1.一種蝦青素十六碳二烯酸單酯的制備方法,其特征在于:包括以下步驟:
步驟一、粗提液的制備:
用天平稱取5.0 g雨生紅球藻藻粉,加入濃度為0.5-0.7 mg/mL的纖維素酶液200 mL,酶反應(yīng)pH為4.0-5.0,在45-50 oC的條件下破壁25-30 min,然后在5000 rpm條件下離心5 min,棄上清后,將500 mL的丙酮加入藻粉中,浸提40 min,再次離心后,棄去下層沉淀,制得粗提液;將所述粗提液濃縮蒸干,充氮,于-20 oC條件下保存,備用;
步驟二、溶劑系統(tǒng)的建立:
按體積比4:1:2配制正己烷-乙腈-甲醇溶劑系統(tǒng);分別按照上述比例配制溶劑系統(tǒng)溶液1500 mL,置于分液漏斗中,劇烈振蕩充分混合后靜置分層,平衡后將上下兩相分開,以下相作為流動相,上相作為固定相,在使用前上下相分別超聲脫氣30 min;
步驟三、高速逆流色譜純化:
打開泵,將超聲脫氣后的上相作為固定相以30 mL/min的流速泵入到高速逆流色譜儀中,直至上相充滿整個HSCCC分離管中,暫停泵,將進(jìn)液端放到流動相的試劑瓶中,打開主機(jī)的電源,設(shè)定轉(zhuǎn)速850r/min,啟動泵;在出液端用干凈的量筒接液,在474nm波長下采集數(shù)據(jù),收集洗脫時間為31-40min的目標(biāo)成分,初步用TLC分析流出物,合并相同組分,制得化合物,即蝦青素十六碳二烯酸單酯。
2.如權(quán)利要求1所述的一種蝦青素十六碳二烯酸單酯的制備方法,其特征在于:還包括步驟四、純化物的鑒定:采用高效液相色譜HPLC法或采用ESI-MS法分析所述化合物,或采用高效液相色譜HPLC法分析皂化后的所述化合物。
3.如權(quán)利要求2所述的一種蝦青素十六碳二烯酸單酯的制備方法,其特征在于:所述采用高效液相色譜HPLC法:將所述化合物配成2 mg/mL的樣品溶液,高效液相的條件:進(jìn)樣量5 μL,柱溫35 oC,檢測波長474 nm,流速0.2 mL/min;分析所述化合物的保留時間和特征吸收峰,判斷所述述化合物的保留時間是否為44.5min,特征吸收峰是否為408nm。
4.如權(quán)利要求2所述的一種蝦青素十六碳二烯酸單酯的制備方法,其特征在于:所述ESI-MS法采用正離子模式;參數(shù)設(shè)置如下:氮氣干燥流量10.0 L/min,霧化壓力為20 psi,毛細(xì)管電壓+5000 V,端板電壓+4000 V,毛細(xì)管出口電壓80 V,干燥溫度200 oC,霧化室溫度50 oC,干燥氣體壓力20 psi,霧化氣體壓力50 psi;判斷一級質(zhì)譜m/z是否為 832.4。
5.如權(quán)利要求2所述的一種蝦青素十六碳二烯酸單酯的制備方法,其特征在于:采用高效液相色譜HPLC法分析皂化后的所述化合物:將所述化合物12.5 mg溶解在150 mL的二氯甲烷溶液中,作為每組試驗的樣品溶液,然后加入含質(zhì)量體積濃度為15.6%的NaOH的甲醇溶液,在磁力攪拌條件下,15.14℃溫度下反應(yīng)9.17min后,終止反應(yīng);加入蒸餾水直至溶液出現(xiàn)分層,上層漂浮有白色泡沫,下層呈紅色的澄清溶液,離心棄去上清后,將下層溶液完全蒸干得到皂化產(chǎn)物,用HPLC法分析產(chǎn)物的保留時間和特征吸收峰,判斷皂化后的所述述化合物的保留時間是否為12.7min。
6.如權(quán)利要求1所述的一種蝦青素十六碳二烯酸單酯的制備方法,其特征在于:所述步驟一中,加入濃度為0.6mg/mL的纖維素酶液200 mL,在50 oC的條件下破壁30 min。