本發(fā)明屬生物藥物領域，涉及續(xù)隨子二萜烷型化合物的轉(zhuǎn)化方法，具體涉及利用已知微生物對續(xù)隨子二萜醇及其衍生物進行微生物轉(zhuǎn)化，制備具有抗癌活性的續(xù)隨子二萜烷型衍生物。
背景技術：
現(xiàn)有技術公開了續(xù)隨子二萜烷型化合物屬于二萜骨架的天然產(chǎn)物，具有較明顯的抗腫瘤活性與抗腫瘤多藥耐藥性（mdr）。構(gòu)效關系研究表明，其母核上取代基的差異能明顯改變該類化合物的抗腫瘤活性和mdr活性。
有研究公開了續(xù)隨子二萜烷型化合物是從大戟科植物續(xù)隨子euphorbialathyrisl.中首次分離得到（tetrahedronletters,1971,18:1325-1328）。隨后從其他植物中也陸續(xù)分離得到多種續(xù)隨子二萜烷型衍生物，如從大戟科植物euphorbialagascae中分離得到5個具有誘導腫瘤細胞凋亡和抗腫瘤多藥耐藥性的續(xù)隨子二萜醇酯衍生物（plantamedica,2005,72:162-168）?，F(xiàn)階段研究表明，續(xù)隨子烷型二萜除了具有細胞毒活性、抗腫瘤多藥耐藥性外，還具有一定的抗艾滋病毒活性（journalofnaturalproducts,2011,74:1221-1229）。目前，對續(xù)隨子二萜烷型化合物的結(jié)構(gòu)修飾主要停留在對其側(cè)鏈酯鍵的水解和側(cè)鏈羥基的?；确矫?，其中也得到了一些活性更好的抗腫瘤多藥耐藥性衍生物（bioorganic&medicinalchemistry,2014,22:6392-6400）。為了發(fā)現(xiàn)活性更強的續(xù)隨子二萜烷型先導化合物，有必要探索其他方法對該類化合物進行結(jié)構(gòu)修飾，以進一步探索和發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)與活性之間的關系。
微生物轉(zhuǎn)化是利用微生物生長過程中合成的特異酶完成特定生化反應。據(jù)報道，微生物在生長過程中可以合成多種酶，催化不同反應，例如氧化反應、還原反應、水解反應、脫氫反應、縮合反應和開環(huán)反應等，這類酶催化反應具有特異性和專屬性，相對于化學反應，在底物的非活性碳原子上進行反應更高效環(huán)保。
因此，利用微生物對續(xù)隨子二萜烷型化合物進行轉(zhuǎn)化研究，以期獲得一些難以用傳統(tǒng)化學合成制備的特異位點的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，迄今為止尚未見有關續(xù)隨子二萜類化合物的微生物轉(zhuǎn)化研究的報道。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供續(xù)隨子二萜烷型化合物結(jié)構(gòu)改造的方法，具體涉及通過微生物轉(zhuǎn)化法制備具有抗癌活性的續(xù)隨子二萜烷衍生物。
本發(fā)明使用諾卡氏菌(nocardiasp.nrrl5646)分別對續(xù)隨子二萜醇(lathyrol)和7β-羥基續(xù)隨子二萜醇（7β-hydroxylathyrol）進行了微生物轉(zhuǎn)化，獲得式（?。┙Y(jié)構(gòu)通式的續(xù)隨子烷型二萜衍生物：
（ⅰ）
經(jīng)鑒定，所獲得的續(xù)隨子烷型二萜衍生物化合物為：
化合物13-羰基續(xù)隨子二萜醇：r1==o,r2=h
化合物27β-乙酰氧基續(xù)隨子二萜醇：r1=β-oh,r2=oac。
本發(fā)明利用諾卡氏菌(nocardiasp.nrrl5646)對續(xù)隨子二萜烷類化合物進行生物轉(zhuǎn)化，制備了極性降低的續(xù)隨子二萜烷型衍生物；其中，利用該菌產(chǎn)生的選擇性氧化酶對續(xù)隨子二萜醇的c-3羥基進行選擇性氧化反應，制備得到3-羰基衍生物(1)；利用該菌產(chǎn)生的乙酰化酶對7β-羥基續(xù)隨子二萜醇進行選擇性乙?；?，制備得到7-乙酰氧基取代衍生物(2)。
更具體的，本發(fā)明提供了續(xù)隨子二萜醇衍生物的轉(zhuǎn)化方法，其包括以下步驟：
（1）生產(chǎn)菌株為諾卡氏菌(nocardiasp.nrrl5646)，該菌株在瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，將生長在瓊脂培養(yǎng)基上的諾卡氏菌劃線接種于馬鈴薯固體培養(yǎng)基上，在20-28°c的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-7天，得到試管種；
其中，所述諾卡氏菌(nocardiasp.nrrl5646)微生物還包括其功能等同的變異體和突變體；
（2）將試管種中的菌體接種到250ml的三角瓶中，每瓶含有50ml液體馬鈴薯培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為25-28°c，轉(zhuǎn)速為160-180rpm，培養(yǎng)時間為48-72小時，獲得種子液；
（3）將種子液按2%~5%體積比接入新鮮馬鈴薯培養(yǎng)基，25-28°c、160-180rpm條件下培養(yǎng)24-72小時后，加入轉(zhuǎn)化底物續(xù)隨子二萜醇或7β-羥基續(xù)隨子二萜醇,在25-28°c、160-180rpm的條件下轉(zhuǎn)化培養(yǎng)72小時。本發(fā)明的一個實施例中，優(yōu)選將諾卡氏菌(nocardiasp.nrrl5646)種子液按3%體積比接入馬鈴薯培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)72小時，再加入4mg/ml續(xù)隨子二萜醇或7β-羥基續(xù)隨子二萜醇的乙醇溶液；
（4）將含有菌體的發(fā)酵液按照1:1.5體積比用乙酸乙酯萃取3次，合并有機層。殘有菌體的乙酸乙酯提取液經(jīng)布氏漏斗抽濾得到澄清萃取液，再經(jīng)減壓蒸干得發(fā)酵產(chǎn)物浸膏；續(xù)隨子二萜醇發(fā)酵浸膏經(jīng)硅膠柱層析純化得轉(zhuǎn)化產(chǎn)物3-羰基續(xù)隨子二萜醇（1）；7β-羥基續(xù)隨子二萜醇發(fā)酵浸膏經(jīng)硅膠柱層析純化得到轉(zhuǎn)化產(chǎn)物7β-乙酰氧基續(xù)隨子二萜醇（2）；
其中，所述的液體培養(yǎng)基包括組分：200g馬鈴薯去皮，切成1立方厘米小丁，1l水微沸煎煮20分鐘，隨后用8層紗布趁熱過濾，放涼后用水將濾液補齊至1l，加入20g葡萄糖，攪拌溶解；分裝并經(jīng)121°c高壓滅菌20分鐘后，放涼使用；
其中，所述的固體培養(yǎng)基包含組分：液體培養(yǎng)基加入1%瓊脂，加熱溶解并分裝，121°c高壓滅菌20分鐘后，放涼使用。
本發(fā)明進行了抗腫瘤活性實驗，結(jié)果顯示，制得的3-羰基續(xù)隨子二萜醇衍生物(1)較底物有更好的抗腫瘤活性，為更具開發(fā)價值的續(xù)隨子二萜烷型先導化合物；進一步，本發(fā)明制得的續(xù)隨子二萜衍生物可制備抗腫瘤活性的藥物或藥物組合物，其中含有所述的化合物或其藥學上可接受的溶劑及藥學上可接受的載體。
具體實施方式
實施例1制備3-羰基續(xù)隨子二萜醇(1)
采用兩步活化法活化菌種，獲得的種子液以3%體積比接種于裝有250ml馬鈴薯培養(yǎng)基、體積為1l三角瓶中，28°c，180rpm條件下?lián)u瓶培養(yǎng)72h，每瓶活化后的菌液加入4mg/ml的續(xù)隨子二萜醇乙醇溶液，終濃度為0.1mg/ml。同條件培養(yǎng)72h后，加入1.5倍體積的乙酸乙酯萃取3次（約1200ml），合并有機層。殘有菌體的有機層經(jīng)布氏漏斗抽濾，得澄清萃取液，再減壓回收乙酸乙酯得到發(fā)酵液提取物；
發(fā)酵液提取物用少量乙酸乙酯溶解，以硅膠（100目-200目）拌樣，上樣于裝有40~50g柱層析硅膠（200-300目）的硅膠柱內(nèi)，用石油醚-乙酸乙酯（4:1）洗脫，先后得到含3-羰基續(xù)隨子二萜醇(1)和底物續(xù)隨子二萜醇的流分，回收溶劑，用丙酮溶解殘渣，將樣品溶液點于硅膠薄層板上，以石油醚-乙酸乙酯（7:3）上行法展開，取出晾干溶劑后，噴以10%的硫酸-乙醇溶液，加熱顯色，樣品點在硅膠薄層板中為磚紅色-棕色斑點，其中轉(zhuǎn)化產(chǎn)物3-羰基續(xù)隨子二萜醇(1)的rf值為0.5左右；底物續(xù)隨子二萜醇的rf值為0.4左右。化合物1的nmr結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)如表1所示。
實施例2制備7β-乙酰氧基續(xù)隨子二萜醇(2)
采用兩步活化法活化菌種，獲得的種子液以3%體積比接種于裝有250ml馬鈴薯培養(yǎng)基、體積為1l三角瓶中，28°c，180rpm條件下?lián)u瓶培養(yǎng)72h，每瓶活化后的菌液加入5mg/ml的7β-羥基續(xù)隨子二萜醇的乙醇溶液，終濃度為0.1mg/ml。同條件培養(yǎng)72h后，加入1.5倍體積的乙酸乙酯萃取3次（約1200ml），合并有機層。殘有菌體的有機層經(jīng)布氏漏斗抽率，得澄清萃取液，再減壓回收乙酸乙酯得到發(fā)酵液提取物；
發(fā)酵液提取物用少量乙酸乙酯溶解，以硅膠（100目-200目）拌樣，上樣于裝有40~50g柱層析硅膠（200-300目）的玻璃層析柱內(nèi)，用石油醚-乙酸乙酯（3:1）洗脫，先后得到含7β-乙酰氧基續(xù)隨子二萜醇(2)和底物7β-羥基續(xù)隨子二萜醇的流分，回收溶劑，用丙酮溶解殘渣，將樣品溶液點于硅膠薄層板上，以石油醚-乙酸乙酯（7:3）上行法展開，取出晾干溶劑后，噴以10%的硫酸-乙醇溶液，加熱顯色，樣品點在硅膠薄層板中為磚紅色-棕色斑點，其中轉(zhuǎn)化產(chǎn)物7β-乙酰氧基續(xù)隨子二萜醇(2)的rf值為0.6左右；底物7β-羥基續(xù)隨子二萜醇的rf值為0.3左右?；衔?的nmr結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)如表1所示。
表1是轉(zhuǎn)化產(chǎn)物3-羰基續(xù)隨子二萜醇(1)和7β-乙酰氧基續(xù)隨子二萜醇(2)的nmr數(shù)據(jù)(400mhz,cd3od).。
表1
實施例33-羰基續(xù)隨子二萜醇(1)的抗腫瘤活性實驗
以人乳腺癌細胞（mcf-7）和人結(jié)腸癌細胞（caco-2）為模型。mcf-7細胞培養(yǎng)基為含有10%小牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)基，caco-2細胞培養(yǎng)基為含有10%小牛血清、1%谷氨酸的dmem培養(yǎng)基；細胞經(jīng)10%胰蛋白酶消化后，用培養(yǎng)基吹散制成單細胞懸液，計數(shù)后調(diào)整細胞濃度為105個/ml，將細胞接種于96孔板，每孔體積為100ml。經(jīng)過37℃、5%co2孵育24h后，棄去上清液，細胞分組加含藥培養(yǎng)基200ml，每個濃度設置3個復孔；實驗組加入不同濃度的化合物1和續(xù)隨子二萜醇的dmso溶液（100.0、80.0、50.0、40.0、25.0、20.0、12.5、10.0、6.25和5.0mm），空白組加入同體積不含藥dmso溶液；將96孔板置于37℃，含5%co2的細胞孵育箱內(nèi)培養(yǎng)48h后，每孔加入10ml5mg/ml的mtt，37℃避光孵育4h，棄去上清液，每孔加入150mldmso，用平板振蕩儀振蕩15min，使結(jié)晶溶解；用酶標儀在570nm波長下檢測每孔光吸收值（od值）；計算化合物1和續(xù)隨子二萜醇對mcf-7及caco-2細胞的半數(shù)抑制濃度（ic50）；根據(jù)mtt比色法結(jié)果顯示，續(xù)隨子二萜醇在實驗濃度內(nèi)對mcf-7及caco-2細胞均無抑制作用，而化合物1在實驗濃度內(nèi)對mcf-7及caco-2細胞均有抑制作用，其ic50分別為53.2±10.4mm和58.5±13.2mm。