背景技術(shù)：
中東呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒(Middle East Respiratory Syndrome Coranavirus，MERS-CoV)是一種新型冠狀病毒，該病毒最早于2012年6月，從一名患有急性呼吸窘迫綜合征病人體內(nèi)分離獲得，隨后在約旦、卡塔爾等中東地區(qū)一直有感染病例報道。據(jù)WHO報道，截止至2016年4月14日，全球26個國家實驗室確診MERS-CoV感染者累計1714例，其中死亡618例，病死率高達36.1％。研究表明蝙蝠可能為該病毒的動物儲存宿主，而單峰駝可能為其中間宿主和重要傳染源，但其傳染途徑尚不明確，目前亦無特異性藥物對抗其感染，因此研制一種有效疫苗預(yù)防和控制MERS-CoV感染迫在眉睫。

MERS-CoV與其他冠狀病毒相似，是一種有包膜的單股正鏈RNA病毒。病毒表面的棘突蛋白(Spike，S)是病毒包膜上特異性的組織結(jié)構(gòu)，在病毒入侵靶細胞以及病毒與細胞發(fā)生交互作用時發(fā)揮著重要的作用，因此S抗原成為MERS-CoV疫苗研究的靶抗原。

病毒樣顆粒(Virus-like Particles，VLPs)是由一種或幾種病毒結(jié)構(gòu)蛋白自我組裝的、不含病毒核酸的、不可復(fù)制增殖的空心顆粒。其結(jié)構(gòu)和真病毒十分相似，且可重復(fù)高密度的展示外源抗原表位，因此可以誘導(dǎo)強大的細胞免疫和高效價的中和抗體反應(yīng)。因其不含病毒基因組，不可在體內(nèi)外復(fù)制和增殖，因此不會造成機體感染。這些特點使得VLPs作為一種安全、有效的疫苗，越來越受到人們的重視。到目前為止，多種病毒如HBV、HPV、HEV以及流感病毒的VLPs疫苗已用于臨床。除此之外，RSV、EV71、HIV及諾如病毒等VLPs疫苗已進入臨床實驗階段，且顯示了很好的應(yīng)用前景。最近，肆虐非洲的埃博拉病毒的VLPs疫苗亦研制成功，這些均表明了VLPs作為疫苗預(yù)防病毒性疾病的可行性。

SARS-CoV病毒樣顆粒疫苗的研究中，將分別表達S、M和E蛋白的重組桿狀病毒共感染昆蟲細胞，可在該系統(tǒng)里成功包裝出SARS-CoV的VLPs。除此之外，在該桿狀病毒表達系統(tǒng)(Baculovirus expression vector system，BEVS)內(nèi)共表達SARS-CoV的S蛋白和流感病毒基質(zhì)蛋白M1，可成功獲得SARS-CoV的嵌合型VLPs，并且這種VLPs產(chǎn)量很高，免疫含0.8μgS蛋白的VLPs即可保護小鼠免受致死量SARS-CoV的攻擊。另有研究，將呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)的F或G蛋白與流感病毒M1蛋白嵌合，同樣獲得了RSV的嵌合型VLPs，該VLPs在小鼠體內(nèi)亦獲得較好的免疫保護效果。

故本專利將流感病毒M1基因以及MERS-CoV的S基因分別插入到pFastBacDual載體中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pFastBacDual-M1-S，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac，在其體內(nèi)獲得了重組桿粒Bacmis-M1-S。將該桿粒轉(zhuǎn)染昆蟲細胞Sf-9后獲得了重組桿狀病毒M1-S。將該病毒感染昆蟲細胞后，在其體內(nèi)包裝了MERS-CoV嵌合型VLPs。電鏡下該VLPs與天然MERS-CoV形態(tài)相似。將該嵌合型VLPs免疫小鼠后，小鼠血清檢測到高水平S蛋白特異性IgG抗體以及中和抗體，表明該嵌合型VLPs具有良好的免疫原性。該研究為進一步開發(fā)有效的疫苗預(yù)防和治療MERS-CoV感染提供重要依據(jù)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
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應(yīng)用桿狀病毒昆蟲細胞表達系統(tǒng)包裝了MERS-CoV嵌合型VLPs，純化后在小鼠體內(nèi)證實該嵌合型VLPs具有良好的免疫原性，具有進一步開發(fā)為有效的疫苗預(yù)防和治療MERS-CoV感染的前景。

附圖說明

圖1：質(zhì)粒pFastBacDual-M1-S酶切鑒定結(jié)果。1道為質(zhì)粒經(jīng)NheI和KpnI雙酶切鑒定目的片段M1，2道為質(zhì)粒對照，3道為質(zhì)粒經(jīng)BamHI和XbaI雙酶切鑒定目的片段S，M代表Marker。

圖2：質(zhì)粒pFastBacDual-M1-S轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細胞后的結(jié)果。藍色標(biāo)記為可疑重組質(zhì)粒。

圖3：重組桿粒Bacmis-M1-S經(jīng)PCR擴增鑒定結(jié)果。1道用M13通用引物和M1特異性引物組合鑒定M1基因的正確重組，2道用M13通用引物和S特異性引物組合鑒定S基因的正確重組，M代表Marker。

圖4：光鏡下觀察不同處理組Sf細胞結(jié)果。左側(cè)為轉(zhuǎn)染Bacmis-M1-S桿粒5d后的Sf9細胞，右側(cè)為對照培養(yǎng)5d的Sf9細胞。

圖5：轉(zhuǎn)染桿粒Bacmis-M1-S后的Sf9細胞經(jīng)PCR擴增結(jié)果。1道鑒定S基因重組成功，2-3道為陰性對照，4道鑒定M1基因重組成功，2-3道為陰性對照。

圖6：Western-blot鑒定外源蛋白的表達。A圖用抗MERS-CoV S的單克隆抗體做一抗的結(jié)果，B圖為用抗流感病毒M1的抗體做一抗的結(jié)果。黑色箭頭指向目的蛋白。

圖7：IFA鑒定外源蛋白的表達。左上為正常Sf9細胞光鏡下的觀察結(jié)果，左下為同視野的細胞熒光顯微鏡下的觀察結(jié)果。右上為感染重組桿狀病毒M1-S后的Sf9細胞光鏡下的觀察結(jié)果，右下為同視野的細胞熒光顯微鏡下的觀察結(jié)果。

圖8：Western-blot鑒定目的蛋白表達情況。A圖鑒定S表達，1-3道為目的蛋白，M代表蛋白marker；B圖鑒定M1表達，1-3道為目的蛋白，M代表蛋白marker。

圖9：電鏡負染及金標(biāo)免疫電鏡下觀察的病毒樣顆粒。上面一行顯示負染結(jié)果，下面一行顯示免疫電鏡觀察結(jié)果。

圖10：VLPs疫苗免疫小鼠血清S蛋白特異性IgG抗體ELISA檢測結(jié)果。第二次免疫后2w(A圖)以及第三次免疫后2w(B圖)小鼠血清S蛋白特異性IgG抗體滴度。

圖11：假病毒檢測末次免疫后2w小鼠血清中和抗體結(jié)果。P150代表假病毒抑制率為50％時抗體的滴度。

具體實施方式：

下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。以下實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如《分子克隆實驗指南》(第三版，科學(xué)出版社，2005)等本領(lǐng)域常用工具書中所述的條件，或按試劑生產(chǎn)廠家所建議的條件進行。

實施例1：構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pFastBacDual-M1-S

載體pFastBacDual含有p10和pH兩個啟動子，可以同時表達兩種外源的目的蛋白。先將流感病毒M1基因從攜帶該基因的重組質(zhì)粒上擴增后，插入到p10啟動子下方構(gòu)建了重組質(zhì)粒pFastBacDual-M1。將攜帶MERS-CoV的S基因擴增后，插入到重組質(zhì)粒pFastBacDual-M1的pH啟動子下方，構(gòu)建重組質(zhì)粒pFastBacDual-M1-S。如圖1所示，構(gòu)建后的質(zhì)粒經(jīng)NheI和KpnI雙酶切后，可獲得大小約為750bp(M1)目的條帶、用BamHI和XbaI雙酶切該質(zhì)粒，獲得了約4000bp(S)的目的條帶。將酶切鑒定正確的質(zhì)粒送上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司測序，發(fā)現(xiàn)插入的片段和目的序列完全一致，證明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pFastBacDual-M1-S。

實施例2：獲得重組桿粒Bacmid-M1-S

將使用質(zhì)粒大提試劑盒獲取的重組質(zhì)粒pFastBacDual-M1-S，在大腸桿菌DH10Bac^TM感受態(tài)細胞中進行重組，重組后mini-Tn7從供體質(zhì)粒pFastBacDual-M1-S插入到DH10Bac感受態(tài)細胞中的母體質(zhì)粒中，干擾LacZa的表達，使得重組質(zhì)粒表現(xiàn)為藍色背景下的白色菌落。如圖2所示，含有三種抗生素的平板上出現(xiàn)白色的菌落，挑取獨立的、個體較大的可疑重組菌落進行下一步鑒定。

可疑重組菌落經(jīng)過震蕩培養(yǎng)后，取菌液做模板，應(yīng)用目的片段特異性引物和重組骨架上的M13特異性引物進行PCR鑒定，結(jié)果如圖3。使用M1F和M13F配對引物進行擴增獲得如下2550bp左右目的條帶，證明外源基因M1重組成功。使用S2600F和M13R配對引物進行擴增獲得如下4600bp左右目的條帶，證明外源基因S重組成功。綜上，質(zhì)粒pFastBacDual-M1-S在大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細胞中重組成功，獲得了重組桿粒Bacmis-M1-S。

實施例3：獲得重組桿狀病毒M1-S

3.1光鏡觀察：將重組后的桿粒Bacmis-M1-S在6孔板中轉(zhuǎn)染昆蟲細胞Sf9，逐日觀察細胞變化。轉(zhuǎn)染3d后可見細胞停止生長，細胞體積變大；病變逐漸發(fā)展，至轉(zhuǎn)染后5d對照組細胞生長均勻且致密，而轉(zhuǎn)染后的細胞有部分脫落，懸浮于培養(yǎng)液中，貼壁生長細胞較疏松、個體較大、形態(tài)不一、部分出現(xiàn)細胞空泡，甚至多個細胞融合形成巨細胞，如圖4黑色箭頭所示。

3.2PCR擴增鑒定：提取病變后Sf9細胞的DNA，用其做模板，進行PCR擴增，結(jié)果見圖5。使用使用M1F和M13F配對引物進行擴增獲得如下2550bp左右目的條帶，證明外源基因M1轉(zhuǎn)染至Sf9細胞中。使用S2600F和M13R配對引物進行擴增獲得如下4600bp左右目的條帶，外源基因S轉(zhuǎn)染至Sf9細胞中。綜上，重組桿粒Bacmis-M1-S轉(zhuǎn)染Sf9細胞成功。

3.3Western-blot鑒定：轉(zhuǎn)染桿粒Bacmis-M1-S后的Sf9細胞經(jīng)PCR擴增證實含有外源基因M1和S后，經(jīng)Western-blot外源蛋白M1和S的表達，結(jié)果如圖6所示。應(yīng)用抗MERS-CoVS的單克隆抗體做一抗，可見左圖外源蛋白S在P1、P2和P3代重組病毒中均可表達(圖6A)。應(yīng)用抗流感病毒M1的抗體做一抗，可見右圖外源蛋白M1在P1、P2和P3代重組病毒中亦可表達(圖6B)。

3.4IFA鑒定：12孔板內(nèi)用重組桿狀病毒M1-S感染后的Sf-9細胞用IFA鑒定外源蛋白S的表達，同時用不感染病毒的Sf細胞做陰性對照，結(jié)果見圖7。左上和左下為不感染病毒的Sf細胞鑒定結(jié)果，可見細胞無熒光閃現(xiàn)。圖右上和右下為感染病毒M1-S的結(jié)果，可見絕大多數(shù)細胞發(fā)出綠色熒光，且細胞膜熒光較深。即外源蛋白S在昆蟲細胞Sf9中表達。

實施例4：獲得嵌合型MERS-CoV VLPs

接種重組桿狀病毒M1-S至懸浮培養(yǎng)的High Five細胞，進行擴大培養(yǎng)。72h后收集培養(yǎng)的病毒液，經(jīng)20％蔗糖墊層超速離心后，Western-blot鑒定目的蛋白S和M1的表達，結(jié)果如圖8所示，即170KDa左右有目的蛋白S的表達(圖8A)，同時25KDa處有目的蛋白M1的表達(圖8B)。

將20％蔗糖墊層獲得的重組蛋白，經(jīng)過蔗糖梯度離心。在40％以及60％蔗糖層均可見一層白色蛋白沉積帶，吸取白色蛋白沉積帶再次經(jīng)20％蔗糖墊層離心以去除蔗糖。將蔗糖梯度離心獲得的蛋白樣品，送電子顯微鏡下負染觀察。結(jié)果如圖9所示，可見鏡下多個圓形、直徑約80-100左右、有包膜、包膜上帶棘突的病毒樣顆粒。使用抗MERS-CoV S蛋白的單克隆抗體做一抗，經(jīng)金標(biāo)免疫電鏡檢測，可在鏡下看到病毒樣顆粒棘圖蛋白表面有黑色金顆粒附著。

實施例5：VLPs疫苗在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)有效體液免疫應(yīng)答

將大量制備并純化后的VLPs疫苗免疫小鼠，每次免疫后2w，分離小鼠血清，ELISA檢測小鼠血清S蛋白特異性IgG抗體。結(jié)果表明，初次免疫后2w部分VLPs疫苗免疫小鼠血清抗體陽轉(zhuǎn)。而Al(OH)₃和CpG佐劑對照組小鼠血清均未出現(xiàn)陽轉(zhuǎn)。第二次免疫后2w，各組小鼠血清IgG抗體滴度如圖10A所示。由圖可見，VLPs疫苗在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)了有效的S蛋白特異性IgG抗體，抗體滴度達1∶80,000。同時佐劑對照組僅有低水平的抗體背景值。第三次免疫后2w，各組小鼠血清IgG抗體滴度如圖10B所示。由圖可見，VLPs疫苗在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的S蛋白特異性IgG抗體滴度較第二次免疫后有所升高，同樣佐劑對照組僅有低水平的抗體背景值。

末次免疫后2w，處死小鼠，分離血清，滅活后用假病毒中和實驗檢測免疫小鼠血清中和抗體滴度，結(jié)果見圖11。由圖可見，VLPs疫苗在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)了MERS-CoV中和抗體，而佐劑對照組僅有低水平的抗體背景值。即該嵌合型VLPs疫苗在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)了S蛋白特異性IgG抗體和中和抗體，顯示了良好的免疫原性，可進一步開發(fā)為疫苗預(yù)防和治療MERS-CoV引起的感染。