(tài)和生理生化鑒定結(jié)果圖5所示。(2)菌株W160617的分子鑒定提取菌株W160617的總DNA作為模板，采用通用引物27f和1492r進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到含有菌株W16061716SrDNA保守區(qū)的片段。引物序列如下：27f(上游引物)：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492r(下游引物)：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR擴(kuò)增得到的菌株W11025的16srDNA的序列如圖6所示。3、菌株W160617的保藏根據(jù)形態(tài)特征、生理生化和分子鑒定結(jié)果和分析，菌株W160617的分類命名為解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens，該菌株于2016年06月22日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為CGMCCNo.12703。三、菌株W052501的分離及鑒定1、菌株W052501的分離將采自堆肥的樣品(2015年12月北京市平谷區(qū))10.0g，加入帶玻璃珠的90mL的無菌水中，靜置20min，在旋轉(zhuǎn)式搖床上200r/min充分振蕩30min，即得到1×101稀釋度的菌懸液，用無菌移液管吸取5.0mL上述菌懸液加入到裝有45mL無菌水的三角瓶中，充分振蕩搖勻，得到1×102稀釋度的菌懸液，依此方法制成1×103、1×104、1×105稀釋度的菌懸液。在無菌條件下，以上各稀釋度菌懸液各取100μL涂布在YPD培養(yǎng)基上，20℃培養(yǎng)24-72h，觀察有無菌落產(chǎn)生，挑選一株生長快，形態(tài)不一樣的菌株，并將該菌株命名為菌株W052501。2、菌株W052501的鑒定(1)菌株W052501的形態(tài)鑒定在YPD培養(yǎng)基中25℃培養(yǎng)三天，細(xì)胞卵形、橢圓形、臘腸形，大小為(3.2-6.0)×(4.9-11.6)μm。YPD培養(yǎng)基斜面25℃培養(yǎng)一個(gè)月，菌落奶酪狀，乳白色，表面平滑，不反光，邊緣樹根狀。玉米粉瓊脂Dalmau平板培養(yǎng)，產(chǎn)生假菌絲。(2)菌株W052501的生理生化鑒定菌株W052501的理化特征如圖7所示。(3)菌株W052501的分子鑒定提取菌株W052501的總DNA作為模板，采用NL1：5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'和NL4：5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到菌株W052501的rRNA基因D1D2區(qū)序列，并對其進(jìn)行測序。測序結(jié)果如圖8所示。3、菌株的保藏根據(jù)形態(tài)特征、生理生化和分子鑒定結(jié)果和分析，菌株W052501的分類命名為麥芽糖假絲酵母Candidamaltosa，該菌株于2016年06月22日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為CGMCCNo.12702。四、菌株W052502的分離及鑒定1、菌株W052502的分離將采自堆肥的樣品(2014年12月北京市平谷區(qū))10.0g，加入帶玻璃珠的90mL的無菌水中，靜置20min，在旋轉(zhuǎn)式搖床上200r/min充分振蕩30min，即得到1×101稀釋度的菌懸液，用無菌移液管吸取5.0mL上述菌懸液加入到裝有45mL無菌水的三角瓶中，充分振蕩搖勻，得到1×102稀釋度的菌懸液，依此方法制成1×103、1×104、1×105稀釋度的菌懸液。在無菌條件下，以上各稀釋度菌懸液各取100μL涂布在YPD培養(yǎng)基上，20℃培養(yǎng)24-72h，觀察有無菌落產(chǎn)生，挑選一株生長快，形態(tài)不一樣的菌株，并將該菌株命名為菌株W052502。2、菌株W052502的鑒定(1)菌株W052502的形態(tài)鑒定YPD固體培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)3天，菌落乳白，無假菌絲，水浸片顯微鏡下觀察多端出芽，細(xì)胞近圓，液體YPD培養(yǎng)產(chǎn)生輸送白色沉淀。(2)菌株W052502的生理生化鑒定菌株W052502生理生化鑒定結(jié)果如表1所示。表1、菌株W052502生理生化鑒定(3)菌株W052502的分子鑒定提取菌株W052502的總DNA作為模板，采用如下引物NL1：5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'和NL4：5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到菌株W052502的26SrDNA基因D1D2區(qū)序列，測序結(jié)果如序列表中序列1所示。3、菌株W052502的保藏根據(jù)形態(tài)特征、生理生化和分子鑒定結(jié)果和分析，菌株W052502的分類命名為釀酒酵母Saccharomycescerevisiae，該菌株于2016年06月22日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為CGMCCNo.12701。五、菌株W30117的分離及鑒定1、菌株W30117的分離將采自堆肥的樣品(2015年10月北京市平谷區(qū))10.0g，加入帶玻璃珠的90mL的無菌水中，靜置20min，在旋轉(zhuǎn)式搖床上200r/min充分振蕩30min，即得到1×101稀釋度的菌懸液，用無菌移液管吸取5.0mL上述菌懸液加入到裝有45mL無菌水的三角瓶中，充分振蕩搖勻，得到1×102稀釋度的菌懸液，依此方法制成1×103、1×104、1×105稀釋度的菌懸液。在無菌條件下，以上各稀釋度菌懸液各取100μL涂布在PDA培養(yǎng)基上，20℃培養(yǎng)24-72h，觀察有無菌落產(chǎn)生，挑選一株生長快，形態(tài)不一樣的菌株，并將該菌株命名為菌株W30117。2、菌株W30117的鑒定(1)菌株W30117的形態(tài)鑒定在PDA培養(yǎng)基上，菌落初為白色，漸變?yōu)辄S色，后期呈黑色，背面周圍無色中央略帶黃褐色。經(jīng)在載玻片上培養(yǎng)48h，菌絲體具有分隔，顯微鏡觀察縣市：分生孢子梗生于足細(xì)胞上，直徑15-20pm，長約2mm，壁厚而光滑，頂部形成球形頂囊，其上全面覆蓋一層梗基和一層小梗，小梗上長有成串褐黑色的球狀，直徑3.0-4.0μm；分生孢子頭球狀，直徑700-800μm。(2)菌株W30117的生理生化鑒定氮源利用實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：菌株W30117能以硝酸鈉、尿素、硫酸銨、豆粕、酪素為氮源生長，同等條件下，利用酪素的能力最強(qiáng)，菌落生長最快。此菌株的最適生長PH為6.0，最適生長溫度為37℃。(3)菌株W30117的分子鑒定提取菌株W30117的總DNA作為模板，采用通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到含有菌株W052501ITS序列。引物序列如下：ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′PCR擴(kuò)增得到的菌株W30117的ITS序列的序列如圖9所示。3、菌株W30117的保藏根據(jù)形態(tài)特征、生理生化和分子鑒定結(jié)果和分析，菌株W30117的分類命名為黑曲霉Aspergillusniger，該菌株于2016年06月22日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為CGMCCNo.12625。六、菌株W060406的分離與鑒定1、菌株W060406的分離將采自堆肥的樣品(2015年10月北京市平谷區(qū))10.0g，加入帶玻璃珠的90mL的無菌水中，靜置20min，在旋轉(zhuǎn)式搖床上200r/min充分振蕩30min，即得到1×101稀釋度的菌懸液，用無菌移液管吸取5.0mL上述菌懸液加入到裝有45mL無菌水的三角瓶中，充分振蕩搖勻，得到1×102稀釋度的菌懸液，依此方法制成1×103、1×104、1×105稀釋度的菌懸液。在無菌條件下，以上各稀釋度菌懸液各取100μL涂布在PDA培養(yǎng)基上，20℃培養(yǎng)24-72h，觀察有無菌落產(chǎn)生，挑選一株生長快，形態(tài)不一樣的菌株，并將該菌株命名為菌株W30117。2、菌株W060406的鑒定(1)菌株W060406的形態(tài)鑒定菌株W060406查氏培養(yǎng)4d后，菌落圓形、黃色、大小約5.2cm、質(zhì)地疏松、表面干燥有凹凸，呈粉粒狀；第12天菌落鋪滿整個(gè)平板，顏色變?yōu)辄S綠色，邊緣呈褐綠色。菌絲有隔膜，分生孢子梗長度1.8-2.1mm，直徑12.1-14.83μm，粗糙有麻點(diǎn)，頂囊膨大成球形泡囊，頂囊直徑48.9-51.2μm，小梗雙層，分生孢子串生，分生孢子球形，大小4.3-5.2μm。(2)菌株W060406的分子鑒定提取菌株W060406的總DNA作為模板，采用通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到含有菌株W060406ITS序列。引物序列如下：ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′PCR擴(kuò)增得到的菌株W060406的ITS序列的序列如序列表中序列2所示。3、菌株W060406的保藏根據(jù)形態(tài)特征、生理生化和分子鑒定結(jié)果和分析，菌株W060406的分類命名為米曲霉Aspergillusoryzae，該菌株于2016年06月22日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為CGMCCNo.12627。七、菌株W2441的鑒定1、菌株W2441的分離將采自堆肥的樣品(2015年7月北京市大興區(qū))10.0g，加入帶玻璃珠的90mL的無菌水中，靜置20min，在旋轉(zhuǎn)式搖床上200r/min充分振蕩30min，即得到1×101稀釋度的菌懸液，用無菌移液管吸取5.0mL上述菌懸液加入到裝有45mL無菌水的三角瓶中，充分振蕩搖勻，得到1×102稀釋度的菌懸液，依此方法制成1×103、1×104、1×105稀釋度的菌懸液。在無菌條件下，以上各稀釋度菌懸液各取100μL涂布在PDA培養(yǎng)基上，20℃培養(yǎng)24-72h，觀察有無菌落產(chǎn)生，挑選生長快，形態(tài)不一樣的菌株，并將該菌株命名為菌株W2441。2、菌株W2441的鑒定(1)菌株W2441的形態(tài)鑒定菌株W2441PDA平板培養(yǎng)基培養(yǎng)初期菌絲白色，培養(yǎng)60天后開始產(chǎn)孢子，菌落呈暗黃色。顯微鏡觀察菌絲有隔，叢枝狀；分生孢子為橢圓形或梨形，直接從菌絲側(cè)端和頂端生。(2)菌株W2441的分子鑒定提取菌株W2441的總DNA作為模板，采用通用引物ITS4和ITS5進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到含有菌株W2441ITS片段。引物序列如下：ITS4:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ITS5:5’-GCATATCAATAAGCGGAGGA-3’PCR擴(kuò)增得到的菌株W2441的ITS序列如序列表中序列3所示。3、菌株W2441的保藏根據(jù)形態(tài)特征、生理生化和分子鑒定結(jié)果和分析，菌株W2441的分類命名為嗜熱側(cè)孢霉Sporotrichumthermophile，該菌株于2016年06月22日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為CGMCCNo.12626。八、菌株W10208的分離及鑒定1、菌株W10208的分離將采自堆肥的樣品(2015年5月北京市平谷區(qū))10.0g，加入帶玻璃珠的90mL的無菌水中，靜置20min，在旋轉(zhuǎn)式搖床上200r/min充分振蕩30min，即得到1×101稀釋度的菌懸液，用無菌移液管吸取5.0mL上述菌懸液加入到裝有45mL無菌水的三角瓶中，充分振蕩搖勻，得到1×102稀釋度的菌懸液，依此方法制成1×103、1×104、1×105稀釋度的菌懸液。在無菌條件下，以上各稀釋度菌懸液各取100μL涂布在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，20℃培養(yǎng)24-72h，觀察有無菌落產(chǎn)生，挑選一株生長快，形態(tài)不一樣的菌株，并將該菌株命名為菌株W10208。2、菌株W10208的鑒定(1)菌株W10208的形態(tài)及生理生化鑒定菌株W10208在牛肉膏培養(yǎng)機(jī)上菌落直徑0.5-1.5cm，白色，黏稠，透明，邊緣突起，不規(guī)則，表面有皺褶。生理生化鑒定結(jié)果如表2所示。表2、菌株W10208的生理生化鑒定結(jié)果(2)菌株W10208的分子鑒定提取菌株W10208的總DNA作為模板，采用通用引物27f和1492r進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到含有菌株W1020816SrDNA保守區(qū)的片段。引物序列如下：27f(上游引物)：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492r(下游引物)：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR擴(kuò)增得到的菌株W10208的16srDNA的序列如序列表中序列4所示。3、菌株W10208的保藏根據(jù)形態(tài)特征、生理生化和分子鑒定結(jié)果和分析，菌株W10208的分類命名為嗜熱脂肪芽孢桿菌Bacillusstearothermophilus，該菌株于2016年06月22日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為CGMCCNo.12704。實(shí)施例2、耐低溫堆肥發(fā)酵劑的制備及其應(yīng)用一、耐低溫堆肥發(fā)酵劑的制備1、制備復(fù)合微生物菌劑按照如下重量取各微生物菌劑進(jìn)行混合，即得復(fù)合微生物菌劑：釀酒酵母菌劑1.4kg，麥芽糖假絲酵母菌菌劑1.2kg，枯草芽孢桿菌菌劑1.0kg，解淀粉芽孢桿菌菌劑1.4kg，米曲霉菌劑1.5kg，黑曲霉菌劑1.3kg，嗜熱脂肪芽孢桿菌菌劑1.0kg，嗜熱側(cè)孢霉菌劑1.0kg。上述釀酒酵母Saccharomycescerevisiae菌劑的制備方法如下：將釀酒酵母SaccharomycescerevisiaeW052502菌株(保藏號為CGMCCNo.12701)接種于YPD培養(yǎng)基中，在29℃，200rmp的條件下培養(yǎng)20小時(shí)，然后3000r/min離心濃縮20min后，與沸石粉按照質(zhì)量比為1:7的比例吸附混勻，得到釀酒酵母Saccharomycescerevisiae菌劑。其中，釀酒酵母SaccharomycescerevisiaeW052502菌株的濃度為50億cfu/g。上述麥芽糖假絲酵母Candidamaltosa菌劑的制備方法為：將麥芽糖假絲酵母CandidamaltosaW052501菌株(保藏號為CGMCCNo.12702)接種于YPD培養(yǎng)基中，在30℃，200rmp條件下培養(yǎng)22小時(shí)，然后3000r/min離心濃縮20min后，與沸石粉按照質(zhì)量比為1:7的比例吸附混勻，得到麥芽糖假絲酵母Candidamaltosa菌劑。其中，麥芽糖假絲酵母CandidamaltosaW052501菌株的濃度為60億cfu/g。上述枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis菌劑的制備方法為：將枯草芽孢桿菌BacillussubtilisW11025菌株(保藏號為CGMCCNo.12705)接種牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，在30℃，230rmp條件下培養(yǎng)至芽孢形成率達(dá)85％，然后3000r/min離心濃縮20min后，與沸石粉按照質(zhì)量比為1:5的比例吸附混勻，得到枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis菌劑。其中，枯草芽孢桿菌BacillussubtilisW11025菌株的濃度為500億cfu/g。上述解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens菌劑的制備方法為：將解淀粉芽孢桿菌BacillusamyloliquefaciensW160617菌株(保藏號為CGMCCNo.12703)接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，在31℃，230rmp條件下培養(yǎng)至芽孢形成率達(dá)85％，然后3000r/min離心濃縮20min后，與沸石粉按照質(zhì)量比為1:5的比例吸附混勻，得到解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens菌劑。其中，解淀粉芽孢桿菌BacillusamyloliquefaciensW160617菌株的濃度為500億cfu/g。上述米曲霉Aspergillusoryzae菌劑的制備方法為：將米曲霉AspergillusoryzaeW060406菌株(保藏號為CGMCCNo.12627)接種于PDA培養(yǎng)基中，在28℃，100rmp條件下培養(yǎng)18h，然后3000r/min離心濃縮20min后，與沸石粉按照質(zhì)量比為1:5的比例吸附混勻，得到米曲霉Aspergillusoryzae菌劑。其中，米曲霉AspergillusoryzaeW060406菌株的濃度為50億cfu/g。上述黑曲霉Aspergillusniger菌劑的制備方法為：將黑曲霉AspergillusnigerW30117菌株(保藏號為CGMCCNo.12625)接種于PDA培養(yǎng)基中，在32℃，100rmp條件下培養(yǎng)20h，然后3000r/min離心濃縮20min后，與沸石粉按照質(zhì)量比為1:5的比例吸附混勻，得到黑曲霉Aspergillusniger菌劑。其中，黑曲霉AspergillusnigerW30117菌株的濃度為30億cfu/g。上述嗜熱脂肪芽孢桿菌Bacillusstearothermophilus菌劑的制備方法為：將嗜熱脂肪芽孢桿菌BacillusstearothermophilusW10208菌株(保藏號為CGMCCNo.12704)接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，在40℃，230rmp條件下培養(yǎng)至芽孢形成率達(dá)85％，然后3000r/min離心濃縮20min后，與沸石粉按照質(zhì)量比為1:5的比例吸附混勻，得到嗜熱脂肪芽孢桿菌Bacillusstearothermophilus菌劑。其中，嗜熱脂肪芽孢桿菌BacillusstearothermophilusW10208菌株的濃度為100億cfu/g。上述嗜熱側(cè)孢霉Sporotrichumthermophile菌劑的制備方法為：將嗜熱側(cè)孢霉SporotrichumthermophileW2441菌株(保藏號為CGMCCNo.12626)接種于PDA培養(yǎng)基中，在45℃，100rmp條件下培養(yǎng)20h，然后3000r/min離心濃縮20min后，與沸石粉按照質(zhì)量比為1:5的比例吸附混勻，得到嗜熱側(cè)孢霉Sporotrichumthermophile菌劑。其中，嗜熱側(cè)孢霉SporotrichumthermophileW2441菌株的濃度為20億cfu/g。上述實(shí)施例中涉及菌種及各菌種在低溫條件下生長特性如表3所示。表3、上述實(shí)施例中涉及菌種及各菌種在低溫條件下生長特性2、制備耐低溫堆肥發(fā)酵劑稱取步驟1獲得的復(fù)合微生物菌劑9.8kg，并將其與90.2kg沸石粉載體(國投盛世承德科技有限公司)混合，得到本發(fā)明的腐熟劑，即為耐低溫堆肥發(fā)酵劑。二、耐低溫堆肥發(fā)酵劑在發(fā)酵有機(jī)肥中的應(yīng)用試驗(yàn)地點(diǎn)為北京市平谷區(qū)泰豐平有機(jī)肥廠，以雞糞、香菇渣混合物為原料發(fā)酵有機(jī)肥進(jìn)行發(fā)酵，得到發(fā)酵后有機(jī)肥。試驗(yàn)時(shí)間為1月4日。試驗(yàn)按照是否向原料發(fā)酵有機(jī)肥中添加腐熟劑進(jìn)行發(fā)酵分為如下兩組：1、耐低溫堆肥發(fā)酵劑處理(腐熟劑處理組)：每1000kg原料發(fā)酵有機(jī)肥添加上述步驟一制備的耐低溫堆肥發(fā)酵劑5kg；2、不添加腐熟劑空白處理：原料發(fā)酵有機(jī)肥中不添加腐熟劑。采用北京泰華恒越科技發(fā)展有限責(zé)任公司生產(chǎn)的GMS100在線式監(jiān)測儀持續(xù)監(jiān)測發(fā)酵過程中堆體溫度變化和堆體H2S、SO2、NO2、NH3排放量。發(fā)酵堆體溫度變化情況見圖1，廢氣排放量結(jié)果見表4。表4、廢氣排放量硫化氫(ppm)二氧化硫(ppm)二氧化氮(ppm)氨氣(ppm)腐熟劑處理50803.54495.1137.91675804空白處理42083.234625.15300.12159965減少率(％)17.1687.0297.4022.42從以上結(jié)果可以看出，使用本發(fā)明的腐熟劑處理后，相對于空白對照，發(fā)酵堆體升溫速度變快，且硫化氫、二氧化硫、二氧化氮、氨氣4種廢氣的排放量均減少，其中硫化氫減排率達(dá)17.16％，二氧化硫減排率達(dá)87.02％，二氧化氮減排率達(dá)97.4％，氨氣減排率達(dá)22.42％。實(shí)施例3、耐低溫堆肥發(fā)酵劑的制備及其應(yīng)用一、耐低溫堆肥發(fā)酵劑的制備1、制備復(fù)合微生物菌劑按照如下重量取各微生物菌劑進(jìn)行混合，即得復(fù)合微生物菌劑：釀酒酵母菌劑1.2kg，麥芽糖假絲酵母菌菌劑1.3kg，枯草芽孢桿菌菌劑0.8kg，解淀粉芽孢桿菌菌劑1.4kg，米曲霉菌劑1.5kg，黑曲霉菌劑1.3kg，嗜熱脂肪芽孢桿菌菌劑0.8kg，嗜熱側(cè)孢霉菌劑0.8kg。各菌菌劑在混合前各自的有效活菌數(shù)分別為：釀酒酵母50億cfu/g，麥芽糖假絲酵母50億cfu/g，枯草芽孢桿菌300億cfu/g、解淀粉芽孢桿菌500億cfu/g、米曲霉20億cfu/g、黑曲霉20億cfu/g、嗜熱脂肪芽孢桿菌200億cfu/g，嗜熱側(cè)孢霉20億cfu/g。上述釀酒酵母Saccharomycescerevisiae菌劑的制備方法如下：將釀酒酵母SaccharomycescerevisiaeW052502菌株(保藏號為CGMCCNo.12701)接種于YPD培養(yǎng)基中，在29℃，200rmp的條件下培養(yǎng)20小時(shí)，然后3000r/min離心濃縮20min后，與沸石粉按照質(zhì)量比為1:7的比例吸附混勻，得到釀酒酵母Saccharomycescerevisiae菌劑。其中，釀酒酵母SaccharomycescerevisiaeW052502菌株的濃度為50億cfu/g。上述麥芽糖假絲酵母Candidamaltosa菌劑的制備方法為：將麥芽糖假絲酵母CandidamaltosaW052501菌株(保藏號為CGMCCNo.12702)接種于YPD培養(yǎng)基中，在30℃，200rmp條件下培養(yǎng)22小時(shí)，然后3000r/min離心濃縮20min后，與沸石粉按照質(zhì)量比為1:7的比例吸附混勻，得到麥芽糖假絲酵母Candidamaltosa菌劑。其中，麥芽糖假絲酵母CandidamaltosaW052501菌株的濃度為60億cfu/g。上述枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis菌劑的制備方法為：將枯草芽孢桿菌BacillussubtilisW11025菌株(保藏號為CGMCCNo.12705)接種牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，在30℃，230rmp條件下培養(yǎng)至芽孢形成率達(dá)85％，然后3000r/min離心濃縮20min后，與沸石粉按照質(zhì)量比為1:5的比例吸附混勻，得到枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis菌劑。其中，枯草芽孢桿菌BacillussubtilisW11025菌株的濃度為500億cfu/g。上述解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens菌劑的制備方法為：將解淀粉芽孢桿菌BacillusamyloliquefaciensW160617菌株(保藏號為CGMCCNo.12703)接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，在31℃，230rmp條件下培養(yǎng)至芽孢形成率達(dá)85％，然后3000r/min離心濃縮20min后，與沸石粉按照質(zhì)量比為1:5的比例吸附混勻，得到解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens菌劑。其中，解淀粉芽孢桿菌BacillusamyloliquefaciensW160617菌株的濃度為500億cfu/g。上述米曲霉Aspergillusoryzae菌劑的制備方法為：將米曲霉AspergillusoryzaeW060406菌株(保藏號為CGMCCNo.12627)接種于PDA培養(yǎng)基中，在28℃，100rmp條件下培養(yǎng)18h，然后3000r/min離心濃縮20min后，與沸石粉按照質(zhì)量比為1:5的比例吸附混勻，得到米曲霉Aspergillusoryzae菌劑。其中，米曲霉AspergillusoryzaeW060406菌株的濃度為50億cfu/g。上述黑曲霉Aspergillusniger菌劑的制備方法為：將黑曲霉AspergillusnigerW30117菌株(保藏號為CGMCCNo.12625)接種于PDA培養(yǎng)基中，在32℃，100rmp條件下培養(yǎng)20h，然后3000r/min離心濃縮20min后，與沸石粉按照質(zhì)量比為1:5的比例吸附混勻，得到黑曲霉Aspergillusniger菌劑。其中，黑曲霉AspergillusnigerW30117菌株的濃度為30億cfu/g。上述嗜熱脂肪芽孢桿菌Bacillusstearothermophilus菌劑的制備方法為：將嗜熱脂肪芽孢桿菌BacillusstearothermophilusW10208菌株(保藏號為CGMCCNo.12704)接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，在40℃，230rmp條件下培養(yǎng)至芽孢形成率達(dá)85％，然后3000r/min離心濃縮20min后，與沸石粉按照質(zhì)量比為1:5的比例吸附混勻，得到嗜熱脂肪芽孢桿菌Bacillusstearothermophilus菌劑。其中，嗜熱脂肪芽孢桿菌BacillusstearothermophilusW10208菌株的濃度為100億cfu/g。上述嗜熱側(cè)孢霉Sporotrichumthermophile菌劑的制備方法為：將嗜熱側(cè)孢霉SporotrichumthermophileW2441菌株(保藏號為CGMCCNo.12626)接種于PDA培養(yǎng)基中，在45℃，100rmp條件下培養(yǎng)20h，然后3000r/min離心濃縮20min后，與沸石粉按照質(zhì)量比為1:5的比例吸附混勻，得到嗜熱側(cè)孢霉Sporotrichumthermophile菌劑。其中，嗜熱側(cè)孢霉SporotrichumthermophileW2441菌株的濃度為20億cfu/g。2、制備耐低溫堆肥發(fā)酵劑稱取步驟1獲得的復(fù)合微生物菌劑9.1kg，并將其與90.9kg沸石粉(國投盛世承德科技有限公司)載體混合，得到本發(fā)明的腐熟劑，即為耐低溫堆肥發(fā)酵劑。二、耐低溫堆肥發(fā)酵劑在發(fā)酵有機(jī)肥中的應(yīng)用試驗(yàn)地點(diǎn)為北京市平谷區(qū)泰豐平有機(jī)肥廠，以雞糞、金針菇渣混合物為原料發(fā)酵有機(jī)肥進(jìn)行發(fā)酵，得到發(fā)酵后有機(jī)肥。試驗(yàn)時(shí)間為3月7日。試驗(yàn)按照是否向原料發(fā)酵有機(jī)肥中添加腐熟劑進(jìn)行發(fā)酵分為如下兩組：1、耐低溫堆肥發(fā)酵劑處理(腐熟劑處理組)：每1000kg原料發(fā)酵有機(jī)肥添加上述步驟一制備的耐低溫堆肥發(fā)酵劑5kg；2、不添加腐熟劑空白處理：原料發(fā)酵有機(jī)肥中不添加腐熟劑。采用北京泰華恒越科技發(fā)展有限責(zé)任公司生產(chǎn)的GMS100在線式監(jiān)測儀持續(xù)監(jiān)測發(fā)酵過程中堆體溫度變化和堆體H2S、SO2、NO2、NH3排放量。發(fā)酵堆體溫度變化情況見圖2，廢氣排放量結(jié)果見表5。表5、廢氣排放量硫化氫(ppm)二氧化硫(ppm)二氧化氮(ppm)氨氣(ppm)腐熟劑處理11453.12476.910.84926261空白處理34448.421734.52465.33220152減少率(％)66.7588.6099.5671.23從以上結(jié)果可以看出，使用本發(fā)明的腐熟劑處理后，相對于空白對照，發(fā)酵堆體升溫速度變快，且硫化氫、二氧化硫、二氧化氮、氨氣4種廢氣的排放量均減少，其中硫化氫減排率達(dá)66.75％，二氧化硫減排率達(dá)88.60％，二氧化氮減排率達(dá)99.56％，氨氣減排率達(dá)71.23％。從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，使用本發(fā)明的腐熟劑，相對于空白對照，能夠加快腐熟過程升溫速度，提前12小時(shí)升溫至50℃(在平均氣溫20℃的氣候條件下)，且腐熟過程高溫期溫度較高，腐熟降溫期出現(xiàn)快。另外，使用本發(fā)明的發(fā)酵劑處理后，相對于空白對照，堆肥過程向環(huán)境排放的氨氣減少達(dá)22.42-71.23％，硫化氫減少17.16-66.75％，能夠大幅降低環(huán)境中氨氣和硫化氫等氣體的濃度，進(jìn)一步減少堆肥過程臭味排放。實(shí)施例4、耐低溫堆肥發(fā)酵劑的效果驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(施用生菜)為驗(yàn)證本發(fā)明的堆肥發(fā)酵劑發(fā)酵雞糞和香菇渣生產(chǎn)的有機(jī)肥是否在田間有效果，將實(shí)施例2獲得的發(fā)酵后有機(jī)肥施用于生菜上進(jìn)行田間試驗(yàn)，并檢測田間效果。具體步驟如下：一、試驗(yàn)方法1、試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn)試驗(yàn)安排在北京房山蘆村進(jìn)行，試驗(yàn)時(shí)間是2015年3月到2015年7月。2、供試土壤基本性狀供試土壤基本理化性狀測定結(jié)果見表6。表6、試驗(yàn)點(diǎn)土壤養(yǎng)分基本情況3、供試作物供試作物為生菜。4、試驗(yàn)處理及大田設(shè)置本試驗(yàn)設(shè)置如下三個(gè)處理，重復(fù)三次，各處理小區(qū)隨機(jī)排列，小區(qū)面積20m2以上。處理一：實(shí)施例2中步驟二制備的發(fā)酵后有機(jī)肥處理，底施發(fā)酵后有機(jī)肥200kg/667m2，追施尿素10kg/667m2。處理二：空白對照(CK)，基肥和追肥均不施。處理三：常規(guī)施肥，底施復(fù)合肥(購于北京農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料有限公司，總養(yǎng)分含量≥25％)200kg/667m2，追施尿素10kg/667m2。5、田間管理(1)定植與采收試驗(yàn)作物為結(jié)球生菜，品種為皇帝。3月12日開始育苗，4月26日施用基肥，中耕后，開溝起壟，4月27日定植，定植密度為6100株/667m2。處理一和處理三分別為5月20日和6月2日追施尿素兩次，每次用量5kg/667m2，采用溝施，覆土后澆水。(2)澆水和中耕在生菜緩苗期，生長期，結(jié)球初期土壤干旱時(shí)及時(shí)澆水，澆水后進(jìn)行除草、中耕作業(yè)。(3)采收和測產(chǎn)7月5日成熟收獲，記載每個(gè)小區(qū)實(shí)際產(chǎn)量。(4)田間調(diào)查6、生物學(xué)性狀調(diào)查每個(gè)小區(qū)選擇大小和長勢相似的有代表性的15株生菜調(diào)查生物學(xué)性狀。7、產(chǎn)量調(diào)查果實(shí)成熟后，按小區(qū)分別采收稱重，并記載產(chǎn)量。二、結(jié)果與分析1、不同處理對生菜生物學(xué)性狀的影響在連座期，各小區(qū)分別選取有代表性的5株，洗凈后調(diào)查其株高、根長、根鮮重和干重。將生菜的根置于烘箱內(nèi)105℃殺青15分鐘，80℃恒溫48小時(shí)后，稱其重量即為根干重。結(jié)果如表7所示。從表7可看出，試驗(yàn)處理一與其它處理相比：株高增加0.4-3.4cm，根長增加0.3-1.8cm，根鮮重增加0.5-3.2g，根干重增加0.2-0.8g。表7、生菜施肥試驗(yàn)各處理生物學(xué)性狀處理號株高cm根長cm根鮮重g根干重g處理一24.111.318.32.6處理二20.79.515.11.8處理三23.711.017.82.42、不同施肥處理對生菜產(chǎn)量的影響生菜采收期各小區(qū)分別計(jì)產(chǎn)，折合667m2產(chǎn)量，結(jié)果見表8。從表8可看出，試驗(yàn)處理一與其它處理相比，產(chǎn)量明顯增加。表8、不同處理產(chǎn)量結(jié)果對上述產(chǎn)量結(jié)果方差分析，結(jié)果見表9。方差分析結(jié)果表明：試驗(yàn)點(diǎn)處理間差異極顯著，重復(fù)間差異不顯著。進(jìn)一步對表7的產(chǎn)量結(jié)果進(jìn)行多重比較，結(jié)果見表10。由表10可以看出，實(shí)驗(yàn)處理一與處理三相比增產(chǎn)不顯著，但平均產(chǎn)量較處理三增產(chǎn)38.466kg/667m2；處理一較處理二差異達(dá)極顯著。表9、產(chǎn)量結(jié)果的方差分析變異來源自由度平方和均方F值F0.05F0.01區(qū)組間23080.441540.220.26X6.9418.0處理間2635032.0317516.053.0﹡﹡6.9418.0誤差423963.565990.89總計(jì)8662076.0注:﹡﹡差異極顯著,﹡差異顯著,x差異不顯著表10、不同處理產(chǎn)量多重比較結(jié)果注：字母相同表示差異不顯著，字母不同表示差異顯著。上述結(jié)果表明：利用本發(fā)明的堆肥發(fā)酵劑發(fā)酵雞糞和香菇渣生產(chǎn)的有機(jī)肥能夠促進(jìn)生菜生長，有機(jī)肥處理后的生菜在株高、根長、根鮮重、根干重均高于常規(guī)施肥和空白對照處理，產(chǎn)量較空白處理差異達(dá)極顯著水平，較常規(guī)施肥畝增產(chǎn)38.466kg。證明利用本發(fā)明的堆肥發(fā)酵劑發(fā)酵雞糞和香菇渣生產(chǎn)的有機(jī)肥具有一定的肥效。實(shí)施例5、耐低溫堆肥發(fā)酵劑的效果驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(施用桃樹)為驗(yàn)證本發(fā)明的堆肥發(fā)酵劑發(fā)酵雞糞和香菇渣生產(chǎn)的有機(jī)肥是否在田間有效果，將實(shí)施例3獲得的發(fā)酵后有機(jī)肥施用于桃樹上進(jìn)行田間試驗(yàn)，并檢測田間效果。具體步驟如下：一、試驗(yàn)方法1、試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn)試驗(yàn)安排在平谷區(qū)大華山鎮(zhèn)后北宮村和鎮(zhèn)羅營進(jìn)行，試驗(yàn)時(shí)間是2014年9月到2015年10月。2、供試土壤基本性狀供試土壤基本理化性狀測定結(jié)果見表11。表11、試驗(yàn)點(diǎn)土壤養(yǎng)分基本情況3、供試作物供試作物為桃樹，品種名稱為艷紅。4、試驗(yàn)處理及大田設(shè)置本試驗(yàn)設(shè)置如下三個(gè)處理，重復(fù)三次，各處理小區(qū)隨機(jī)排列。小區(qū)面積111m2，行株距4*2.5m，種植密度40株/667m2，樹齡為3年。處理一：實(shí)施例3中步驟二制備的發(fā)酵后有機(jī)肥處理，底施發(fā)酵后有機(jī)肥330kg/667m2，追施復(fù)混肥50kg/667m2。處理二：空白對照(CK)，基肥和追肥均不施。處理三：常規(guī)施肥，底施復(fù)合肥(購于北京農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料有限公司，總養(yǎng)分含量≥25％)100kg/667m2,追施尿素50kg/667m2。5、田間管理(1)施肥時(shí)間基肥于2014年9月底施用，追肥于2015年3月底施用，除施肥不同外，其它管理措施一致。(2)施肥方法在樹冠外圍開寬25cm，深15cm的環(huán)形溝，將底肥或追肥均勻施入溝內(nèi)，再覆土蓋于上面。(3)澆水與中耕生長季節(jié)適時(shí)澆水，澆水后及時(shí)進(jìn)行中耕作業(yè)。(4)其它管理采用人工授粉和蜜蜂授粉結(jié)合的方法提高坐果率；開花時(shí)疏花，套袋前定果，一般每個(gè)花序留1個(gè)果，每隔0.15米留2個(gè)果，留優(yōu)質(zhì)果，6月中旬套袋。采收前25天脫袋。脫袋后進(jìn)行摘葉、轉(zhuǎn)果等提高品質(zhì)。6、田間調(diào)查(1)生物學(xué)性狀調(diào)查每個(gè)小區(qū)選擇樹體大小和長勢相似的5株進(jìn)行生物學(xué)性狀和果實(shí)品質(zhì)調(diào)查。(2)產(chǎn)量調(diào)查9月中旬果實(shí)成熟后，開始采收。按單株采收，每個(gè)處理采收5株，稱重，并按小區(qū)分別記載產(chǎn)量。二、試驗(yàn)結(jié)果與分析1、不同施肥處理對桃樹生物學(xué)性狀的影響在桃樹生長期對生物學(xué)性狀及果實(shí)品質(zhì)進(jìn)行調(diào)查記載，結(jié)果見表12。從表12可以看出，兩個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)三個(gè)處理的盛花期、幼果期和成熟期一致。處理一和處理三的葉片顏色較其它處理深。處理一比其它處理單果重、含糖量有所提高，畸形果率有所下降，其中后北宮村試驗(yàn)點(diǎn)，處理一較處理二(空白對照)單果重增加13.1g，含糖量增加1.5％，畸形果率降低3.6％。鎮(zhèn)羅營村處理一較處理二(空白對照)單果重增加18.1g，含糖量增加0.9％，畸形果率降低4.2％。從以上的比較可以看出，施用有機(jī)肥能明顯改善桃樹植株生物學(xué)性狀，有利于桃樹高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)。表12、桃樹施肥試驗(yàn)各處理生物學(xué)性狀及品質(zhì)調(diào)查2、不同施肥處理對桃樹產(chǎn)量的影響桃樹采收期各小區(qū)分別計(jì)產(chǎn)，折合成667m2產(chǎn)量，結(jié)果見表13。從表13中可以看出，各個(gè)試驗(yàn)地點(diǎn)的各處理組一產(chǎn)量平均值均高于處理組二和處理組三的產(chǎn)量平均值。對上述產(chǎn)量結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表14。方差分析結(jié)果表明：兩試驗(yàn)點(diǎn)處理間差異顯著，重復(fù)間差異不顯著。進(jìn)一步對表12的產(chǎn)量結(jié)果進(jìn)行多重比較，結(jié)果見表15。由表15可以看出，后北宮村試驗(yàn)點(diǎn)，處理一與處理二、處理三相比，產(chǎn)量均有不同程度增加，分別增加1357.3kg/667m2、324.1kg/667m2，增產(chǎn)率分別為16.0％、3.4％，而且處理一與處理二產(chǎn)量達(dá)到極顯著差異；鎮(zhèn)羅營試驗(yàn)點(diǎn)，處理一與處理二、處理三相比均由不同程度增產(chǎn)，產(chǎn)量分別1707.0kg/667m2、299.5kg/667m2，增產(chǎn)率分別為20.6％、3.1％，其中處理一與處理二產(chǎn)量差異達(dá)顯著水平。表13、不同處理產(chǎn)量結(jié)果表14、產(chǎn)量結(jié)果的方差分析表15、不同處理產(chǎn)量多重比較結(jié)果上述兩個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)結(jié)果表明，利用本發(fā)明的堆肥發(fā)酵劑發(fā)酵雞糞和香菇渣生產(chǎn)的有機(jī)肥處理桃畸形果率較常規(guī)施肥和空白對照均有所降低，而單果重和果實(shí)含糖量有所提高。其中畸形果率降低0.7-3.6％，單果重提高9.9-25.6g，果實(shí)含糖量提高0.5-1.5％，產(chǎn)量提高3.0％以上。結(jié)果表明：利用本發(fā)明的堆肥發(fā)酵劑發(fā)酵雞糞和香菇渣生產(chǎn)的有機(jī)肥能夠降低桃樹畸形果率，提高單果重，改善果實(shí)品質(zhì)，提高桃產(chǎn)量。證明利用本發(fā)明的堆肥發(fā)酵劑發(fā)酵雞糞和香菇渣生產(chǎn)的有機(jī)肥具有一定的肥效。當(dāng)前第1頁1 2 3