本發(fā)明涉及生物制劑技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種蝦青素十六碳二烯酸單酯的制備方法。

背景技術(shù)：

雨生紅球藻是一種廣泛分布于自然界的淡水藻，屬于綠藻門、綠藻綱、團藻目、紅球藻科、紅球藻屬。雨生紅球藻通常只有處于脅迫條件時才開始積累蝦青素，以渡過不利的環(huán)境條件。關(guān)于雨生紅球藻積累蝦青素的營養(yǎng)鹽及環(huán)境條件的研究表明，當其處于氮饑餓、高光強等條件下時，能夠大量積累蝦青素。近年來，光生物反應(yīng)器技術(shù)的發(fā)展大大促進了雨生紅球藻的養(yǎng)殖及蝦青素的積累，應(yīng)用這種技術(shù)可使藻體中蝦青素含量達到干重的1.5-3%。

從雨生紅球藻中提取蝦青素的方法多種多樣，歐陽琴等對雨生紅球藻厚壁孢子細胞的幾種常用機械破壁方法的工藝條件分別進行研究，分別比較了幾種不同破壁方法對破壁率和蝦青素提取率的影響，結(jié)果表明高壓均質(zhì)法最適合于雨生紅球藻中厚壁孢子的破碎和蝦青素的提取，氯仿:乙醇（1:1，v/v）的混合溶劑最有利于從雨生紅球藻孢子態(tài)細胞中提取出蝦青素。Dong等人比較了4種不同的方法從雨生紅球藻中提取蝦青素，結(jié)果表明鹽酸破壁后用丙酮提取的得率最高，且這種方法得到的粗提物的DPPH自由基清除能力也最高。周錦珂以雨生紅球藻粉為原料利用纖維素酶對雨生紅球藻進行酶解處理，然后用乙醇提取蝦青素，在最佳條件下蝦青素的提取率高達94.6%。

蝦青素末端環(huán)狀結(jié)構(gòu)中各有一個羥基（-OH），這種自由羥基可與脂肪酸形成酯，雨生紅球藻中的蝦青素多數(shù)以酯的形式存在。如果其中一個羥基與脂肪酸成酯，稱蝦青素單酯；如果兩個羥基都與脂肪酸成酯，則稱為蝦青素雙酯。在魚類吸收和色素沉積方面，蝦青素酯和游離蝦青素在生物利用方面差別很小。由于能夠與蝦青素酯化形成蝦青素單酯和雙酯的脂肪酸種類繁多，而且蝦青素酯的極性比蝦青素更小，且各類蝦青素酯的結(jié)構(gòu)極性相近，很難將單獨一種蝦青素酯分離純化出來；采用傳統(tǒng)柱層析法分離純化蝦青素酯，耗時長且得率很低，不利于大量制備純的蝦青素酯。因此，對蝦青素酯分離純化的研究鮮見報道。有鑒于此，本發(fā)明人研究和設(shè)計了一種蝦青素十六碳二烯酸單酯的制備方法，本案由此產(chǎn)生。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種蝦青素十六碳二烯酸單酯的制備方法。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案是：

一種蝦青素十六碳二烯酸單酯的制備方法，包括以下步驟：

步驟一、粗提液的制備：

用天平稱取5.0 g雨生紅球藻藻粉，加入濃度為0.5-0.7 mg/mL的纖維素酶液200 mL，酶反應(yīng)pH為4.0-5.0，在45-50 ^oC的條件下破壁25-30 min，然后在5000 rpm條件下離心5 min，棄上清后，將500 mL的丙酮加入藻粉中，浸提40 min，再次離心后，棄去下層沉淀，制得粗提液；將所述粗提液濃縮蒸干，充氮，于-20 ^oC條件下保存，備用；

步驟二、溶劑系統(tǒng)的建立：

按體積比4:1:2配制正己烷-乙腈-甲醇溶劑系統(tǒng)；分別按照上述比例配制溶劑系統(tǒng)溶液1500 mL，置于分液漏斗中，劇烈振蕩充分混合后靜置分層，平衡后將上下兩相分開，以下相作為流動相，上相作為固定相，在使用前上下相分別超聲脫氣30 min；

步驟三、高速逆流色譜純化：

打開泵，將超聲脫氣后的上相作為固定相以30 mL/min的流速泵入到高速逆流色譜儀中，直至上相充滿整個HSCCC分離管中，暫停泵，將進液端放到流動相的試劑瓶中，打開主機的電源，設(shè)定轉(zhuǎn)速850r/min，啟動泵；在出液端用干凈的量筒接液，在474nm波長下采集數(shù)據(jù)，收集洗脫時間為31-40min的目標成分，初步用TLC分析流出物，合并相同組分，制得化合物，即蝦青素十六碳二烯酸單酯。

作為實施例的優(yōu)選方式，還包括步驟四、純化物的鑒定：采用高效液相色譜HPLC法或采用ESI-MS法分析所述化合物，或采用高效液相色譜HPLC法分析皂化后的所述化合物。

作為實施例的優(yōu)選方式，所述采用高效液相色譜HPLC法：將所述化合物配成2 mg/mL的樣品溶液，高效液相的條件：進樣量5 μL，柱溫35 ^oC，檢測波長474 nm，流速0.2 mL/min；分析所述化合物的保留時間和特征吸收峰，判斷所述述化合物的保留時間是否為44.5min，特征吸收峰是否為408nm。

作為實施例的優(yōu)選方式，所述ESI-MS法采用正離子模式；參數(shù)設(shè)置如下：氮氣干燥流量10.0 L/min，霧化壓力為20 psi，毛細管電壓+5000 V，端板電壓+4000 V，毛細管出口電壓80 V，干燥溫度200 ^oC，霧化室溫度50 ^oC，干燥氣體壓力20 psi，霧化氣體壓力50 psi；判斷一級質(zhì)譜m/z是否為 832.4。

作為實施例的優(yōu)選方式，采用高效液相色譜HPLC法分析皂化后的所述化合物：將所述化合物12.5 mg溶解在150 mL的二氯甲烷溶液中，作為每組試驗的樣品溶液，然后加入含質(zhì)量體積濃度為15.6%的NaOH的甲醇溶液，在磁力攪拌條件下，15.14℃溫度下反應(yīng)9.17min后，終止反應(yīng)；加入蒸餾水直至溶液出現(xiàn)分層，上層漂浮有白色泡沫，下層呈紅色的澄清溶液，離心棄去上清后，將下層溶液完全蒸干得到皂化產(chǎn)物，用HPLC法分析產(chǎn)物的保留時間和特征吸收峰，判斷皂化后的所述述化合物的保留時間是否為12.7min。

作為實施例的優(yōu)選方式，所述步驟一中，加入濃度為0.6mg/mL的纖維素酶液200 mL，在50 ^oC的條件下破壁30 min。

本發(fā)明首次采用高速逆流色譜純化法從雨生紅球藻藻粉分離得到了蝦青素十六碳二烯酸單酯，進一步采用HPLC和ESI-MS技術(shù)鑒定純化得到的化合物的結(jié)構(gòu)，從而對后續(xù)蝦青素酯的研究具有重大意義。

說明書附圖

圖1為本發(fā)明雨生紅球藻中粗提物的HPLC分析圖；

圖2為本發(fā)明的HSCCC溶劑系統(tǒng)純化結(jié)果；

圖3為本發(fā)明HPLC和UVS分析HSCCC純化得到的組分2結(jié)果；

圖4為本發(fā)明質(zhì)譜分析HSCCC純化得到的組分2結(jié)果；

圖5為本發(fā)明 HPLC分析皂化后的組分2結(jié)果。

具體實施方式

本發(fā)明公開了一種蝦青素十六碳二烯酸單酯的制備方法，包括以下步驟：

步驟一、粗提液的制備：

用天平稱取5.0 g雨生紅球藻藻粉，雨生紅球藻藻粉購于湖北雅仕達生物技術(shù)荊州市天然蝦青素有限公司，加入濃度為0.5-0.7 mg/mL的纖維素酶液200 mL，酶反應(yīng)pH為4.0-5.0，在45-50 ^oC的條件下破壁25-30 min，然后在5000 rpm條件下離心5 min，棄上清后，將500 mL的丙酮加入藻粉中，浸提40 min，再次離心后，棄去下層沉淀，制得粗提液；將所述粗提液濃縮蒸干，充氮，于-20 ^oC條件下保存，備用；

步驟二、溶劑系統(tǒng)的建立：

按體積比4:1:2配制正己烷-乙腈-甲醇溶劑系統(tǒng)；分別按照上述比例配制溶劑系統(tǒng)溶液1500 mL，置于分液漏斗中，劇烈振蕩充分混合后靜置分層，平衡后將上下兩相分開，以下相作為流動相，上相作為固定相，在使用前上下相分別超聲脫氣30 min；

步驟三、高速逆流色譜純化：

打開泵，將超聲脫氣后的上相作為固定相以30 mL/min的流速泵入到高速逆流色譜儀中，直至上相充滿整個HSCCC分離管中，暫停泵，將進液端放到流動相的試劑瓶中，打開主機的電源，設(shè)定轉(zhuǎn)速850r/min，啟動泵；在出液端用干凈的量筒接液，在474nm波長下采集數(shù)據(jù)，收集洗脫時間為31-40min的目標成分，初步用TLC分析流出物，合并相同組分，制得化合物，即蝦青素十六碳二烯酸單酯。

作為實施例的優(yōu)選方式，所述步驟一中，加入濃度為0.6mg/mL的纖維素酶液200 mL，在50 ^oC的條件下破壁30 min。

作為實施例的優(yōu)選方式，還包括步驟四、純化物的鑒定：采用高效液相色譜HPLC法或采用ESI-MS法分析所述化合物，或采用高效液相色譜HPLC法分析皂化后的所述化合物。

由于已知的蝦青素酯種類較多且與之酯化結(jié)合的脂肪酸鑒定比較困難，為進一步鑒定純化得到的化合物是否為蝦青素酯，需要對得到的化合物進行皂化實驗，將蝦青素酯皂化還原為蝦青素，若皂化后產(chǎn)物在HPLC檢測后，得到蝦青素的特征吸收峰，則證明純化得到的化合物為蝦青素酯，反之，則為其他類胡蘿卜素。

作為實施例的優(yōu)選方式，所述采用高效液相色譜HPLC法：將所述化合物配成2 mg/mL的樣品溶液，高效液相的條件：進樣量5 μL，柱溫35 ^oC，檢測波長474 nm，流速0.2 mL/min；分析所述化合物的保留時間和特征吸收峰，判斷所述述化合物的保留時間是否為44.5min，特征吸收峰是否為408nm。

雨生紅球藻中粗提物各組分的HPLC分析結(jié)果如圖1所示。其中數(shù)字1-6代表HSCCC分離得到的6個化合物，從圖中可以看出，游離類胡蘿卜素的保留時間為12-35 min，蝦青素單酯的保留時間集中在42-50 min，而蝦青素雙酯的保留時間在55 min之后。實驗結(jié)果與各化合物的極性大小是相對應(yīng)的，游離的類胡蘿卜素，如蝦青素、角黃素、葉黃素等的極性相對較大，因而洗脫時間較短；蝦青素一端被酯化后，成為蝦青素單酯，極性變小，洗脫時間相應(yīng)的增加；蝦青素兩端被酯化后，變成蝦青素雙酯，分子極性進一步變小，洗脫時間最長。

如圖2所示，使用HSCCC溶劑體系，粗提物溶液分離純化得到了4個組分，洗脫時間分別為22-27 min、31-40 min、102-104 min、103-111 min，分別將它們命名為化合物1、2、5、6（與圖2中各個峰相對應(yīng)），并且發(fā)現(xiàn)分離得到峰A（12-20 min）的量很大（25.51 mg），也當做一個組分收集以備下一步純化。使用二級溶劑體系正己烷-甲醇（2:1，v/v），將之前得到的峰A組分溶解在此溶劑體系的下相中，作為二級溶劑系統(tǒng)的樣品溶液，繼續(xù)純化得到了化合物3和化合物4，洗脫時間分別為40-48 min和52-60 min。將上述純化得到的化合物蒸干后稱量，得到化合物1-6的質(zhì)量分別為10.35 mg、8.47 mg、15.25 mg、4.33 mg、15.65 mg、6.05 mg。

作為實施例的優(yōu)選方式，所述ESI-MS法采用正離子模式；參數(shù)設(shè)置如下：氮氣干燥流量10.0 L/min，霧化壓力為20 psi，毛細管電壓+5000 V，端板電壓+4000 V，毛細管出口電壓80 V，干燥溫度200 ^oC，霧化室溫度50 ^oC，干燥氣體壓力20 psi，霧化氣體壓力50 psi；判斷一級質(zhì)譜m/z是否為 832.4。

作為實施例的優(yōu)選方式，采用高效液相色譜HPLC法分析皂化后的所述化合物：將所述化合物12.5 mg溶解在150 mL的二氯甲烷溶液中，作為每組試驗的樣品溶液，然后加入含質(zhì)量體積濃度為15.6%的NaOH的甲醇溶液，在磁力攪拌條件下，15.14℃溫度下反應(yīng)9.17min后，終止反應(yīng)；加入蒸餾水直至溶液出現(xiàn)分層，上層漂浮有白色泡沫，下層呈紅色的澄清溶液，離心棄去上清后，將下層溶液完全蒸干得到皂化產(chǎn)物，用HPLC法分析產(chǎn)物的保留時間和特征吸收峰，判斷皂化后的所述述化合物的保留時間是否為12.7min。

化合物2為紅色固體粉末，在408 nm波長下有最大紫外吸收，HPLC分析化合物2的保留時間為44.5 min，結(jié)果如圖3所示；化合物2的一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)顯示m/z 832.4，結(jié)果如圖4所示，比蝦青素十六碳二烯酸單酯分子量多1，推斷其為[M+H]⁺的分子離子峰；化合物2的皂化后的產(chǎn)物HPLC結(jié)果顯示，皂化后在保留時間12.7 min出現(xiàn)了蝦青素的特征峰，結(jié)果如圖5所示，化合物2為蝦青素酯得到驗證；綜上所述，化合物2是蝦青素十六碳二烯酸單酯。

本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認為是本發(fā)明的保護范圍。