本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，更具體地，涉及一種喜樹(shù)堿磷酸酯類化合物、其制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

喜樹(shù)堿是Wall等于1966年首先從中國(guó)特有的珙桐科植物喜樹(shù)(camptotheca acuminata)中分離得到的一種具有顯著細(xì)胞毒活性的喹啉類生物堿(J.Nat.Prod.2004,67,129-135)，對(duì)骨癌、肝癌、膀胱癌和白血病等多種惡性腫瘤表現(xiàn)出較好的抑制作用，但在臨床使用時(shí)發(fā)現(xiàn)，喜樹(shù)堿在發(fā)揮其抗腫瘤活性時(shí)會(huì)產(chǎn)生骨髓抑制、嘔吐和腹瀉等較嚴(yán)重的副作用，同時(shí)因其分子結(jié)構(gòu)中喹啉環(huán)上氮的特殊堿性而水溶性較差，不能直接人體非腸道給藥。為進(jìn)一步改善其水溶性和降低其毒副作用，20世紀(jì)70年代初期對(duì)喜樹(shù)堿的水溶性鈉鹽進(jìn)行了Ⅰ期臨床試驗(yàn)，雖然觀察到了一定的抗癌活性和大大提高了該類藥物的水溶性，卻因其嚴(yán)重而且不可預(yù)見(jiàn)的毒副作用使得進(jìn)一步臨床試驗(yàn)中斷。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)喜樹(shù)堿類藥物進(jìn)行了系統(tǒng)深入的研究，其中以其為先導(dǎo)衍生合成的多個(gè)活性化合物如伊立替康、拓?fù)涮婵怠?-氨基喜樹(shù)堿、9-硝基喜樹(shù)堿、DX-8951f、GG-211、BNP-1350、ST-1481和CKD-602等已被FDA批準(zhǔn)上市或處于臨床研究階段(①Bioorg.Med.Chem.2004,12,1585–1604；②Phytochem.2004,65,2735–2749)。但由于喜樹(shù)堿類衍生物結(jié)構(gòu)中具有抗腫瘤活性的內(nèi)酯環(huán)(E環(huán))在人體內(nèi)生理?xiàng)l件下容易水解開(kāi)環(huán)，造成抗腫瘤活性降低。且實(shí)驗(yàn)證明，在血漿中內(nèi)酯環(huán)形式與開(kāi)環(huán)形式存在平衡，內(nèi)酯環(huán)形式的濃度和藥物療效存在正比關(guān)系。而開(kāi)環(huán)形式是導(dǎo)致不良反應(yīng)的原因所在，如引起骨髓抑制、嘔吐、腹瀉和血尿等((1)藥學(xué)學(xué)報(bào).2003,38,715–720；(2)J.Org.Chem.,2000,65,4601-4606。)。因此對(duì)E環(huán)-20位的結(jié)構(gòu)修飾和改造，提高內(nèi)酯環(huán)形式在人血漿中的比例以期提高該類化合物的活性并減小毒性，成為目前研發(fā)喜樹(shù)堿類藥物的主要研究課題之一。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的以上缺陷或改進(jìn)需求，本發(fā)明提供了一種喜樹(shù)堿磷酸酯類化合物、其制備方法及應(yīng)用，其目的在于通過(guò)以喜樹(shù)堿構(gòu)效關(guān)系研究為指導(dǎo)，將喜樹(shù)堿20位羥基進(jìn)行修飾形成酯鍵，提高內(nèi)酯環(huán)的穩(wěn)定性，由此解決現(xiàn)有喜樹(shù)堿衍生物作為抗腫瘤藥物的活性低、毒副作用大的技術(shù)問(wèn)題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，按照本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種喜樹(shù)堿磷酸酯類化合物，其特征在于，其具有式(I)的結(jié)構(gòu)：

其中，R₁和R₂各自獨(dú)立地為H或烴基，所述烴基為直鏈烷基、支鏈烷基、芳基或雜芳基。

優(yōu)選地，所述R₁和R₂各自獨(dú)立地為C₁-C₁₂的烷基。

優(yōu)選地，所述R₁和R₂各自獨(dú)立地為C₁-C₇的烷基。

優(yōu)選地，所述R₁為H、甲基、2-丙基、異丁基、芐基或2-甲基丙基；所述R₂為甲基、乙基或苯基。

優(yōu)選地，所述喜樹(shù)堿磷酸酯類化合物是由喜樹(shù)堿氨基酸酯與甲醛和亞磷酸酯反應(yīng)得到。

按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種所述的喜樹(shù)堿磷酸酯類化合物的制備方法，按照如下步驟進(jìn)行：以喜樹(shù)堿氨基酸酯為原料，以四氫呋喃為溶劑，向反應(yīng)體系加入三乙胺和催化劑量的無(wú)水三氯化鐵混合均勻，然后向反應(yīng)體系加入甲醛與亞磷酸酯，所述喜樹(shù)堿氨基酸酯與甲醛和亞磷酸酯反應(yīng)摩爾比為1:5:2.5，在60℃～100℃反應(yīng)完全后，即可得到所述的喜樹(shù)堿磷酸酯類化合物。

優(yōu)選地，所述制備方法還包括分離步驟，所述分離步驟為柱層析分離。

優(yōu)選地，所述柱層析采用的硅膠為200～300目的柱層析用硅膠。

按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種所述的喜樹(shù)堿磷酸酯類化合物的應(yīng)用，應(yīng)用于制備治療癌癥細(xì)胞的藥物。

優(yōu)選地，所述癌癥細(xì)胞包括人肝癌細(xì)胞(Hep3B)、人肺腺癌細(xì)胞(A549)、人乳腺癌細(xì)胞株(MDA-MB-231和MCF-7)、人口腔表皮樣癌細(xì)胞(KB)或人口腔表皮樣癌細(xì)胞耐藥株(KBvin)腫瘤細(xì)胞。

總體而言，通過(guò)本發(fā)明所構(gòu)思的以上技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，能夠取得下列有益效果：

(1)本發(fā)明以喜樹(shù)堿構(gòu)效關(guān)系研究為指導(dǎo)，以不同氨基酸取代的喜樹(shù)堿衍生物作為原料，將喜樹(shù)堿20位羥基進(jìn)行修飾形成酯鍵，制備得到了本發(fā)明所述的喜樹(shù)堿磷酸酯類化合物，進(jìn)一步阻止羥基和鄰位酯羰基形成了分子內(nèi)氫鍵，提高了內(nèi)酯環(huán)的穩(wěn)定性，從而提高了喜樹(shù)堿的成藥性、抗腫瘤活性并降低了其毒性。

(2)本發(fā)明利用氨基酸在體內(nèi)被主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，可作為藥動(dòng)團(tuán)連于藥效團(tuán)，以利于吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)這一原理，同時(shí)運(yùn)用“多樣性合成”這一思想，將磷酸酯這一藥物分子上常用的活性官能團(tuán)與喜樹(shù)堿氨基酸酯通過(guò)多組分反應(yīng)的方式結(jié)合而合成了本發(fā)明所述的一類新型的喜樹(shù)堿衍生物。

(3)經(jīng)體外抗腫瘤活性篩選結(jié)果表明，本發(fā)明所述的喜樹(shù)堿磷酸酯類化合物對(duì)人肺腺癌細(xì)胞(A549)、人乳腺癌細(xì)胞株(MDA-MB-231)、人口腔表皮樣癌細(xì)胞(KB)和人口腔表皮樣癌細(xì)胞耐藥株(KBvin)表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性，且一些化合物高于目前臨床藥物拓?fù)涮婵担虼吮景l(fā)明的化合物可用于制備抗腫瘤的藥物。

(4)本發(fā)明所述的喜樹(shù)堿類化合物結(jié)構(gòu)新穎、合成工藝簡(jiǎn)單、產(chǎn)品純度高，對(duì)腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，具有優(yōu)良的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明提供的喜樹(shù)堿磷酸酯類化合物的通式結(jié)構(gòu)圖；

圖2是化合物Ig處理Hep3B和MCF7細(xì)胞后的細(xì)胞表型結(jié)果示意圖；

圖3是化合物Ig使Hep3B和MCF7細(xì)胞周期阻滯在S/G2期并產(chǎn)生凋亡測(cè)試結(jié)果示意圖；

圖4是化合物Ig和CPT-11在試管和細(xì)胞內(nèi)抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶I的活性測(cè)試結(jié)果示意圖；

圖5是化合物Ig在裸鼠移植瘤模型中抗腫瘤作用研究結(jié)果示意圖；

圖6是原位肝癌中，化合物Ig抑制肝癌形成測(cè)試結(jié)果示意圖；

圖7是化合物Ig在小鼠原位癌模型中抑制細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期和促進(jìn)細(xì)胞凋亡測(cè)試結(jié)果示意圖；

圖8是化合物Ig急性毒理研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。此外，下面所描述的本發(fā)明各個(gè)實(shí)施方式中所涉及到的技術(shù)特征只要彼此之間未構(gòu)成沖突就可以相互組合。

本發(fā)明所述的喜樹(shù)堿磷酸酯類化合物具有式(I)所示的化學(xué)結(jié)構(gòu)：

其中，R₁和R₂各自獨(dú)立地為H或烴基，所述烴基為直鏈烷基、支鏈烷基、芳基或雜芳基，R₁和R₂各自獨(dú)立地優(yōu)選為C₁-C₁₂的烷基，進(jìn)一步優(yōu)選為C₁-C₇的烷基。

更進(jìn)一步地優(yōu)選，R₁為H、甲基、2-丙基、異丁基、芐基或2-甲基丙基；所述R₂為甲基、乙基或苯基。

本發(fā)明所述的喜樹(shù)堿磷酸酯類化合物制備方法按如下化學(xué)反應(yīng)式進(jìn)行：

本發(fā)明的喜樹(shù)堿磷酸酯類化合物(式I化合物)制備方法是以喜樹(shù)堿氨基酸酯為原料，適量的四氫呋喃作溶劑，滴加三乙胺，向反應(yīng)體系加入催化劑量的無(wú)水三氯化鐵，待攪拌10分鐘后，向反應(yīng)體系加入反應(yīng)量的甲醛與亞磷酸酯，60～100℃反應(yīng)8個(gè)小時(shí)，薄層層析檢測(cè)，柱層析(洗脫體系為氯仿:甲醇)分離，得到目標(biāo)化合物。

本發(fā)明的喜樹(shù)堿磷酸酯類化合物優(yōu)選的制備方法是將喜樹(shù)堿氨基酸酯(2mmol)于圓底燒瓶中，加入四氫呋喃(10mL)作溶劑，滴加三乙胺(2mmol)，向反應(yīng)體系加入無(wú)水三氯化鐵(0.3mmol)，待攪拌10分鐘后，向反應(yīng)體系加入甲醛(10mmol)和的亞磷酸酯(5mmol)，60攝氏度反應(yīng)8個(gè)小時(shí)，薄層層析板檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)度，待反應(yīng)完成后，用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌有機(jī)相，無(wú)水硫酸鎂干燥后減壓濃縮，柱層析分離(CHCl₃:MeOH)純化即得目標(biāo)產(chǎn)物，其中柱層析采用的硅膠為200～300目的柱層析用硅膠。

本發(fā)明所用的原料喜樹(shù)堿-20-O-L-氨基酯的制備方法參見(jiàn)文獻(xiàn)方法(Bioorg.Med.Chem.,1998,6,551-562)。

按照本發(fā)明所述的喜樹(shù)堿磷酸酯類化合物的制備方法，合成了如圖1所示的通式的喜樹(shù)堿磷酸酯類化合物。以下實(shí)施例給出了Ia-Ip一共16中喜樹(shù)堿磷酸酯類化合物的制備合成方法，采用NMR測(cè)定了各化合物結(jié)構(gòu)，并計(jì)算分析了其收率。

本發(fā)明所述的的喜樹(shù)堿磷酸酯類化合物的應(yīng)用，其特征在于，應(yīng)用于制備治療癌癥細(xì)胞的藥物，所述癌癥細(xì)胞包括人肝癌細(xì)胞(Hep3B)、人肺腺癌細(xì)胞(A549)、人乳腺癌細(xì)胞株(MDA-MB-231和MCF-7)、人口腔表皮樣癌細(xì)胞(KB)或人口腔表皮樣癌細(xì)胞耐藥株(KBvin)腫瘤細(xì)胞。

以下為實(shí)施例：

實(shí)施例1：目標(biāo)化合物Ia的合成

原料喜樹(shù)堿20-O-L-甘氨酸酯的合成：取N-Boc-甘氨酸(3.13mmol)于圓底燒瓶中，加入干燥的二氯甲烷(200mL)使其溶解，隨后在冰浴下依次加入喜樹(shù)堿(3.13mmol)、N,N'-二異丙基碳二亞胺(DIPC,3.13mmol)以及4-二甲氨基吡啶(DMAP,3.13mmol)。反應(yīng)在室溫下攪拌16小時(shí)。薄層層析檢測(cè)反應(yīng)完成后，抽濾除去固體雜質(zhì)，隨后用0.1N的鹽酸洗滌有機(jī)相，干燥，減壓濃縮后得到白色固體，柱層析(氯仿-甲醇)分離得到中間體喜樹(shù)堿-20-O-(N’-叔丁氧羰基)-L-甘氨酸酯。取喜樹(shù)堿-20-O-(N’-叔丁氧羰基)-L-甘氨酸酯(2mmol)于圓底燒瓶中，加入CH₂Cl₂(2mL)和TFA(2mL)，室溫?cái)嚢?小時(shí)后減壓除去溶劑，用甲醇重結(jié)晶得到最終的喜樹(shù)堿-20-O-L-甘氨酸酯的三氟乙酸鹽。合成方法參見(jiàn)文獻(xiàn)方法(Bioorg.Med.Chem.,1998,6,551-562)。

其反應(yīng)式為：

化合物Ia的合成：取喜樹(shù)堿甘氨酸酸酯(2mmol)于圓底燒瓶中，加入四氫呋喃(10mL)作溶劑，隨后滴加三乙胺(2mmol)，之后向反應(yīng)體系加入無(wú)水三氯化鐵(0.3mmol)，待攪拌10分鐘后，向反應(yīng)體系加入甲醛(10mmol)和的亞磷酸二甲酯(5mmol)，60攝氏度反應(yīng)8個(gè)小時(shí)，薄層層析板檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)度，待反應(yīng)完成后，用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌有機(jī)相，無(wú)水硫酸鎂干燥后減壓濃縮，柱層析分離(CHCl₃-MeOH)純化即得目標(biāo)產(chǎn)物，其中層析用硅膠柱采用200～300目的柱層析用硅膠。

其反應(yīng)式如下：

反應(yīng)所得產(chǎn)物檢測(cè)數(shù)據(jù)如下：產(chǎn)率：53％；熔點(diǎn):285-288℃；¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ:8.40(s,1H,C7-H),8.22(m,2H,C9-H,C12-H),7.82(t,1H,C10-H,J＝4Hz),7.66(t,1H,C11-H，J＝4Hz),7.25(s,1H,C14-H),5.70(d,1H,C17-H,J＝16Hz),5.41(d,1H,C17-H,J＝16Hz),5.31(s,2H,C5-H),3.93-4.10(m,2H,甘氨酸-H),3.74-3.80(m,9H,OMe-H),3.27-3.30(m,4H,NCH₂P),2.14-2.28(m,2H,C18-H),0.97(t,3H,C19-H,J＝8Hz)；MS-ESI m/z:650.1[M+H]⁺，證實(shí)為化合物Ia。

實(shí)施例2：目標(biāo)化合物Ib的合成

與實(shí)施例1同，僅以丙氨酸代替甘氨酸。反應(yīng)所得產(chǎn)物檢測(cè)數(shù)據(jù)如下：產(chǎn)率：51％；熔點(diǎn):291-293℃；¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ:8.40(s,1H,C7-H),8.23(m,2H,C9-H,C12-H),7.82(t,1H,C10-H,J＝4Hz),7.67(t,1H,C11-H,J＝4Hz),7.22(s,1H,C14-H),5.70(d,1H,C17-H,J＝20Hz),5.41(d,1H,C17-H,J＝20Hz),5.30(s,2H,C5-H),4.46-4.48(m,1H,丙氨酸-H),3.72-3.84(m,9H,OMe-H),3.30-3.35(m,4H,NCH₂P),2.18-2.33(m,2H,C18-H),1.35(d,3H,丙氨酸-H,J＝8Hz)1.01(t,3H,C19-H,J＝8Hz)；MS-ESI m/z:664.1[M+H]⁺，證實(shí)為化合物Ib。

實(shí)施例3：目標(biāo)化合物Ic的合成

與實(shí)施例1同，僅以纈氨酸代替甘氨酸。反應(yīng)所得產(chǎn)物檢測(cè)數(shù)據(jù)如下：產(chǎn)率：56％；熔點(diǎn):289-291℃；¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ:8.40(s,1H,C7-H),8.23(m,2H,C9-H,C12-H),7.83(t,1H,J＝4Hz,C10-H),7.66(t,1H,J＝4Hz,C11-H),7.32(s,1H,C14-H),5.70(m,1H,C17-H),5.41(m,1H,C17-H),5.30(s,2H,C5-H),3.77-3.88(m,9H,OMe-H),3.68-3.73(m,4H,NCH₂P),3.36-3.48(m,1H,纈氨酸-H),3.03-3.25(m,1H,纈氨酸-H),2.18-2.35(m,2H,C18-H),1.11-1.25(m,6H,纈氨酸-H)1.01(t,3H,J＝8Hz,C19-H)；MS-ESI m/z:692.1[M+H]⁺,證實(shí)為化合物Ic。

實(shí)施例4：目標(biāo)化合物Id的合成

與實(shí)施例1同，僅以亮氨酸代替甘氨酸。反應(yīng)所得產(chǎn)物檢測(cè)數(shù)據(jù)如下：產(chǎn)率：57％；熔點(diǎn):278-280℃；¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ:8.40(s,1H,C7-H),8.23(m,2H,C9-H,C12-H),7.83(t,1H,C10-H,J＝4Hz),7.67(t,1H,C11-H,J＝4Hz),7.20(s,1H,C14-H),5.70(d,1H,C17-H,J＝20Hz),5.41(d,1H,C17-H,J＝20Hz),5.31(s,2H,C5-H),4.36(m,1H,亮氨酸-H),3.77-3.84(m,9H,OMe-H),3.69-3.72(m,4H,NCH₂P),3.11-3.38(m,3H,亮氨酸-H),2.18-2.35(m,2H,C18-H),1.11-1.29(m,6H,亮氨酸-H,J＝8Hz)0.88(t,3H,J＝8Hz,C19-H)；MS-ESI m/z:706.2[M+H]⁺,證實(shí)為化合物Id。

實(shí)施例5：目標(biāo)化合物Ie的合成

與實(shí)施例1同，僅以異亮氨酸代替甘氨酸。反應(yīng)所得產(chǎn)物檢測(cè)數(shù)據(jù)如下：產(chǎn)率：52％；熔點(diǎn):269-271℃；¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ:8.40(s,1H,C7-H),8.23(m,2H,C9-H,C12-H),7.83(t,1H,C10-H,J＝4Hz),7.67(t,1H,C11-H,J＝4Hz),7.20(s,1H,C14-H),5.71(d,1H,C17-H,J＝20Hz),5.41(d,1H,C17-H,J＝20Hz),5.30(s,2H,C5-H),4.11-4.15(m,1H,異亮氨酸-H),3.76-3.85(m,9H,OMe-H),3.69-3.72(m,4H,NCH₂P),3.02-3.19(m,1H,異亮氨酸-H),2.18-2.35(m,2H,C18-H),1.11-1.29(m,8H,異亮氨酸-H,J＝8Hz),0.86(t,3H,J＝8Hz,C19-H)；MS-ESI m/z:706.2[M+H]⁺,證實(shí)為化合物Ie。

實(shí)施例6：目標(biāo)化合物If的合成

與實(shí)施例1同，僅以苯丙氨酸代替甘氨酸。反應(yīng)所得產(chǎn)物檢測(cè)數(shù)據(jù)如下：產(chǎn)率：49％；熔點(diǎn):289-292℃；¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ:8.40(s,1H,C7-H),8.23(m,2H,C9-H,C12-H),7.82(t,1H,C10-H,J＝4Hz),7.67(t,1H,C11-H,J＝4Hz),7.21(d,2H,Ph-H,J＝8Hz,),7.02(t,2H,Ph-H,J＝8Hz),6.79(s,1H,C14-H),6.62(t,1H,Ph-H,J＝8Hz),5.70(d,1H,C17-H,J＝16Hz),5.41(d,1H,C17-H,J＝16Hz),5.30(s,2H,C5-H),4.71-4.74(m,1H,苯丙氨酸-H),3.77-3.82(m,9H,OMe-H),3.64-3.67(m,2H,苯丙氨酸-H),3.31-3.49(m,4H,NCH₂P),2.05-2.26(m,2H,C18-H),0.92(t,3H,J＝8Hz,C19-H)；MS-ESI m/z:740.2[M+H]⁺,證實(shí)為化合物If。

實(shí)施例7：目標(biāo)化合物Ig的合成

與實(shí)施例1同，僅以亞磷酸二乙酯代替亞磷酸二甲酯。反應(yīng)所得產(chǎn)物檢測(cè)數(shù)據(jù)如下：產(chǎn)率：51％；熔點(diǎn):291-293℃；¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ:8.40(s,1H,C7-H),8.22(m,2H,C9-H,C12-H),7.82(t,1H,C10-H,J＝4Hz),7.66(t,1H,C11-H，J＝4Hz),7.28(s,1H,C14-H),5.70(d,1H,C17-H,J＝16Hz),5.41(d,1H,C17-H,J＝16Hz),5.31(s,2H,C5-H),4.08-4.17(m,10H,甘氨酸-H,OCH₂CH₃),3.25-3.27(m,4H,NCH₂P),2.14-2.29(m,2H,C18-H),1.21-1.33(m,12H,OCH₂CH₃),0.97(t,3H,C19-H,J＝8Hz)；MS-ESI m/z:728.2[M+Na]⁺,證實(shí)為化合物Ig。

實(shí)施例8：目標(biāo)化合物Ih的合成

與實(shí)施例1同，僅以亞磷酸二乙酯代替亞磷酸二甲酯，丙氨酸代替甘氨酸。反應(yīng)所得產(chǎn)物檢測(cè)數(shù)據(jù)如下：產(chǎn)率：57％；熔點(diǎn):285-286℃；¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ:8.40(s,1H,C7-H),8.23(m,2H,C9-H,C12-H),7.82(t,1H,C10-H,J＝4Hz),7.67(t,1H,C11-H,J＝4Hz),7.20(s,1H,C14-H),5.69(d,1H,C17-H,J＝20Hz),5.40(d,1H,C17-H,J＝20Hz),5.30(s,2H,C5-H),4.53-4.54(m,1H,丙氨酸-H),4.13-4.23(m,8H,OCH₂CH₃-H),3.29-3.34(m,4H,NCH₂P),2.17-2.34(m,2H,C18-H),1.89(m,3H,丙氨酸-H),1.16-1.36(m,12H,OCH₂CH₃-H)1.01(t,3H,C19-H,J＝8Hz)；MS-ESI m/z:742.3[M+Na]⁺,證實(shí)為化合物Ih。

實(shí)施例9：目標(biāo)化合物Ii的合成

與實(shí)施例1同，僅以亞磷酸二乙酯代替亞磷酸二甲酯，纈氨酸代替甘氨酸。反應(yīng)所得產(chǎn)物檢測(cè)數(shù)據(jù)如下：產(chǎn)率：61％；熔點(diǎn):287-289℃；¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ:8.40(s,1H,C7-H),8.23(m,2H,C9-H,C12-H),7.82(t,1H,C10-H,J＝4Hz),7.67(t,1H,C11-H,J＝4Hz),7.20(s,1H,C14-H),5.71(d,1H,C17-H,J＝20Hz),5.41(d,1H,C17-H,J＝20Hz),5.29(s,2H,C5-H),4.13-4.24(m,8H,OCH₂CH₃-H),3.97-3.99(m,1H,纈氨酸-H),3.37-3.49(m,4H,NCH₂P),3.16-3.20(m,1H,纈氨酸-H),2.13-2.34(m,2H,C18-H),1.13-1.87(m,18H,OCH₂CH₃-H,纈氨酸-H),0.87(t,3H,C19-H,J＝8Hz)；MS-ESI m/z:760.1[M+Na]⁺,證實(shí)為化合物Ii。

實(shí)施例10：目標(biāo)化合物Ij的合成

與實(shí)施例1同，僅以亞磷酸二乙酯代替亞磷酸二甲酯，亮氨酸代替甘氨酸。反應(yīng)所得產(chǎn)物檢測(cè)數(shù)據(jù)如下：產(chǎn)率：70％；熔點(diǎn):267-269℃；¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ:8.40(s,1H,C7-H),8.23(m,2H,C9-H,C12-H),7.82(t,1H,C10-H,J＝4Hz),7.67(t,1H,C11-H,J＝4Hz),7.20(s,1H,C14-H),5.70(d,1H,C17-H,J＝20Hz),5.41(d,1H,C17-H,J＝20Hz),5.31(s,2H,C5-H),4.10-4.26(m,9H,OCH₂CH₃-H,亮氨酸-H),3.37-3.49(m,4H,NCH₂P),3.11-3.19(m,3H,亮氨酸-H),2.13-2.34(m,2H,C18-H),1.07-1.60(m,18H,OCH₂CH₃-H,亮氨酸-H),0.86(t,3H,C19-H,J＝8Hz)；MS-ESI m/z:784.2[M+Na]⁺,證實(shí)為化合物Ij。

實(shí)施例11：目標(biāo)化合物Ik的合成

與實(shí)施例1同，僅以亞磷酸二乙酯代替亞磷酸二甲酯，異亮氨酸代替甘氨酸。反應(yīng)所得產(chǎn)物檢測(cè)數(shù)據(jù)如下：產(chǎn)率：48％；熔點(diǎn):283-286℃；¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ:8.40(s,1H,C7-H),8.23(m,2H,C9-H,C12-H),7.82(t,1H,C10-H,J＝4Hz),7.67(t,1H,C11-H,J＝4Hz),7.20(s,1H,C14-H),5.71(d,1H,C17-H,J＝20Hz),5.41(d,1H,C17-H,J＝20Hz),5.30(s,2H,C5-H),4.10-4.23(m,9H,OCH₂CH₃-H,異亮氨酸-H),3.37-3.49(m,4H,NCH₂P),3.02-3.19(m,1H,異亮氨酸-H),2.13-2.34(m,2H,C18-H),1.07-1.60(m,20H,OCH₂CH₃-H,異亮氨酸-H),0.86(t,3H,C19-H,J＝8Hz)；MS-ESI m/z:784.3[M+Na]⁺,證實(shí)為化合物Ik。

實(shí)施例12：目標(biāo)化合物Il的合成

與實(shí)施例1同，僅以亞磷酸二乙酯代替亞磷酸二甲酯，苯丙氨酸代替甘氨酸。反應(yīng)所得產(chǎn)物檢測(cè)數(shù)據(jù)如下：產(chǎn)率：53％；熔點(diǎn):271-273℃；¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ:8.40(s,1H,C7-H),8.23(m,2H,C9-H,C12-H),7.82(t,1H,C10-H,J＝4Hz),7.67(t,1H,C11-H,J＝4Hz),7.21(d,2H,Ph-H,J＝8Hz,),6.99(t,2H,Ph-H,J＝8Hz),6.77(s,1H,C14-H),6.62(t,1H,Ph-H,J＝8Hz),5.69(d,1H,C17-H,J＝20Hz),5.40(d,1H,C17-H,J＝20Hz),5.26(s,2H,C5-H),4.80-4.84(m,1H,苯丙氨酸-H),4.13-4.23(m,8H,OCH₂CH₃-H),3.27-3.50(m,4H,NCH₂P),2.92-2.95(m,2H,苯丙氨酸-H),2.04-2.25(m,2H,C18-H),1.25-1.36(m,12H,OCH₂CH₃-H)0.92(t,3H,C19-H,J＝8Hz)；MS-ESI m/z:818.3[M+Na]⁺,證實(shí)為化合物Il。

實(shí)施例13：目標(biāo)化合物Im的合成

與實(shí)施例1同，僅以亞磷酸二苯酯代替亞磷酸二甲酯。反應(yīng)所得產(chǎn)物檢測(cè)數(shù)據(jù)如下：產(chǎn)率：49％；熔點(diǎn):278-280℃；¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ:8.40(s,1H,C7-H),8.22(m,2H,C9-H,C12-H),7.75(t,1H,C10-H,J＝4Hz),7.64(t,1H,C11-H，J＝4Hz),7.01-7.24(m,21H,C14-H,Ph-H),5.70(d,1H,C17-H,J＝16Hz),5.41(d,1H,C17-H,J＝16Hz),5.23(s,2H,C5-H),4.12(s,2H,甘氨酸-H),3.69-3.72(m,4H,NCH₂P),2.07-2.24(m,2H,C18-H),0.91(t,3H,C19-H，J＝8Hz)；MS-ESI m/z:920.1[M+Na]⁺,證實(shí)為化合物Im。

實(shí)施例14：目標(biāo)化合物In的合成

與實(shí)施例1同，僅以亞磷酸二苯酯代替亞磷酸二甲酯，丙氨酸代替甘氨酸。反應(yīng)所得產(chǎn)物檢測(cè)數(shù)據(jù)如下：產(chǎn)率：61％；熔點(diǎn):276-279℃；¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ:8.40(s,1H,C7-H),8.22(m,2H,C9-H,C12-H),7.75(t,1H,C10-H,J＝4Hz),7.64(t,1H,C11-H，J＝4Hz),7.07-7.24(m,21H,C14-H,Ph-H),5.72(d,1H,C17-H,J＝16Hz),5.42(d,1H,C17-H,J＝16Hz),5.28(s,2H,C5-H),4.69(s,2H,丙氨酸-H),3.64-3.90(m,4H,NCH₂P),2.07-2.24(m,2H,C18-H),1.33(d,3H,丙氨酸-H,J＝8Hz),0.91(t,3H,C19-H,J＝8Hz)；MS-ESI m/z:934.1[M+Na]⁺,證實(shí)為化合物In。

實(shí)施例15：目標(biāo)化合物Io的合成

與實(shí)施例1同，僅以亞磷酸二苯酯代替亞磷酸二甲酯，異亮氨酸代替甘氨酸。反應(yīng)所得產(chǎn)物檢測(cè)數(shù)據(jù)如下：產(chǎn)率：63％；熔點(diǎn):283-286℃；¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ:8.40(s,1H,C7-H),8.22(m,2H,C9-H,C12-H),7.75(t,1H,C10-H,J＝4Hz),7.64(t,1H,C11-H，J＝4Hz),6.72-7.24(m,21H,C14-H,Ph-H),5.72(d,1H,C17-H,J＝16Hz),5.42(d,1H,C17-H,J＝16Hz),5.28(s,2H,C5-H),4.71(s,1H,異亮氨酸-H),3.64-3.90(m,7H,NCH₂P,異亮氨酸-H),2.07-2.24(m,2H,C18-H),1.02-1.34(m,6H,異亮氨酸-H),0.91(t,3H,C19-H,J＝8Hz)；MS-ESI m/z:954.4[M+H]⁺,證實(shí)為化合物Io。

實(shí)施例16：目標(biāo)化合物Ip的合成

與實(shí)施例1同，僅以亞磷酸二苯酯代替亞磷酸二甲酯，苯丙氨酸代替甘氨酸。反應(yīng)所得產(chǎn)物檢測(cè)數(shù)據(jù)如下：產(chǎn)率：57％；熔點(diǎn):287-289℃；¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ:8.40(s,1H,C7-H),8.22(m,2H,C9-H,C12-H),7.75(t,1H,C10-H,J＝4Hz),7.64(t,1H,C11-H，J＝4Hz),6.71-7.24(m,26H,C14-H,Ph-H),5.71(d,1H,C17-H,J＝16Hz),5.42(d,1H,C17-H,J＝16Hz),5.28(s,2H,C5-H),4.71-4.74(m,1H,苯丙氨酸-H),3.77-3.99(m,6H,NCH₂P,苯丙氨酸-H),2.07-2.24(m,2H,C18-H),0.84(t,3H,C19-H,J＝8Hz)；MS-ESI m/z:988.1[M+H]⁺,證實(shí)為化合物Ip。

實(shí)施例17

化合物Ia-Ip的抗腫瘤活性的實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果

本發(fā)明的藥理實(shí)驗(yàn)采用磺酰羅丹明B(Sulforhodamine B，SRB)比色法。腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)選用10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640或DMEM培養(yǎng)基，將腫瘤細(xì)胞接種于96孔板，每個(gè)孔培養(yǎng)3-5×10³個(gè)細(xì)胞，加入不同濃度的待測(cè)試目標(biāo)化合物溶液。培養(yǎng)72小時(shí)后，每孔加入預(yù)冷的三氯乙酸溶液(50％，w/v)固定細(xì)胞，冰箱中固定30分鐘。待96孔板室溫下晾干后，每孔加入0.04％(w/v)的SRB染液(1％的乙酸配制，購(gòu)自Sigma Chemical公司)，染色30min后倒掉染液，用乙酸沖洗4次，去除未結(jié)合的染料，室溫晾干。用100μL非緩沖Tris-base堿液溶解與細(xì)胞蛋白結(jié)合的染料，水平搖床上振蕩20min，采用ELx800吸收光酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-TeK公司生產(chǎn)，操作軟件Gen5)測(cè)定515nm處光吸收值。所有試驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行組或重復(fù)3次?；衔颕a-Ip的細(xì)胞毒活性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1化合物Ia-IIIi的細(xì)胞毒活性試驗(yàn)結(jié)果：IC₅₀(μM)

注：⑴篩選方法：磺酰羅丹明B比色法；⑵作用時(shí)間：72小時(shí)；(3)化合物編號(hào)Ia-Ip分別為前述實(shí)施例1至實(shí)施例16所得產(chǎn)物。

對(duì)六種腫瘤細(xì)胞體外細(xì)胞毒活性測(cè)試結(jié)果顯示，本發(fā)明所合成的化合物均表現(xiàn)出良好的毒殺人肝癌細(xì)胞(Hep3B)、人肺腺癌細(xì)胞(A549)、人乳腺癌細(xì)胞株(MDA-MB-231和MCF-7)、人口腔表皮樣癌細(xì)胞(KB)和人口腔表皮樣癌細(xì)胞耐藥株(KBvin)腫瘤細(xì)胞的活性，幾乎所有的化合物表現(xiàn)出高于喜樹(shù)堿臨床藥物伊立替康(CPT-11)的體外細(xì)胞毒活性，而在Hep3B和MCF-7細(xì)胞中所有化合物均表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性。

實(shí)施例18

化合物Ig殺傷細(xì)胞機(jī)制研究的實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果

本發(fā)明選取化合物Ig作為代表化合物，研究化合物Ia-IIIi殺傷腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制和分子機(jī)理。首先分別在白光和DAPI染色后用顯微鏡觀察細(xì)胞表型，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期并用western blot方法檢測(cè)周期相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，最后檢測(cè)拓?fù)洚悩?gòu)酶I的活性。具體實(shí)驗(yàn)方法如下：

用四個(gè)濃度的化合物Ig(0，0.25，0.5和1μM)處理Hep3B細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞48h后，直接用倒置相差顯微鏡在白光下觀察細(xì)胞或者用DAPI染色后觀察細(xì)胞核。DAPI染色步驟為用4％的多聚甲醛室溫固定20min后，用含0.1％Triton X-100的PBS溶液室溫孵育3min，然后用DAPI染色3分鐘，再用PBS洗兩次。每組細(xì)胞均在相同曝光時(shí)間下拍照，最后用ImageJ2X對(duì)細(xì)胞核大小進(jìn)行分析。

為檢測(cè)細(xì)胞周期，將Hep3B和MCF-7細(xì)胞接種于6孔板，每孔2×105個(gè)。從第二天開(kāi)始，在不同的時(shí)間點(diǎn)加入0.5μM化合物Ig(0，12，24，36和48h)。處理48h后，倒掉培養(yǎng)基并用胰酶消化后收集細(xì)胞，然后用70％乙醇在4℃固定過(guò)夜。之后用PBS洗滌2次，加入200μL生理鹽水重懸細(xì)胞，及5μL RNA酶(Rnase，10mg/mL)和2μL碘化丙啶(PI，5mg/mL)。室溫孵育30min后，用流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司生產(chǎn))檢測(cè)熒光。最后用流式分析軟件FlowJo7.6分析細(xì)胞周期。

將Hep3B和MCF-7細(xì)胞接種于6孔板，每孔4×105個(gè)。從第二天開(kāi)始，在不同的時(shí)間點(diǎn)加入0.5μM化合物Ig或5μM化合物CPT-11(0，12和18h)。處理24h后，倒掉培養(yǎng)基并用PBS洗滌2次。然后用加樣槍完全吸凈6孔板中的液體，加入配好的細(xì)胞裂解液(按照體積比100:2:1:1的RIPA：cooktail：PMSF：磷酸化蛋白酶抑制劑)，每孔120μL，在冰上裂解20min。然后用超聲破碎儀破碎細(xì)胞后，用預(yù)冷的低溫離心機(jī)4℃、10000r/min離心5min。收集上清液體，用于western blot檢測(cè)。首先配制SDS-PAGE膠，以100V、50mA的條件電泳1.5h。然后100V、275mA轉(zhuǎn)膜1h，取出PVDF膜后用5％的脫脂牛奶在室溫?fù)u床的條件下封閉40min。將PVDF膜于4℃孵育一抗過(guò)夜，第二天用TBST在室溫?fù)u床上洗3次，每次5min。將PVDF膜放入相應(yīng)的二抗中于室溫?fù)u床上孵育1h，再次用TBST洗3次，每次5min，最后在化學(xué)發(fā)光儀中用ECL顯影成像。一抗包括cyclin A2，cylin B1，cyclin D1，cyclin E1，Bcl2，Bax和caspase-3，均以1:1000的倍數(shù)稀釋。

為檢測(cè)化合物Ig對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶I活性的影響，分別在試管水平和細(xì)胞水平進(jìn)行檢測(cè)。試管水平的檢測(cè)是將拓?fù)洚悩?gòu)酶1與vehicle、Ig(100nM和200nM)、CPT-11(100nM和200nM)在反應(yīng)緩沖液(10mM Tris-HCl,pH 7.9,1mM EDTA,150mM NaCl,0.1％BSA,0.1mM亞精胺,和5％甘油)于37℃共孵育20min，然后加入250ng DNA在37℃繼續(xù)反應(yīng)30min,。然后加入5μL的反應(yīng)終止液(0.125％溴酚藍(lán),25％蔗糖,和5％十二烷基肌氨酸鈉)終止反應(yīng)。最后將反應(yīng)液在1％的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，并用SYBRGreen染色后用凝膠成像系統(tǒng)拍照。細(xì)胞水平的檢測(cè)是先用vehicle、Ig(0.25和0.5μM)或CPT-11(5μM)處理MCF7細(xì)胞6h，根據(jù)TopoGEN操作手冊(cè)提取細(xì)胞核蛋白。稀釋不同倍數(shù)(1、3/4/、2/3或1/2)后，用與試管水平檢測(cè)拓?fù)洚悩?gòu)酶1相同的方法檢測(cè)拓?fù)洚悩?gòu)酶1活性。

機(jī)制研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2，圖3和圖4：

圖2為化合物Ig處理Hep3B和MCF7細(xì)胞后的細(xì)胞表型。分別用不同濃度化合物Ig(0、0.25、0.5和1.0μM)處理Hep3B和MCF7細(xì)胞，48h后用倒置相差顯微鏡在白光下觀察細(xì)胞(A)；然后用DAPI染色，在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核，并用imageJ2X軟件統(tǒng)計(jì)分析細(xì)胞核大小(B)。

圖3為化合物Ig使Hep3B和MCF7細(xì)胞周期阻滯在S/G2期并產(chǎn)生凋亡測(cè)試結(jié)果示意圖。用0.5μM化合物Ig處理Hep3B和MCF7不同時(shí)間后(0、12、24、36和48h)，用PI染色，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期(A)；用0.5μM化合物Ig或5μM CPT-11處理Hep3B和MCF7不同時(shí)間后(0、6、12和24h)，用western blot檢測(cè)周期和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)(B)。

圖4為化合物Ig和CPT-11可在試管和細(xì)胞內(nèi)抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶I的活性測(cè)試結(jié)果示意圖。將vehicle、化合物Ig(100和200μM)或CPT-11(100和200μM)與拓?fù)洚悩?gòu)酶I孵育20min后，檢測(cè)拓?fù)洚悩?gòu)酶I活性(A)；用vehicle、化合物Ig(0.25和0.5μM)或CPT-11(5μM)處理MCF7細(xì)胞6h后，收集核蛋白，然后稀釋不同倍數(shù)(1、3/4/、2/3或1/2)檢測(cè)拓?fù)洚悩?gòu)酶活性(B)。R＝Relaxed，S＝Supercoiled。

處理48h后，隨著化合物Ig濃度增加，Hep3B和MCF-7細(xì)胞明顯逐漸減少，培養(yǎng)基中漂浮的死細(xì)胞增多(Hep3B細(xì)胞更加明顯)且可見(jiàn)凋亡小體等凋亡現(xiàn)象。而用DAPI染色后，細(xì)胞核隨著化合物Ig處理濃度增加而增大，在MCF-7中用1μM化合物Ig處理48h后細(xì)胞核大小約增加兩倍，暗示細(xì)胞周期可能阻滯在S期或G2/M期。流式檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步表明，對(duì)照組細(xì)胞周期主要集中在G1期，用化合物Ig處理12-24h后細(xì)胞G1期減少而S期增多，36-48h后S期減少而G2/M期顯著上升。說(shuō)明化合物Ig確實(shí)可以使細(xì)胞周期阻滯在S/G2/M期。western blot結(jié)果與流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果一致，即在Hep3B和MCF-7細(xì)胞中隨著處理時(shí)間的增加，在S/G2/M期高表達(dá)的cyclinA2和cyclinB1蛋白表達(dá)逐漸提高，而在G1期高表達(dá)的cyclinD1和cyclinE1蛋白表達(dá)逐漸降低。另外，凋亡蛋白caspase-3和Bax隨著處理時(shí)間的增加而表達(dá)升高，抗凋亡蛋白Bcl2隨處理時(shí)間的增加而表達(dá)下降，證明化合物Ig的確誘導(dǎo)Hep3B和MCF-7產(chǎn)生了凋亡。在試管水平上檢測(cè)拓?fù)洚悩?gòu)酶1活性實(shí)驗(yàn)表明，化合物Ig具有與CPT-11接近的拓?fù)洚悩?gòu)酶1活性抑制能力，并且隨著化合物處理濃度的升高，對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶1活性的抑制作用更加顯著。在細(xì)胞水平上的拓?fù)洚悩?gòu)酶1活性檢測(cè)結(jié)果顯示，用0.5μM化合物Ig處理過(guò)的MCF-7細(xì)胞中提取的拓?fù)洚悩?gòu)酶1在稀釋至3/4后即失去解螺旋能力，而用5μM化合物CPT-11處理過(guò)的MCF-7細(xì)胞中提取的拓?fù)洚悩?gòu)酶1在稀釋至3/4后還有很強(qiáng)的解螺旋能力。說(shuō)明化合物Ig在試管水平具有與CPT-11接近的拓?fù)洚悩?gòu)酶1抑制活性，而在細(xì)胞水平化合物Ig抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶1活性的能力比CPT-11更強(qiáng)。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明以化合物Ig為代表的化合物Ia-Ip能夠通過(guò)抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶1的活性，發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期在S/G2/M期以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。

實(shí)施例19

化合物Ig在裸鼠乳腺癌移植瘤模型中抗腫瘤作用研究的實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果

本發(fā)明選取化合物Ig作為代表化合物，研究化合物Ia-Ip在裸鼠移植瘤模型中抑制乳腺癌腫瘤生長(zhǎng)的能力。研究方法是選取45只六周齡(約20g)雌性Balb/c裸鼠，在腋下方皮下注射2×10⁶個(gè)MCF-7細(xì)胞。當(dāng)腫瘤長(zhǎng)至約100mm³時(shí)，尾靜脈注射溶劑對(duì)照(含5％DMSO和5％氫化蓖麻油的生理鹽水)、化合物Ig或CPT-11(2mg/kg)，隔天注射一次，共注射7次，并且每隔3天測(cè)量體重和腫瘤大小，結(jié)果如圖4所示，以2×10⁶個(gè)MCF7注射到裸鼠皮下，等腫瘤長(zhǎng)至約100mm³的時(shí)候開(kāi)始尾靜脈注射化合物Ig或CPT-11(2mg/kg)，隔天注射一次，共注射7次，并每隔3天測(cè)量體重(A)和腫瘤大小(B)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5。

由圖5可以看出，裸鼠移植瘤模型中，化合物Ig可以有效抑制MCF7形成的腫瘤生長(zhǎng)。與溶劑對(duì)照組相比，化合物Ig和CPT-11處理的小鼠體重明顯較低。在25天內(nèi)，溶劑對(duì)照組小鼠腫瘤體積急劇上升，而用化合物Ig和CPT-11處理小鼠的腫瘤體積增長(zhǎng)顯著減緩。說(shuō)明化合物Ig與CPT-11同樣具有抑制MCF-7細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)的能力。該實(shí)驗(yàn)表明以化合物Ig為代表的化合物Ia-Ip在裸鼠乳腺癌移植瘤模型中能夠起到抗腫瘤的作用。

實(shí)施例20

化合物Ig在小鼠原位癌模型中抑制肝癌形成能力研究的實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果

本發(fā)明選取化合物Ig作為代表化合物，研究化合物Ia-Ip在小鼠原位癌模型中抑制肝癌形成和發(fā)展的能力。為建立原位肝癌模型，參照文獻(xiàn)方法將pT3/EF1α-Akt、pT-Caggs-Nrasv12和pCMV-SB三個(gè)質(zhì)粒同時(shí)通過(guò)高壓尾靜脈注射到FVB/N小鼠體內(nèi)，八周后可形成原位肝細(xì)胞肝癌。八周后，以同齡正常FVB/N作為對(duì)照組尾靜脈注射溶劑對(duì)照(含5％DMSO和5％氫化蓖麻油的生理鹽水)，原位肝癌模型組注射溶劑對(duì)照或化合物Ig(10mg/kg)，隔天注射，持續(xù)2周，期間每3天稱體重。兩周后，處死小鼠并解剖，觀察是否有肝癌形成，然后測(cè)量肝臟大小并稱重，用4％的多聚甲醛固定肝臟后做免疫組化和免疫熒光檢測(cè)。免疫組化和免疫熒光的陽(yáng)性率使用 Plus軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。免疫組化的實(shí)驗(yàn)步驟如下：肝臟固定過(guò)夜后先脫水，然后用二甲苯透明并浸蠟，進(jìn)行石蠟包埋。將包埋的蠟塊進(jìn)行切片、烤片、脫蠟、水化后，將切片置于檸檬酸鹽緩沖液中微波修復(fù)。冷卻到室溫后用PBS清洗3次，將切片放入3％的H2O2溶液中室溫孵育25min以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。PBS清洗后加破膜液室溫孵育10min，用1:200的山羊血清封閉，室溫放置30min。將封閉好的切片每張加入100μL稀釋后的一抗，覆蓋組織，4℃過(guò)夜。PBS清洗后每張切片加入100μL二抗稀釋液室溫孵育45min。PBS清洗后每張切片加入50μL新鮮配置的DAB工作液，顯微鏡下控制顯色。顯色完全后，ddH₂O沖洗。最后蘇木素淡染，脫水、透明，中性樹(shù)脂封片。而TUNEL免疫熒光染色是在切片與不含DNA酶的蛋白酶K在室溫下反應(yīng)30min后，用PBS洗3次，然后加入Tdt酶、熒光標(biāo)記液和TUNEL配成的檢測(cè)液于37℃避光孵育60min，再用PBS洗3次，最后封片并用熒光顯微鏡拍照，結(jié)果如圖6和圖7。

圖6中將Akt/Ras/SB質(zhì)粒高壓尾靜脈注射到FVB/N小鼠體內(nèi)形成原位肝癌模型，用生理鹽水高壓尾靜脈注射到FVB/N小鼠體內(nèi)作為正常對(duì)照。八周后，正常對(duì)照組尾靜脈注射溶劑對(duì)照(含5％DMSO和5％氫化蓖麻油的生理鹽水)，原位肝癌模型組注射溶劑對(duì)照或化合物Ig(10mg/kg)，隔天注射，持續(xù)2周，期間稱體重(C)。兩周后，處死小鼠并解剖，觀察是否有肝癌形成，然后測(cè)量肝臟大小并稱重(A和B)。由圖5可以看出，原位肝癌中，化合物Ig可以有效抑制肝癌形成。

圖7中，將Akt/Ras/SB質(zhì)粒高壓尾靜脈注射到FVB/N小鼠體內(nèi)形成原位肝癌模型，用生理鹽水高壓尾靜脈注射到FVB/N小鼠體內(nèi)作為正常對(duì)照。八周后，正常對(duì)照組尾靜脈注射溶劑對(duì)照(含5％DMSO和5％氫化蓖麻油的生理鹽水)，原位肝癌模型組注射溶劑對(duì)照或化合物Ig(10mg/kg)，隔天注射，持續(xù)2周。兩周后，處死小鼠，取肝臟用4％多聚甲醛固定，然后做免疫組化(A)和免疫熒光(B)。由圖6可以看出，原位肝癌中，化合物Ig可以抑制細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期和促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

通過(guò)檢測(cè)體重，發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照小鼠體重在15天內(nèi)有輕微上升，原位肝癌模型組小鼠體重在11天后有明顯上升，而用化合物Ig處理組小鼠體重基本維持穩(wěn)定并且在第15天的體重與模型組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。15天后，解剖小鼠，模型組小鼠肝臟與正常小鼠肝臟相比明顯增大，并且表面變得凹凸不平，布滿腫瘤結(jié)節(jié)。而用化合物Ig處理的小鼠肝臟恢復(fù)正常大小，并且表面光滑色澤鮮亮，僅有數(shù)個(gè)腫瘤結(jié)節(jié)散布(箭頭所示)。肝重比結(jié)果也表明模型組肝重比增大而化合物Ig處理的小鼠肝重比恢復(fù)到正常對(duì)照組水平。H&E染色顯示，正常小鼠肝臟組織質(zhì)地均一、細(xì)胞排列有序、肝索明顯，而模型組小鼠肝臟出現(xiàn)大量脂肪空泡并且組織出現(xiàn)不規(guī)則病變，用化合物Ig處理后小鼠的肝臟脂肪空泡明顯減少并組織恢復(fù)規(guī)則。正常對(duì)照組小鼠肝臟低表達(dá)Akt，而在模型組和化合物Ig處理小鼠的肝臟中均高表達(dá)Akt，說(shuō)明Akt質(zhì)粒(間接也能反映Ras和SB質(zhì)粒)已進(jìn)入模型組和化合物Ig組小鼠肝臟并成功表達(dá)。模型組中Ki67的表達(dá)量遠(yuǎn)高于對(duì)照組說(shuō)明模型組出現(xiàn)惡性增殖即確實(shí)已產(chǎn)生腫瘤，但用化合物Ig處理后Ki67的表達(dá)明顯下降，表示化合物Ig能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞的惡性增殖。正常對(duì)照組中基本不表達(dá)cyclinB1是因?yàn)檎８闻K細(xì)胞不增殖，周期處于靜止?fàn)顟B(tài)，所以周期蛋白基本不表達(dá)(包括cyclinB1)。而在模型組小鼠肝臟中cyclinB1的表達(dá)有輕微上升，是因?yàn)楦闻K細(xì)胞出現(xiàn)惡性增殖、推動(dòng)細(xì)胞周期，從而使周期蛋白表達(dá)上調(diào)。在化合物Ig處理的小鼠肝臟中cyclinB1的陽(yáng)性率接近100％，該結(jié)果與化合物Ig處理腫瘤細(xì)胞的western blot結(jié)果一致，是因?yàn)榛衔颕g使細(xì)胞周期大量阻滯在S/G2/M期。TUNEL免疫熒光染色顯示模型組小鼠肝臟的凋亡率明顯低于正常對(duì)照組小鼠，說(shuō)明肝臟細(xì)胞發(fā)生腫瘤惡變后使細(xì)胞能夠逃逸凋亡。而用化合物Ig處理的小鼠肝臟中凋亡率顯著增加，可得到與細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)一樣的結(jié)論，即化合物Ig可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明利用Akt/Ras/SB三質(zhì)粒高壓注射可成功建立原位肝癌模型，而化合物Ig可以通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、阻滯周期S/G2/M期及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡成功抑制該模型產(chǎn)生腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

實(shí)施例21

化合物Ig在體內(nèi)急性毒性研究的實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果

為評(píng)價(jià)化合物Ig在小鼠體內(nèi)的毒副作用，我們進(jìn)行了急性毒理實(shí)驗(yàn)。選取8～10周齡的FVB/N小鼠雌性20只和雄性25只，根據(jù)體重平均分成5組，分別腹腔注射溶劑對(duì)照(含5％DMSO和5％氫化蓖麻油的生理鹽水)、化合物Ig(10、50和100mg/kg)和CPT-11(100mg/kg)。此后15天內(nèi)，觀察老鼠死亡情況并每隔3天記錄小鼠體重。15天后，眼眶取血并用抗凝管收集，然后解剖收集肝臟和腎臟并用4％的多聚甲醛固定。收集的血液一部分直接用于檢測(cè)血常規(guī)，另一部分離心后收集上清，用來(lái)檢測(cè)血液生化指標(biāo)(肝功能指標(biāo)：ALT和AST，腎功能指標(biāo)：BUN和Cr)。肝臟和腎臟固定后用來(lái)做H&E染色，在顯微鏡下觀察是否有炎性浸潤(rùn)等組織病變。

急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2、表3和圖8。

表2化合物Ig在雄性FVB/N小鼠急性毒性試驗(yàn)的血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果

表3化合物Ig在雌性FVB/N小鼠急性毒性試驗(yàn)的血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果

圖8中將vehicle(含5％DMSO和5％氫化蓖麻油的生理鹽水)、化合物Ig(10、50或100mg/kg)或CPT-11(100mg/kg)通過(guò)腹腔注射到FVB/N小鼠(雌性＝4，雄性＝5)體內(nèi)，每3天稱體重(A和C)。注射15天后，收集血液并處死小鼠，然后收集肝臟和腎臟后用4％多聚甲醛固定。血液用來(lái)檢測(cè)血常規(guī)和血生化指標(biāo)(B、D、E和F)，肝臟和腎臟固定后用來(lái)做H&E染色(G)。由圖7可以看出化合物Ig具有較低肝腎毒性。

五組小鼠在腹腔注射15天內(nèi)，體重均維持在相對(duì)恒定的水平。注射15天后，血常規(guī)結(jié)果顯示各組間的白細(xì)胞等與炎癥相關(guān)的指標(biāo)均在正常范圍，其他血常規(guī)指標(biāo)也未有顯著異常。肝功能指標(biāo)ALT和AST，及腎功能指標(biāo)BUN和Cr在處理組和對(duì)照組之間也無(wú)顯著差異。觀察組織病理切片，肝臟和腎臟均未出現(xiàn)明顯的炎性浸潤(rùn)、組織壞死及其他病變。以上結(jié)果表明，化合物Ig和CPT-11在同等高劑量下均對(duì)小鼠無(wú)明顯的急性毒性。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。