本發(fā)明屬于免疫治療領(lǐng)域。它涉及式i、ii和iii的環(huán)狀二核苷酸(cdn)。特別地，它涉及氟化脫氧核糖-cdn及其可藥用鹽和前藥，它們能夠在人細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞中誘導(dǎo)i型干擾素產(chǎn)生。這些環(huán)狀二核苷酸的細(xì)胞因子誘導(dǎo)活性需要真核細(xì)胞受體干擾素基因刺激物(sting)的存在，如體外所展示的。

發(fā)明背景

細(xì)胞因子誘導(dǎo)免疫療法

免疫療法是快速擴(kuò)張的醫(yī)學(xué)治療領(lǐng)域，其中為治療益處而人為激活、抑制或否則調(diào)節(jié)患者的免疫系統(tǒng)。免疫治療劑包括細(xì)胞、抗原(例如細(xì)菌或病毒的片段)、抗體、核酸、肽、蛋白質(zhì)、天然存在的配體和合成分子。細(xì)胞因子是主要因其借助復(fù)雜信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)協(xié)調(diào)免疫應(yīng)答的作用而知名的小分子糖蛋白信使，不過(guò)它們還執(zhí)行非免疫功能。已經(jīng)將它們作為免疫治療劑廣泛地探索。然而，直接施用細(xì)胞因子作為免疫治療藥受多種因素限制，包括細(xì)胞因子在血液中的半壽期非常短，這必須采用頻繁給藥和高劑量予以補(bǔ)償。一個(gè)高度有前景的免疫療法方案是細(xì)胞因子誘導(dǎo)法，因而患者用根據(jù)需要在其身體中觸發(fā)一種或多種治療有益性細(xì)胞因子產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)劑治療。

sting、細(xì)胞因子和免疫應(yīng)答

細(xì)胞因子生理產(chǎn)生的主要參與者是干擾素基因刺激物(sting；也稱作eris、mita、mpys或tm173)，一種在天然免疫中最重要的跨膜受體蛋白。人sting由基因tmem173編碼。sting的激活通過(guò)irf3(干擾素調(diào)節(jié)因子3)途徑導(dǎo)致i型干擾素(例如ifn-α和ifn-β)產(chǎn)生并且通過(guò)致瘤性轉(zhuǎn)錄因子nf-κb(活化型b細(xì)胞核因子κ-輕鏈增強(qiáng)子)途徑導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子(il-1α、il-1β、il-2、il-6、tnf-α等)產(chǎn)生。另外，研究者最近報(bào)道，響應(yīng)于病毒性感染，sting激活stat6(信號(hào)傳導(dǎo)者和轉(zhuǎn)錄激活物6)以誘導(dǎo)(th2型)、增加(il-12)或減少(il-10)各種細(xì)胞因子(包括趨化因子ccl2、ccl20和ccl26)的產(chǎn)生(chen等人,2011)。

sting激動(dòng)劑

目前已知人sting以三種方式激活：通過(guò)結(jié)合正在侵入的細(xì)菌或古細(xì)菌釋放的外源(3’,3)環(huán)狀二核苷酸(c-digmp、c-diamp和c-gamp)是通過(guò)(參見(gomelsky,2011)及其中參考文獻(xiàn))；通過(guò)結(jié)合(2’,3’)環(huán)狀鳥苷單磷酸–腺苷單磷酸酯((2’,3’)c-gamp)(一種最近發(fā)現(xiàn)的由環(huán)狀gmp-amp合酶(cgas；也稱作c6orf150或mb21d1)在外源雙鏈dna(例如由正在侵入的細(xì)菌、病毒或原蟲釋放的)或哺乳動(dòng)物中的自我-dna存在下產(chǎn)生的內(nèi)源環(huán)狀二核苷酸)(參見，例如(ablasser等人,2013)和(zhang等人,2013))；或通過(guò)結(jié)合合成性配體，如前述天然存在的環(huán)狀二核苷酸的類似物(參見，例如(dubensky,kanne和leong,2013)和(li等人,2014))。

sting在免疫療法中的調(diào)節(jié)作用

受到sting、細(xì)胞因子和免疫應(yīng)答之間互作的鼓舞以及受到關(guān)于sting及其突變之臨床意義的知識(shí)體系日益增長(zhǎng)鼓舞，研究者最近已經(jīng)開始探索sting作為多種適應(yīng)癥的治療靶。正在尋求新的sting激動(dòng)劑作為多種領(lǐng)域(如癌癥或傳染性疾病)中人和動(dòng)物健康的治療劑。已知的環(huán)狀二核苷酸sting激動(dòng)劑是一類優(yōu)異的作為堿基類似物之基礎(chǔ)的化合物，所述化合物可能顯示出令人感興趣的生物學(xué)活性或合乎需要的藥物樣特性。本發(fā)明包括治療性用于人類和動(dòng)物健康中的新環(huán)狀二核苷酸。

本發(fā)明的具體實(shí)施例

cdnsting激動(dòng)劑

在us/2014/0329889和wo/2014/189805中描述了環(huán)狀二核苷酸(cdn)sting激動(dòng)劑的一些示例。然而，作者僅化學(xué)合成了從他們提供的非常上位的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖中理論可能的很少數(shù)的化合物并對(duì)其進(jìn)行生物測(cè)試。他們沒有公開任何詳細(xì)的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系或沒有描述特定cdn結(jié)構(gòu)類別的任何類別效應(yīng)。因此，作者為所需的sting相關(guān)應(yīng)用提供單薄基本原理以確證根據(jù)實(shí)際sting活性或其他特性(例如藥物樣特性)，選擇一個(gè)結(jié)構(gòu)類別的cdn勝過(guò)另一個(gè)類別。最近，wo/2015/077354(pct/us2014/066436)探索了sting激動(dòng)劑，包括cdn，所述激動(dòng)劑均是其中兩個(gè)核苷酸含有核糖糖部分并且兩個(gè)核苷酸由硫代磷酸酯二酯鍵連接的(2’,3’)-cdn。

cdnsting激動(dòng)劑的知識(shí)鴻溝

對(duì)不同結(jié)構(gòu)類別的cdn的生物學(xué)活性知之甚少。具體而言，關(guān)于根據(jù)cdn結(jié)構(gòu)類別的類別效應(yīng)在先申請(qǐng)的專利稀少，也沒有關(guān)于這些類別效應(yīng)可能怎樣特別用于與sting活性相關(guān)的特定治療應(yīng)用、診斷應(yīng)用或研究應(yīng)用的在先申請(qǐng)的任何專利。這種信息將對(duì)基于操作sting活性，發(fā)現(xiàn)并利用具有治療應(yīng)用、診斷應(yīng)用或研究應(yīng)用需要之特性的新cdnsting激動(dòng)劑至關(guān)重要。

發(fā)明簡(jiǎn)述

考慮缺乏已報(bào)道的sting激動(dòng)劑結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系，sting激動(dòng)劑領(lǐng)域的發(fā)明時(shí)機(jī)成熟。在這種情況下，本發(fā)明涉及氟化脫氧核糖-cdnsting激動(dòng)劑，所述激動(dòng)劑相對(duì)于其相應(yīng)非氟化類似物顯示出獨(dú)特、非顯而易見和先前未報(bào)道的類別效應(yīng)。

在我們探索環(huán)狀二核苷酸(cdn)作為免疫調(diào)節(jié)性化合物和sting潛在激動(dòng)劑的工作中，我們最初力圖合成并分析以下式(i)、(ii)和(iii)的cdn：

其中：

·x1是h、oh或f；

·x2是h、oh或f；

·z是oh、or1、sh或sr1，其中：

i)r1是na或nh4，或者

ii)r1是在體內(nèi)提供oh或sh的酶不穩(wěn)定基團(tuán)，如新戊酰氧基甲基；

·b1和b2是選自以下的堿基：

條件是：

-在式(i)中：x1和x2不是oh，

-在式(ii)中：當(dāng)x1和x2是oh時(shí)，b1不是腺嘌呤并且b2不是鳥嘌呤，并且

-在式(iii)中：當(dāng)x1和x2是oh時(shí)，b1不是腺嘌呤，b2不是鳥嘌呤，并且z不是oh。

在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“環(huán)狀二核苷酸”(縮寫為“cdn”)代表一類在兩個(gè)核苷之間具有兩個(gè)磷酸二酯鍵或兩個(gè)硫代磷酸酯二酯鍵或一個(gè)磷酸二酯鍵和一個(gè)硫代磷酸酯二酯鍵的環(huán)狀分子。這包括(3’,5’)-(3’,5’)核苷酸鍵(縮寫為(3’,3’))；(3’,5’)-(2’,5’)核苷酸鍵(縮寫為(3’,2’))；(2’,5’)-(3’,5’)核苷酸鍵(縮寫為(2’,3’))；和(2’,5’)-(2’,5’)核苷酸鍵(縮寫為(2’,2’))。

術(shù)語(yǔ)“核苷”指包含氮堿基和五碳糖的糖基胺，其中含氮堿基通過(guò)β-糖苷鍵與五碳糖結(jié)合。

術(shù)語(yǔ)“核苷酸”指在糖部分的位置5’、3’或2’連接到磷酸酯基團(tuán)的任何核苷。

“可藥用鹽”包括從可藥用無(wú)機(jī)或有機(jī)堿和酸衍生的那些鹽。合適的鹽包括衍生自堿金屬如鉀和鈉、堿土金屬如鈣和鎂的那些，連同制藥技術(shù)中熟知的許多其他酸。

術(shù)語(yǔ)“可藥用前藥”在本文指這樣的化合物，其中所述化合物在宿主(即接受化合物的人類或動(dòng)物受試者)中經(jīng)代謝例如水解或氧化以形成本發(fā)明的化合物。前藥的常見示例包括在活性化合物的官能部分上具有生物不穩(wěn)定保護(hù)基的化合物。前藥包括可以氧化、還原、胺化、去胺化、羥化、去羥化、水解、去水化、烷基化、去烷基化、酰化、去乙酰化、磷酸化或去磷酸化以產(chǎn)生活性化合物的化合物。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“前藥”指由如上文定義的結(jié)構(gòu)式(i)、(ii)或(iii)或其任一個(gè)具體實(shí)施方案代表的化合物的無(wú)活性或活性衍生物，所述衍生物在動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物，如人類)的身體內(nèi)部經(jīng)歷自發(fā)或酶促轉(zhuǎn)化，以釋放藥理活性形式的化合物。關(guān)于綜述，參見(rautio等人,2008)。

特別地出于本發(fā)明的目的，由結(jié)構(gòu)式(i)、(ii)或(iii)代表的前藥化合物，包括其任一個(gè)上述具體實(shí)施方案，可以如(hecker和erion,2008)中詳述那樣形成。

磷酸酯前藥可以采取酯、尤其酰氧基烷基酯(例如新戊酰氧基甲基酯(pom))或s-?；虼一?sat)酯、碳酸酯、氨基甲酸酯或酰胺如氨基酸前藥的形式。

表達(dá)“酶不穩(wěn)定保護(hù)基”指這樣的基團(tuán)，所述基團(tuán)設(shè)計(jì)成借助電荷掩蔽而令化合物跨細(xì)胞膜或寄生物膜被動(dòng)擴(kuò)散成為可能，從而一旦在細(xì)胞或寄生物內(nèi)部，化合物發(fā)生提供oh或sh基的酶促轉(zhuǎn)化(或去保護(hù))。例如，酶不穩(wěn)定保護(hù)基的示例包括酰氧基烷基如新戊酰氧基甲基(pom)或s-?；虼一?sat)或氨基酸基團(tuán)。

在本說(shuō)明書中，認(rèn)為表述“式(i)、(ii)或(iii)的環(huán)狀二核苷酸”還包括所述式(i)、(ii)或(iii)環(huán)狀二核苷酸的可藥用鹽或可藥用前藥。

當(dāng)b1或b2是鳥嘌呤時(shí)是一個(gè)特定類別的式(i)、(ii)或(iii)環(huán)狀二核苷酸。

當(dāng)b1或b2是腺嘌呤時(shí)是一個(gè)特定類別的式(i)、(ii)或(iii)環(huán)狀二核苷酸。

當(dāng)b1或b2是次黃嘌呤時(shí)是一個(gè)特定類別的式(i)、(ii)或(iii)環(huán)狀二核苷酸。

當(dāng)b1和b2獨(dú)立地選自鳥嘌呤或腺嘌呤時(shí)是一個(gè)特定類別的式(i)、(ii)或(iii)環(huán)狀二核苷酸。

當(dāng)b1或b2獨(dú)立地選自鳥嘌呤或次黃嘌呤時(shí)是一個(gè)特定類別的式(i)、(ii)或(iii)環(huán)狀二核苷酸。

當(dāng)b1和b2獨(dú)立地選自腺嘌呤或次黃嘌呤時(shí)是一個(gè)特定類別的式(i)、(ii)或(iii)環(huán)狀二核苷酸。

當(dāng)z是oh時(shí)是一個(gè)特定類別的式(i)、(ii)或(iii)環(huán)狀二核苷酸。

當(dāng)z是sh時(shí)是一個(gè)特定類別的式(i)、(ii)或(iii)環(huán)狀二核苷酸。

z是oh或sh時(shí)是一個(gè)特定類別的式(i)、(ii)或(iii)環(huán)狀二核苷酸。

當(dāng)z是sr1時(shí)是一個(gè)特定類別的式(i)、(ii)或(iii)環(huán)狀二核苷酸，其中：

i)r1是na或nh4，或者

ii)r1是在體內(nèi)提供oh或sh的酶不穩(wěn)定基團(tuán)，如新戊酰氧基甲基。

當(dāng)b1和b2獨(dú)立地選自腺嘌呤或次黃嘌呤并且x1和x2相同時(shí)是一個(gè)特定類別的式(i)、(ii)或(iii)環(huán)狀二核苷酸。優(yōu)選地，x1和x2是oh或氟原子。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，z是oh或sh。

當(dāng)b1和b2獨(dú)立地選自鳥嘌呤或次黃嘌呤并且x1和x2相同時(shí)是一個(gè)特定類別的式(i)、(ii)或(iii)環(huán)狀二核苷酸。優(yōu)選地，x1和x2是oh或氟原子。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，z是oh或sh。

當(dāng)b1和b2獨(dú)立地選自腺嘌呤或鳥嘌呤并且x1和x2相同時(shí)是一個(gè)特定類別的式(i)、(ii)或(iii)環(huán)狀二核苷酸。優(yōu)選地，x1和x2是oh或氟原子。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，z是oh或sh。

當(dāng)x1和x2不是氟原子時(shí)是一個(gè)特定類別的式(i)、(ii)或(iii)環(huán)狀二核苷酸。

當(dāng)x1和x2當(dāng)中至少一者是氟原子時(shí)是一個(gè)特定類別的式(i)、(ii)或(iii)環(huán)狀二核苷酸。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，x1和x2均是氟原子。

一個(gè)特定類別的式(i)、(ii)或(iii)環(huán)狀二核苷酸是以下環(huán)狀二核苷酸(每者賦予格式為“cl###”的五字符代碼)：

或其可藥用鹽或前藥。

當(dāng)一個(gè)或兩個(gè)核苷在2’位置受修飾時(shí)是一個(gè)特定類別的式(i)、(ii)或(iii)環(huán)狀二核苷酸。這個(gè)類別包括以下化合物：

我們鑒定了這些cdn的一個(gè)在結(jié)構(gòu)上前所未有的亞群，所述亞群顯示令人驚訝的生物學(xué)活性及先前從未曾作為sting激動(dòng)劑報(bào)道。這些cdn形成本發(fā)明的基礎(chǔ)并且區(qū)別于先前報(bào)道的cdnsting激動(dòng)劑(參見，例如：us/2014/0329889和wo/2014/189805)。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供由以下全部結(jié)構(gòu)標(biāo)準(zhǔn)限定的cdn：首先，不同于其中每個(gè)核苷酸的糖部分是核糖的天然存在的cdn，在本發(fā)明的cdn中，每個(gè)核苷酸的糖部分是2'-脫氧核糖；其次，在本發(fā)明的cdn中，在兩個(gè)核苷酸中糖部分的2’位置必須以氟原子取代，或一個(gè)核苷酸的糖部分的2’位置必須以氟原子取代，而另一個(gè)核苷酸的糖部分的2’位置必須以氫原子取代；再者，在本發(fā)明的cdn中，每個(gè)核苷酸中的堿基優(yōu)選地選自鳥嘌呤、腺嘌呤或次黃嘌呤，條件是cdn的兩個(gè)核苷酸不能含有相同的堿基。

因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供根據(jù)權(quán)利要求1所述的式(i)的cdn，即式(i)的化合物：

其中：

·x1是h或f；

·x2是h或f；

·x1和x2當(dāng)中至少一者是氟原子；

·z是oh、or1、sh或sr1，其中：

i)r1是na或nh4，或者

ii)r1是在體內(nèi)提供oh或sh的酶不穩(wěn)定基團(tuán)，如新戊酰氧基甲基；

·b1和b2是選自以下的堿基：

并且b1是與b2不同的堿基，

或其可藥用鹽。

表達(dá)“b1是與b2不同的堿基”包括b1是鳥嘌呤并且b2是腺嘌呤，或b1是鳥嘌呤并且b2是次黃嘌呤，或b1是腺嘌呤并且b2是鳥嘌呤，或b1是腺嘌呤并且b2是次黃嘌呤，或b1是次黃嘌呤并且b2是鳥嘌呤，或b1是次黃嘌呤并且b2是腺嘌呤。

當(dāng)b1和b2不同并且x1和x2均是f時(shí)是一個(gè)特定類別的如上文定義的式(i)的環(huán)狀二核苷酸。

當(dāng)b1和b2不同，x1和x2均是f，并且z是oh時(shí)是一個(gè)特定類別的如上文定義的式(i)的環(huán)狀二核苷酸。

當(dāng)b1和b2不同，x1和x2均是f，并且z是如上文定義的or1時(shí)是一個(gè)特定類別的如上文定義的式(i)的環(huán)狀二核苷酸。

當(dāng)b1和b2不同，x1和x2均是f，并且z是如上文定義的sh時(shí)是一個(gè)特定類別的如上文定義的式(i)的環(huán)狀二核苷酸。

當(dāng)b1和b2不同，x1和x2均是f，并且z是如上文定義的sr1時(shí)是一個(gè)特定類別的如上文定義的式(i)的環(huán)狀二核苷酸。

當(dāng)b1和b2不同并且x1和x2不同(即x1＝h和x2＝f或x1＝f和x1＝h)時(shí)是一個(gè)特定類別的如上文定義的式(i)的環(huán)狀二核苷酸。

當(dāng)b1和b2不同，x1和x2不同，并且z是oh時(shí)是一個(gè)特定類別的如上文定義的式(i)的環(huán)狀二核苷酸。

當(dāng)b1和b2不同，x1和x2不同，并且z是如上文定義的or1時(shí)是一個(gè)特定類別的如上文定義的式(i)的環(huán)狀二核苷酸。

當(dāng)b1和b2不同，x1和x2不同，并且z是如上文定義的sh時(shí)是一個(gè)特定類別的如上文定義的式(i)的環(huán)狀二核苷酸。

當(dāng)b1和b2不同，x1和x2不同，并且z是如上文定義的sr1時(shí)是一個(gè)特定類別的如上文定義的式(i)的環(huán)狀二核苷酸。

本發(fā)明的環(huán)狀二核苷酸在體外在人細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞和人血中誘導(dǎo)i型干擾素和/或促炎細(xì)胞因子。這些環(huán)狀二核苷酸的細(xì)胞因子誘導(dǎo)活性需要sting的存在，如人細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞中體外實(shí)驗(yàn)所證實(shí)的。

本發(fā)明的環(huán)狀二核苷酸是受體sting的激動(dòng)劑。

術(shù)語(yǔ)“激動(dòng)劑”指在體外或在體內(nèi)激活生物受體以誘發(fā)生理反應(yīng)的任何物質(zhì)。

“sting”是“干擾素基因刺激物”的縮寫，其也稱作“內(nèi)質(zhì)網(wǎng)干擾素刺激物(eris)”、“irf3激活中介物(mita)”、“mpys”或“跨膜蛋白173(tm173)”。sting是人類中由基因tmem173編碼的跨膜受體蛋白。sting由環(huán)狀二核苷酸(cdn)激活導(dǎo)致irf3途徑和nf-κb途徑的激活及后續(xù)導(dǎo)致分別誘導(dǎo)i型干擾素和促炎細(xì)胞因子。響應(yīng)于病毒性感染，sting激活stat6(信號(hào)傳導(dǎo)者和轉(zhuǎn)錄激活物6)以誘導(dǎo)(th2型)、增加(il-12)或減少(il-10)各種細(xì)胞因子(包括趨化因子ccl2、ccl20和ccl26)的產(chǎn)生(chen等人,2011)。

術(shù)語(yǔ)“sting激動(dòng)劑”在本文中指在體外或在體內(nèi)激活受體sting的物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，如果符合以下情況，則認(rèn)為某化合物為sting激動(dòng)劑：

-它在體外在含有活性sting的人細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞中誘導(dǎo)i型干擾素；并且

-它在體外在不含有活性sting的人細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞中不誘導(dǎo)i型干擾素。

確定某配體是否為sting激動(dòng)劑的常見試驗(yàn)是在野生型人細(xì)胞系或動(dòng)物細(xì)胞系中和已經(jīng)通過(guò)堿基小缺失或長(zhǎng)缺失以遺傳方式失活sting編碼基因的相應(yīng)細(xì)胞系(例如純合的sting敲除細(xì)胞系)中孵育配體。sting的激動(dòng)劑將在野生型細(xì)胞中誘導(dǎo)i型干擾素，但是在sting編碼基因已經(jīng)失活的細(xì)胞中將不誘導(dǎo)i型干擾素。

本發(fā)明的環(huán)狀二核苷酸在體外在含有活性sting的人細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞中誘導(dǎo)i型干擾素。然而，它們不在體外在不含有活性sting的人細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞中誘導(dǎo)i型干擾素。

本發(fā)明涉及氟化脫氧核糖-環(huán)狀二核苷酸(cdn)。具體而言，它涉及(3’,3’)-2’(單氟化或雙氟化)-2'-脫氧核糖-(cdn)。

其中x1和x2當(dāng)中至少一者是氟原子，尤其x1和x2均是氟原子并且z是oh的式(i)、(ii)或(iii)環(huán)狀二核苷酸在人細(xì)胞系和鼠細(xì)胞系中比其非氟化對(duì)應(yīng)物誘導(dǎo)更多的i型干擾素和nf-κb活性。

如與其相應(yīng)的非氟化cdn相比，其中x1和x2當(dāng)中至少一者是氟原子，尤其x1和x2均是氟原子并且z是oh或sh的式(i)、(ii)和(iii)的環(huán)狀二核苷酸在小鼠中靜脈內(nèi)注射后顯示從血液消除較慢，即動(dòng)力學(xué)清除過(guò)程較長(zhǎng)，并且在體外顯示出更大的抗酶剪切性。

環(huán)狀二核苷酸的鹽或前藥形式

可藥用鹽包括從可藥用無(wú)機(jī)或有機(jī)堿和酸衍生的那些鹽。合適的鹽包括衍生自堿金屬如鉀和鈉、堿土金屬如鈣和鎂的那些，連同制藥技術(shù)中熟知的許多其他酸。術(shù)語(yǔ)“可藥用前藥”指這樣的化合物，其中所述化合物在宿主(即接受化合物的人類或動(dòng)物受試者)中經(jīng)代謝例如水解或氧化以形成本發(fā)明的化合物。前藥的常見示例包括在活性化合物的官能部分上具有生物不穩(wěn)定保護(hù)基的化合物。前藥包括可以氧化、還原、胺化、去胺化、羥化、去羥化、水解、去水化、烷基化、去烷基化、?；?、去乙?；⒘姿峄蛉チ姿峄援a(chǎn)生活性化合物的化合物。

可以施用本文所述的cdn前藥以額外地增加活性、生物利用率或穩(wěn)定性，或否則改變cdn單磷酸酯的特性。

多種cdn前藥配體是已知的。通常而言，磷酸酯部分上的烷基化、?；蚱渌H脂修飾或使用核苷的其他類似物將增加核苷酸的穩(wěn)定性。

可以代替在磷酸酯部分上一個(gè)或多個(gè)氫的取代基的示例是烷基、芳基、類固醇、糖，包括但不限于糖、1,2-二酰甘油和醇類。許多示例在(jones,1995)中描述。

本發(fā)明化合物的用途

本發(fā)明的另一個(gè)目的是用于人類或動(dòng)物中治療性療法的式(i)、(ii)或(iii)的環(huán)狀二核苷酸。

特別地，本發(fā)明的化合物可以用于人類或動(dòng)物健康中的治療性或診斷性應(yīng)用。以下示例起到顯示本發(fā)明的不同可能應(yīng)用的作用；然而，這些示例不意在限制本發(fā)明的范圍。

術(shù)語(yǔ)“治療劑”指向人類或動(dòng)物施用的一種或多種物質(zhì)，其旨在人類或動(dòng)物中實(shí)現(xiàn)某種治療作用，包括旨在阻止、治愈或緩和感染或疾病的結(jié)果和/或否則旨在改善人類或動(dòng)物的健康。

術(shù)語(yǔ)“單藥療法”指在任何臨床或醫(yī)療情境下使用單一物質(zhì)和/或策略治療人類或動(dòng)物，而與相同臨床或醫(yī)療情境下使用多種物質(zhì)和/或策略治療人類或動(dòng)物相反，無(wú)論多種物質(zhì)和/或策略是否以任何順序依次或同時(shí)使用。

術(shù)語(yǔ)“化療藥”在本文中指向人類或動(dòng)物施用旨在殺傷腫瘤或減緩或終止腫瘤生長(zhǎng)和/或減緩或終止癌細(xì)胞分裂和/或防止或減慢轉(zhuǎn)移的一種或多種化學(xué)物質(zhì)。經(jīng)常施用化療藥以治療癌癥，但是還適用于其他疾病。

術(shù)語(yǔ)“化療”指用一種或多種化療藥(參見上文定義)醫(yī)學(xué)治療人類或動(dòng)物。

術(shù)語(yǔ)“化學(xué)免疫療法”指化療物質(zhì)和/或策略和免疫療法物質(zhì)和/或策略的合并使用，無(wú)論是否以任何順序依次或同時(shí)進(jìn)行?；瘜W(xué)免疫療法經(jīng)常用來(lái)治療癌癥，但是也可以用來(lái)治療其他疾病。

術(shù)語(yǔ)“免疫系統(tǒng)”指涉及在身體內(nèi)預(yù)防感染、在感染期間或疾病期間保護(hù)身體和/或輔助身體在感染或疾病后恢復(fù)的分子、物質(zhì)(例如體液)、解剖結(jié)構(gòu)(例如細(xì)胞、組織和器官)和生理過(guò)程的全體或其任一種或多種組分?！懊庖呦到y(tǒng)”的完整定義超出本專利的范圍；然而，這個(gè)術(shù)語(yǔ)應(yīng)當(dāng)由本領(lǐng)域的任何普通執(zhí)業(yè)者理解。

術(shù)語(yǔ)“免疫介質(zhì)”指可以與任一種或多種免疫系統(tǒng)組分相互作用的任何內(nèi)源或外源物質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“免疫介質(zhì)”包括抗體、抗原、疫苗及其構(gòu)成組分、核酸、合成性藥物、天然或合成性有機(jī)化合物、細(xì)胞因子、天然或修飾的細(xì)胞、其合成性類似物和/或其片段。

術(shù)語(yǔ)“免疫療法”指其中人為調(diào)節(jié)人免疫系統(tǒng)或動(dòng)物免疫系統(tǒng)的一種或多種組分以直接或間接實(shí)現(xiàn)某種治療益處(包括全身性和/或局部效果和預(yù)防性和/或治愈性效果)的任何醫(yī)學(xué)治療。免疫治療可以包括通過(guò)任何途徑(例如口服、靜脈內(nèi)、皮膚、通過(guò)注射、通過(guò)吸入等)(無(wú)論是否為全身途徑、局部途徑或這兩種途徑)，單獨(dú)或以任何組合施用一種或多種免疫介質(zhì)(參見上文定義)至人類或動(dòng)物受試者?！懊庖咧委煛笨梢园ぐl(fā)、增加、減少、制止、阻止、阻斷或否則調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，和/或激活或失活細(xì)胞因子或免疫細(xì)胞，和/或調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞水平，和/或輸送一種或多種治療性或診斷性物質(zhì)至身體內(nèi)特定部位或至特定類型的細(xì)胞或組織，和/或摧毀特定細(xì)胞或組織。免疫治療可以用來(lái)實(shí)現(xiàn)局部效果、全身性效果或二者的組合。

術(shù)語(yǔ)“免疫抑制”描述任何人類或動(dòng)物受試者的狀態(tài)，所述受試者的免疫系統(tǒng)在功能上削弱、失活或否則受損，或在所述受試者中一種或多種免疫組分在功能上削弱、失活或否則受損?！懊庖咭种啤笨梢允羌膊?、感染、衰竭、營(yíng)養(yǎng)不良、醫(yī)學(xué)治療或某種其他生理或臨床狀態(tài)的原因、結(jié)果或副產(chǎn)物。

本文中同義使用的術(shù)語(yǔ)“免疫調(diào)節(jié)性物質(zhì)”、“免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)”、“免疫調(diào)節(jié)劑”和“免疫調(diào)節(jié)劑”指施用至人類或動(dòng)物時(shí)直接影響人類或動(dòng)物免疫系統(tǒng)運(yùn)行的任何物質(zhì)。常見免疫調(diào)節(jié)劑的示例包括但不限于抗原、抗體和小分子藥物。

術(shù)語(yǔ)“疫苗”指施用至人類或動(dòng)物以激發(fā)或增強(qiáng)針對(duì)人類或動(dòng)物中一種或多種抗原的特異性免疫系統(tǒng)應(yīng)答和/或保護(hù)作用的生物學(xué)制品。

術(shù)語(yǔ)“接種”指用疫苗治療人類或動(dòng)物或指向人類或動(dòng)物施用疫苗的行為。

術(shù)語(yǔ)“輔藥”指與主要治療性物質(zhì)一起(或者以任何順序依次或與其同時(shí))施用以實(shí)現(xiàn)不能通過(guò)單獨(dú)使用主要治療性物質(zhì)實(shí)現(xiàn)的某種互補(bǔ)性、協(xié)同性或其他有益作用的次要治療性物質(zhì)。輔藥可以與疫苗、化療或某種其他治療性物質(zhì)一起使用。輔藥可以增強(qiáng)主要治療性物質(zhì)的功效、減少主要治療性物質(zhì)的毒性或副作用或向接受主要治療性物質(zhì)的受試者提供某種保護(hù)，如但不限于改善免疫系統(tǒng)的運(yùn)行。

在一個(gè)實(shí)施方案中，式(i)、(ii)或(iii)的環(huán)狀二核苷酸可以作為免疫療法施用人類或動(dòng)物，以體內(nèi)誘導(dǎo)對(duì)人類或動(dòng)物有治療益處的一種或多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生。這種類型的免疫治療可以單獨(dú)使用或與其他治療策略組合使用，無(wú)論是否以任何順序依次或同步使用。它可以用來(lái)防止、治愈、和/或緩和人類或動(dòng)物中感染或疾病的影響，和/或用來(lái)調(diào)節(jié)人類或動(dòng)物的免疫系統(tǒng)以實(shí)現(xiàn)某種其他治療益處。

在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的環(huán)狀二核苷酸可以用于免疫抑制的個(gè)體的細(xì)胞因子誘導(dǎo)免疫療法。

在這個(gè)示例中，式(i)、(ii)或(iii)的環(huán)狀二核苷酸將施用至免疫抑制的人類或動(dòng)物受試者，以體內(nèi)誘導(dǎo)直接或間接增強(qiáng)人類或動(dòng)物免疫系統(tǒng)的一種或多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生?？赡軓倪@種治療中獲益的受試者包括患有自體免疫疾病、免疫系統(tǒng)缺損或缺陷、微生物感染或病毒性感染、傳染性疾病或癌癥的那些。

本發(fā)明因此公開了一種在免疫抑制的個(gè)體中誘導(dǎo)細(xì)胞因子的方法，所述方法包括向有需要的患者施用式(i)、(ii)或(iii)的環(huán)狀二核苷酸或其可藥用鹽或前藥。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的環(huán)狀二核苷酸可以用于與化療組合的細(xì)胞因子誘導(dǎo)免疫療法。

在這個(gè)示例中，式(i)、(ii)或(iii)的環(huán)狀二核苷酸將與一種或多種化療藥一起以任何順序依次或同時(shí)施用至癌癥患者，以終止患者中腫瘤的生長(zhǎng)、使其收縮和/或摧毀之。因本發(fā)明化合物提供的細(xì)胞因子誘導(dǎo)和化療藥提供的細(xì)胞毒性組合產(chǎn)生的化學(xué)免疫療法可能對(duì)患者的毒性較小，在患者中造成更少的副作用和/或比化療藥作為單藥療法使用時(shí)顯示更大的抗腫瘤功效。

本發(fā)明因此公開一種用于治療癌癥的方法，所述方法包括向有需要的患者施用：

-化療藥；和

-式(i)、(ii)或(iii)的環(huán)狀二核苷酸或其可藥用鹽或前藥。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的環(huán)狀二核苷酸可以作為疫苗輔助療法用于細(xì)胞因子誘導(dǎo)免疫療法。

在這個(gè)示例中，式(i)、(ii)或(iii)的環(huán)狀二核苷酸將施用至已經(jīng)接受、正在接受或?qū)⒁邮芙臃N的人類或動(dòng)物受試者。本發(fā)明提供的益處可能包括增強(qiáng)接種對(duì)靶抗原的功效，降低接種的毒性、減少接種的不良副作用或增強(qiáng)人類或動(dòng)物受試者的免疫保護(hù)作用。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是用于治療細(xì)菌性感染、病毒性感染或癌癥的式(i)、(ii)或(iii)的環(huán)狀二核苷酸。

如本文所用，“癌癥”指受試者中以細(xì)胞生長(zhǎng)或死亡不受調(diào)節(jié)或失調(diào)節(jié)為特征的生理狀況。術(shù)語(yǔ)“癌癥”包括實(shí)體瘤和血液源腫瘤，無(wú)論是否為惡性或良性。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，癌癥從以下群組：膀胱癌、乳腺癌、膽管細(xì)胞癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、鼻咽癌、卵巢癌、胰腺癌和尿路上皮癌。

在一個(gè)具體實(shí)施方案中，癌癥是胰腺實(shí)體瘤。

本發(fā)明因此公開一種用于治療細(xì)菌性感染、病毒性感染或癌癥的方法，所述方法包括向有需要的患者施用式(i)、(iii)或(iii)的環(huán)狀二核苷酸或其可藥用鹽或前藥。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是用于治療可以借助sting途徑誘導(dǎo)免疫應(yīng)答而減輕的病理學(xué)的式(i)、(ii)或(iii)的環(huán)狀二核苷酸。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是一種包含式(i)、(ii)或(iii)的環(huán)狀二核苷酸和化療藥的組分套裝，其用于治療胰腺實(shí)體瘤。

術(shù)語(yǔ)“組分套裝”在本文中指合用制品，其中對(duì)于通過(guò)同時(shí)施用或依次施用至患者用于合并治療的有效成分在物理上分離。

因此，根據(jù)本發(fā)明，化療藥和環(huán)狀二核苷酸或其可藥用鹽或前藥以分離的形式同時(shí)、獨(dú)立或依次地以任何順序施用至患者，以治療癌癥。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述化療藥是吉西他濱。

合成環(huán)狀二核苷酸的脫氧核苷

天然核苷2'-脫氧-腺苷(da)、2'-脫氧-鳥苷(dg)或2'-脫氧-肌苷(di)可以用于合成式(i)和(ii)的cdn。

用于式(ii)和(iii)的cdn的3’-脫氧-腺嘌呤、3’-脫氧-鳥苷或3’-脫氧-肌苷指具有糖部分(例如在3'位置經(jīng)如此修飾從而羥基(3'-oh)由氫基團(tuán)替換的核糖基部分或木糖基部分)的核苷單元。

合成cdn的氟取代的核苷

由于sting位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并且檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)中的環(huán)狀二核苷酸，所以注定治療性使用的任何sting激動(dòng)劑必須能夠滲入細(xì)胞。另外，化合物的更大細(xì)胞攝取量轉(zhuǎn)換成更高的生物利用率，這是合乎臨床使用需要的特性。在本發(fā)明中，設(shè)計(jì)氟化的化合物以探索以下可能性：一個(gè)或兩個(gè)氟原子賦予的更大細(xì)胞攝取量將導(dǎo)致比不含有任何氟原子的參考化合物c-aimp更大的i型干擾素誘導(dǎo)活性。

在本發(fā)明中，我們令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，作為sting激動(dòng)劑，全部含有至少一個(gè)氟原子的主題cdn比其相應(yīng)的非氟化類似物更有活性。具體而言，本發(fā)明的cdn在人類細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞和人血中比其相應(yīng)的非氟化類似物顯示出更大的sting依賴性細(xì)胞因子誘導(dǎo)活性。

藥物在身體內(nèi)酶促降解更迅速，其半壽期越短并且因此，其活性越小。因此，意圖治療性使用的化合物的合乎需要特性是抗酶降解性。存在體外酶促切割試驗(yàn)可以提供給定化合物抵抗常見酶的某種指示，所述的常見酶降解在結(jié)構(gòu)上與正在測(cè)試的化合物類似的化合物。在我們工作中，我們非常驚訝發(fā)現(xiàn)了本發(fā)明主題cdn的又一個(gè)區(qū)別型特征：與它們的相應(yīng)非氟化核糖-cdn相比，這些氟化脫氧核糖-cdn始終顯示優(yōu)越的蛇毒磷酸二酯酶(svpd)或核酸酶p1(np1)切割抗性。

單氟-核苷

式(i)和(ii)的cdn的腺苷、鳥苷或肌苷的2'-脫氧-2'-氟指在2'位置經(jīng)如此修飾，從而羥基(2'-oh)由氟基團(tuán)(2'-f)替換的核苷。

可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法制備合成式(i)和(ii)的cdn的2'-氟核苷衍生物(參見，例如：(herdewijna,1989；thomas,1994)和(ross,1997))。

式(ii)和(iii)的cdn的腺苷、鳥苷或肌苷的3'-脫氧-3'-氟指在3'位置經(jīng)如此修飾，從而羥基(3'-oh)由氟基團(tuán)(3'-f)替換的核苷。

硫代磷酸酯核苷酸間鍵

硫代磷酸酯核苷酸間鍵指用p＝s基團(tuán)替換p＝o基團(tuán)，并且包括二硫代磷酸酯核苷間鍵。環(huán)狀二核苷酸中存在的一個(gè)或兩個(gè)核苷酸間鍵可以是硫代磷酸酯核苷酸間鍵。

可以將cdn的磷酸二酯鍵中的磷原子描述為具有“前手性”。一旦替換或修飾磷酸二酯鍵的非成鍵氧原子，則生成手性糖-磷酸酯鍵。所得到的糖間鍵是sp糖間鍵或rp糖間鍵。為獲得硫代磷酸酯鍵，用硫原子替換天然磷酸二酯鍵中的非成鍵氧原子產(chǎn)生了手性中心并且因此提供sp和rp非對(duì)映異構(gòu)體。其中糖主鏈中基本上全部磷原子為sp或rp的分子在本文中稱作“手性純的”。

環(huán)狀二核苷酸由核酸酶和/或磷酸二酯酶以酶促方式降解(參見，例如：(li等人,2014)(diner等人,2013)(danilchanka和mekalanos,2013)(shanahan,gaffney,jones和strobel,2013)(simm,morr,kader,nimtz和romling,2004))，并且因此，當(dāng)作為治療劑使用時(shí)，這些化合物可以遭遇半壽期削弱。選擇化合物cl655和cl656以使得最大半壽期成為可能，以及可能令活性在體內(nèi)更高，因?yàn)樗鼈兒辛虼姿狨?也稱作“p(s)”或“硫代磷酸酯”)核苷酸間鍵。使用這類鍵是酶促水解的已知規(guī)避策略(參見，例如：us2014/0205653a1)。比其磷酸二酯類似物更抵抗酶促水解的硫代磷酸酯化合物的示例是(2’,3’)c-g^sa^smp或(2’,3’)c-gamp(s)(invivogen目錄代碼：tlrl-scga；li,2014)。硫代磷酸酯鍵在磷原子上引入額外的手性中心，所述手性中心在每個(gè)硫代磷酸酯鍵產(chǎn)生非對(duì)映異構(gòu)體對(duì)([rp]和[sp])。在本發(fā)明中，將cl655和cl656作為外消旋混合物獲得并測(cè)試。

制備活性化合物的一般方案

簡(jiǎn)單制備本文公開的環(huán)狀二核苷酸或其前藥的方法可以如下文詳述中那樣制備或通過(guò)其他本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，這些方案無(wú)論如何將不起限制作用并且可以作出細(xì)節(jié)的變化而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。

如本文所用和除非另有限定，術(shù)語(yǔ)“保護(hù)基”指與氧、氮或磷原子連接以防止該原子進(jìn)一步反應(yīng)或用于其他目的的化學(xué)官能團(tuán)。氧和氮的多種類型保護(hù)基是有機(jī)合成領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且例如在(wuts,greene和greene,2014)中描述。

通常，通過(guò)以下方式制備式(i)、(ii)或(iii)的環(huán)狀二核苷酸或其前藥：首先制備相應(yīng)的核苷，隨后準(zhǔn)備5’-羥基，在2’位置或3’位置的官能團(tuán)(oh)，并且如果需要，隨后保護(hù)嘌呤堿基的環(huán)外胺。隨后，將適當(dāng)保護(hù)的核苷轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的3’-磷酰亞胺、2’-磷酰亞胺、3’-h-膦酸酯或2’-h-膦酸酯，它們構(gòu)成制備本文所述的環(huán)狀二核苷酸的原料。

下文顯示的反應(yīng)方案適用于合成式i的cdn并且可以用于合成式(ii)和(iii)的cdn：

方案1是合成本發(fā)明活性化合物的非限制性示例，并且尤其是式(i)的cdn的合成方案，其中b1、b2、x1、x2和z如上文限定。str是三苯甲基衍生物，如二甲氧基三苯甲基(dmtr)，p是保護(hù)基，r2是烷基如異丙基，r3是保護(hù)基如氰基乙基，r4是保護(hù)基如烯丙基，并且x3是o或s。

方案2是合成本發(fā)明活性化合物的非限制性示例，并且尤其是式(i)的cdn的替代性合成方案，其中b1、b2、x1、x2和z如上文限定。str是三苯甲基衍生物，如二甲氧基三苯甲基(dmtr)，p是保護(hù)基，r2是烷基如異丙基，r4是保護(hù)基如氰基乙基，r5是保護(hù)基如烯丙基，并且x3是o或s。

制備式(i)和(ii)的cdn，通過(guò)首先制備適當(dāng)保護(hù)的式(ia)的磷酰亞胺或式(if)的h-膦酸酯：

方案3是合成式(ia)的磷酰亞胺或式(if)的h-膦酸酯的非限制性示例，其中b2、yp、xp、r7、r8和str如上文限定。

可以通過(guò)首先制備適當(dāng)保護(hù)的式(iv)的核苷，合成式(ia)的磷酰亞胺或式(if)的h-膦酸酯，其可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員完成。首先，保護(hù)具有環(huán)外胺的堿基，并且隨后同時(shí)地或選擇性地保護(hù)3’-和5’-羥基。最終保護(hù)置換x2，當(dāng)x2是羥基時(shí)使用保護(hù)基如tbdms或四氫吡喃(thp)。最后，切去在3’-和5’-羥基的保護(hù)基，并且隨后用三苯甲基衍生物保護(hù)5’-羥基以產(chǎn)生式(iv)的核苷：

方案4是合成適當(dāng)保護(hù)的式(iv)的核苷的非限制性示例，其中b2、x2、p和str如上文限定。r5和r6是保護(hù)基。

式(iva)的核苷可以通過(guò)chu,2002；rajagopalan,2003；schinazi,2004；vorbrüggen,2001中略述的方法制備。

附圖簡(jiǎn)述

圖1.細(xì)胞中的sting信號(hào)傳導(dǎo)。sting由環(huán)狀二核苷酸(cdn)激活導(dǎo)致irf3途徑和nf-κb途徑的激活及后續(xù)導(dǎo)致分別誘導(dǎo)i型干擾素和促炎細(xì)胞因子。

圖2.thp1-dual^tm細(xì)胞培養(yǎng)物中的體外i型干擾素誘導(dǎo)活性：非氟化對(duì)氟化的環(huán)狀二核苷酸。

圖3.thp1-dual^tm細(xì)胞培養(yǎng)物中的體外nf-κb通路誘導(dǎo)作用：非氟化對(duì)氟化的環(huán)狀二核苷酸。

圖4.野生型b16細(xì)胞與sting敲除b16細(xì)胞中的體外i型干擾素誘導(dǎo)活性。它顯示了在野生型b16細(xì)胞培養(yǎng)物(圖左側(cè))或sting-敲除的b16細(xì)胞(圖右側(cè))培養(yǎng)物中孵育24小時(shí)的非氟化環(huán)狀二核苷酸對(duì)氟化環(huán)狀二核苷酸的相對(duì)isg54活性(作為i型干擾素誘導(dǎo)作用的間接量度)。wt：野生型；sko：sting敲除(純合)。

圖5.野生型raw細(xì)胞與sting敲除raw細(xì)胞中的體外i型干擾素誘導(dǎo)活性。它顯示了在野生型raw細(xì)胞培養(yǎng)物(圖左側(cè))或sting-敲除的raw細(xì)胞(圖右側(cè))培養(yǎng)物中孵育24小時(shí)的非氟化環(huán)狀二核苷酸對(duì)氟化環(huán)狀二核苷酸的相對(duì)isg54活性(作為i型干擾素誘導(dǎo)作用的間接量度)。wt：野生型；sko：sting敲除(純合)。

圖6：小鼠中環(huán)狀二核苷酸的i型干擾素誘導(dǎo)活性。來(lái)自處理后4小時(shí)的小鼠的血清中i型干擾素誘導(dǎo)作用的測(cè)量。

圖7.小鼠中環(huán)狀二核苷酸的il-6誘導(dǎo)活性。來(lái)自處理后4小時(shí)的小鼠的血清中il-6誘導(dǎo)作用的測(cè)量。

圖8.小鼠中環(huán)狀二核苷酸的體內(nèi)消除。處理的小鼠中環(huán)狀二核苷酸的血漿濃度的時(shí)間變化。

圖9.人全血中cdn的細(xì)胞因子誘導(dǎo)活性。

圖10a-d.不同cdn隨時(shí)間推移對(duì)svpd和np1酶切割作用的抗性，如通過(guò)hplc監(jiān)測(cè)。就svpd(a)或np1(b)的抗性，將cl614和cl656與c-aimp比較。就svpd(c)或np1(d)的抗性，相對(duì)于c-gamp比較cl603和cl656。

圖11.thp-1dual^tm細(xì)胞中與酶svpd和np1孵育之前和之后不同cdn的體外活性。

本發(fā)明將由以下非限制性實(shí)施例說(shuō)明。

實(shí)施例

作為本發(fā)明代表的特定化合物按照以下實(shí)施例制備并且通過(guò)說(shuō)明方式提供以輔助理解本發(fā)明。它們不應(yīng)當(dāng)解釋成以任何方式限制在后續(xù)權(quán)利要求書中所述的本發(fā)明。本發(fā)明的化合物也可以用作后續(xù)實(shí)施例中的中間體以產(chǎn)生本發(fā)明的額外化合物。并不必然作出嘗試以優(yōu)化在任何反應(yīng)中獲得的產(chǎn)率。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道怎樣通過(guò)反應(yīng)時(shí)間、溫度、溶劑、試劑和其他化學(xué)合成參數(shù)的例行變化增加這種產(chǎn)率。

本發(fā)明在顯示用于合成cdn的制備性方法的實(shí)施例1中及在顯示用于生物學(xué)評(píng)價(jià)這些cdn的方法的實(shí)施例2中進(jìn)一步說(shuō)明。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，這些實(shí)施例無(wú)論如何不起限制作用并且可以作出細(xì)節(jié)的變化而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。

描述本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)是常用的并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。如本文所用，以下縮略語(yǔ)具有所示的意思：

℃為攝氏度；a為腺苷；acn為乙腈；aq.為水質(zhì)；cdcl3為氘化氯仿；c18為十八烷基碳鏈結(jié)合的二氧化硅；d為二重峰；da為脫氧腺苷；dd為二重峰的二重峰；di為脫氧肌苷；d2o為氧化氘；dca為二氯乙酸；dcm為二氯甲烷；dmso-d6為氘化二甲基亞砜；dmtrcl為4,4′-二甲氧基三苯甲基氯化物；equiv.為當(dāng)量；es為電噴霧電離；et2o為二乙醚；etoac乙酸乙酯；etoh為乙醇；et3n·3hf為三乙胺三氟化氫；g為克；¹h為質(zhì)子；h為小時(shí)；hz為赫茲；hplc為高效液相色譜；i為肌苷；ifn為干擾素；ifn-α為干擾素α；ifn-β為干擾素β；iproh為異丙醇；irf3為干擾素調(diào)節(jié)因子3；isg(或isg54)為干擾素刺激基因；isre為干擾素刺激反應(yīng)元件；i.v.為靜脈內(nèi)；lc為液相色譜；m為多重峰；m為摩爾；m/z為質(zhì)荷比；meoh為甲醇；mg為毫克；mgso4為硫酸鎂；mhz為兆赫茲；min為分鐘；ml(或ml)為毫升；mmol為毫摩爾；mol/l為摩爾/升；ms為質(zhì)譜法；nahco3為碳酸氫鈉；nahso3為硫代硫酸鈉；nh4oh為氫氧化銨；nf-κb為活化型b細(xì)胞核因子κ-輕鏈增強(qiáng)子；nmr為核磁共振；pads為苯乙?；蚧铮籶pm為百萬(wàn)分之一；ppts為對(duì)甲苯磺酸吡啶鎓；rt為室溫；seap為分泌型胚堿性磷酸酶；s為單峰；sl為大單峰；t為三重峰；sko為純合sting敲除；sting為干擾素基因刺激物；tbaf為四正丁基氟化銨；thf為四氫呋喃；tbdmscl為叔丁基二甲基氯硅烷；teaa為三乙基乙酸銨；tfa為三氟乙酸；tipscl2為1,3-二氯-1,1,3,3-四異丙基二硅氧烷；wt為野生型；μg為微克；μl(或μl)為微升；μm為微米；δ為化學(xué)位移。

購(gòu)買適于合成核苷和核苷酸的無(wú)水溶劑和試劑并且在干燥氬氣或氮?dú)庀率褂脽o(wú)水技術(shù)操作。亞酰胺(amidite)偶聯(lián)反應(yīng)和環(huán)化在無(wú)水乙腈或吡啶中在干燥氬氣或氮?dú)庀逻M(jìn)行。無(wú)水吡啶中全部反應(yīng)的原料通過(guò)從吡啶濃縮(3次)而干燥。使用二氯甲烷中的甲醇梯度，使用fluka高純度級(jí)或merck9385級(jí)二氧化硅進(jìn)行制備性硅膠快速色譜。在agilent1290uhplc系統(tǒng)上進(jìn)行分析性lc/esms，所述系統(tǒng)連接至二極管陣列探測(cè)器(dad)agilent1260infinity和配備電噴霧電離源(esi)并受chemstation軟件控制的agilent6130四極質(zhì)譜儀。使用流量為300μl/分鐘的10mm甲酸銨和乙腈梯度，lc系統(tǒng)配備aquitycshc1850×2.1mm1.7μm柱。uv檢測(cè)波長(zhǎng)是254nm。質(zhì)譜儀以esi正模式和負(fù)模式運(yùn)行。使用流量為60ml/分鐘的10mm甲酸銨和乙腈梯度在sunfireprepc185μmobd30x150mm柱上，在254nm監(jiān)測(cè)的waters制備性150qhplc系統(tǒng)上進(jìn)行制備性hplc。在bruker300mhz(fourrier300)上在室溫獲得¹hnmr譜并且以ppm低磁場(chǎng)報(bào)告。在真空下250℃干燥商業(yè)供應(yīng)的產(chǎn)品12小時(shí)后，使用分子篩(ms)商業(yè)核苷磷酰亞胺從chemgenes供應(yīng)。

以下實(shí)施例起到說(shuō)明本發(fā)明的作用。這些實(shí)施例無(wú)論如何不意在限制本發(fā)明范圍。

實(shí)施例1：合成本發(fā)明的化合物

實(shí)施例1.a：制備磷酸三酯的一般方案：

將適當(dāng)保護(hù)的磷酰亞胺或市售磷酰亞胺與無(wú)水a(chǎn)cn一起共蒸發(fā)3次，并且將所產(chǎn)生的固體在分子篩存在下溶解于(0.1mol/l，2當(dāng)量)的溶液中。向溶液添加烯丙醇(2當(dāng)量)并且將所得到的混合物攪拌30分鐘。

對(duì)于磷酸三酯鍵：

將癸烷中的叔丁基過(guò)氧化氫(5.5m，2當(dāng)量)添加至混合物，將所述混合物攪拌40分鐘。將溶液過(guò)濾并且用dcm洗滌分子篩。濾液在真空下濃縮。

對(duì)于硫代磷酸酯三酯鍵：

將混合物在真空下濃縮并且將殘留物溶解于無(wú)水吡啶中的0.2mpads溶液(2.5當(dāng)量)內(nèi)。將混合物在室溫?cái)嚢?5分鐘。將溶液過(guò)濾并且用dcm洗滌分子篩。濾液在真空下濃縮并且隨acn共蒸發(fā)3次。

將殘留物在水存在下用dca/dcm溶液(3％)(10當(dāng)量)處理15分鐘。借助添加meoh和吡啶猝滅反應(yīng)。在真空下移除溶劑，并且使用dcm/meoh作為洗脫液，通過(guò)硅膠柱色譜純化殘留物。通過(guò)lc-es/ms分析以[m-h]^-和/或[m+h]⁺時(shí)的離子證實(shí)化合物的結(jié)構(gòu)。

實(shí)施例1.b：制備h-膦酸酯的一般方案：

將適當(dāng)保護(hù)的磷酰亞胺或商業(yè)磷酰亞胺溶解于acn的溶液中。向溶液添加水(2當(dāng)量)和吡啶tfa(1.2當(dāng)量)，并且將混合物攪拌15分鐘。隨后，在真空下移除溶劑。將殘留物在水存在下用dca/dcm溶液(3％)(10當(dāng)量)處理15分鐘。借助添加meoh和吡啶猝滅反應(yīng)。在真空下移除溶劑，并且使用dcm/meoh作為洗脫液，通過(guò)硅膠柱色譜純化殘留物。通過(guò)lc-es/ms分析以[m-h]^-和/或[m+h]⁺時(shí)的離子證實(shí)化合物的結(jié)構(gòu)。

實(shí)施例1.c：合成二核苷酸的方案：

在分子篩存在下，向溶液中實(shí)施例1.a的化合物或適當(dāng)保護(hù)的化合物的溶液(0.1mol/l，2當(dāng)量)一次性添加適當(dāng)保護(hù)的磷酰亞胺或商業(yè)磷酰亞胺。將混合物攪拌30分鐘。

對(duì)于磷酸三酯鍵：

將癸烷中的叔丁基過(guò)氧化氫(5.5m，2當(dāng)量)添加至混合物，將所述混合物攪拌40分鐘。將溶液過(guò)濾并且用dcm洗滌分子篩。濾液在真空下濃縮。

對(duì)于硫代磷酸酯三酯鍵：

將混合物在真空下濃縮并且將殘留物溶解于無(wú)水吡啶中的0.2mpads溶液(2.5當(dāng)量)內(nèi)。將混合物在室溫?cái)嚢?5分鐘。將溶液過(guò)濾并且用dcm洗滌分子篩。濾液在真空下濃縮并且隨acn共蒸發(fā)3次。

將殘留物在水存在下用dca/dcm溶液(3％)(10當(dāng)量)處理15分鐘。通過(guò)添加meoh和吡啶猝滅反應(yīng)。在真空下移除溶劑，并且使用dcm/meoh作為洗脫液，通過(guò)硅膠柱色譜純化殘留物。通過(guò)lc-es/ms分析以[m-h]^-和/或[m+h]⁺時(shí)的離子證實(shí)化合物的結(jié)構(gòu)。

實(shí)施例1.d：合成二核苷酸的備選方案：

在分子篩存在下，向(0.1mol/l，2當(dāng)量)溶液中實(shí)施例1.b的化合物的溶液一次性添加適當(dāng)保護(hù)的磷酰亞胺或商業(yè)磷酰亞胺。將混合物攪拌30分鐘。

對(duì)于磷酸三酯鍵：

將癸烷中的叔丁基過(guò)氧化氫(5.5m，2當(dāng)量)添加至混合物，將所述混合物攪拌40分鐘。將溶液過(guò)濾并且用dcm洗滌分子篩。濾液在真空下濃縮。

對(duì)于硫代磷酸酯三酯鍵：

將混合物在真空下濃縮并且將殘留物溶解于無(wú)水吡啶中的0.2mpads溶液(2.5當(dāng)量)內(nèi)。將混合物在室溫?cái)嚢?5分鐘。將溶液過(guò)濾并且用dcm洗滌分子篩。濾液在真空下濃縮并且隨acn共蒸發(fā)3次。

將殘留物在水存在下用dca/dcm溶液(3％)(10當(dāng)量)處理15分鐘。借助添加meoh和吡啶猝滅反應(yīng)。在真空下移除溶劑，并且使用dcm/meoh作為洗脫液，通過(guò)硅膠柱色譜純化殘留物。通過(guò)lc-es/ms分析以[m-h]^-和/或[m+h]⁺時(shí)的離子證實(shí)化合物的結(jié)構(gòu)。

實(shí)施例1.e：移除烯丙基的方案：

向來(lái)自實(shí)施例1.c的二核苷酸在丙酮中的溶液添加碘化鈉(10當(dāng)量)，并且將所產(chǎn)生的懸液在回流下攪拌2小時(shí)。通過(guò)過(guò)濾收集所產(chǎn)生的無(wú)色沉淀物并且用冷丙酮洗滌。這種沉淀物具有高度吸濕性并且因此立即用于下一個(gè)程序中。通過(guò)lc-es/ms分析以[m-h]^-和/或[m+h]⁺時(shí)的離子證實(shí)化合物的結(jié)構(gòu)。

實(shí)施例1.f：移除烯丙基的備選方案：

向來(lái)自實(shí)施例1.c的二核苷酸在無(wú)水thf中的溶液添加n-甲基苯胺(3當(dāng)量)和四(三苯基膦)鈀(0)(0.2當(dāng)量)。將所得到的懸液在室溫?cái)嚢?5分鐘。隨后，在真空下移除溶劑并且將殘留物隨二乙醚一起粉碎。通過(guò)過(guò)濾收集所產(chǎn)生的無(wú)色沉淀物并且用冷二乙醚洗滌。使用dcm/meoh作為洗脫液，通過(guò)硅膠柱色譜純化這種沉淀物。通過(guò)lc-es/ms分析以[m-h]^-和/或[m+h]⁺時(shí)的離子證實(shí)化合物的結(jié)構(gòu)。

實(shí)施例1.g：二核苷酸環(huán)化的方案：

將實(shí)施例1.e或1.f中獲得的固體隨無(wú)水吡啶并且隨后隨無(wú)水a(chǎn)cn一起共蒸發(fā)3次。將殘留物懸浮于thf中，并且向所產(chǎn)生的不均勻混合物連續(xù)添加n-甲基咪唑(10當(dāng)量)和2,4,6-三異丙基苯磺酰氯(10當(dāng)量)。將所產(chǎn)生的混合物在25℃攪拌3小時(shí)至36小時(shí)。隨后，在真空下移除溶劑并將殘留物隨etoac一起粉碎。通過(guò)過(guò)濾收集所產(chǎn)生的無(wú)色沉淀物并且用冷etoac洗滌。這種沉淀物在不作任何進(jìn)一步純化的情況下用于下一個(gè)步驟中。通過(guò)lc-es/ms分析以[m-h]^-和/或[m+h]⁺時(shí)的離子證實(shí)化合物的結(jié)構(gòu)。

實(shí)施例1.h：二核苷酸環(huán)化的備選方案：

從實(shí)施例1.e或1.f中獲得的固體隨無(wú)水吡啶一起共蒸發(fā)3次。將殘留物懸浮于無(wú)水吡啶中，并且向所得溶液添加1-(均三甲苯-2-磺酰)-3-硝基-1,2,4-三唑(msnt)(5當(dāng)量)。將所產(chǎn)生的混合物在25℃攪拌3小時(shí)至18小時(shí)。隨后，在真空下移除溶劑，并且將所產(chǎn)生的產(chǎn)物在不作任何進(jìn)一步純化的情況下用于下一個(gè)步驟中。通過(guò)lc-es/ms分析以[m-h]^-和/或[m+h]⁺時(shí)的離子證實(shí)化合物的結(jié)構(gòu)。

實(shí)施例1.i：二核苷酸環(huán)化的備選方案：

將實(shí)施例1.d中獲得的固體或適當(dāng)保護(hù)的化合物隨無(wú)水吡啶一起共蒸發(fā)3次。將殘留物懸浮于無(wú)水吡啶中，并且向所得溶液添加5,5-二甲基-2-氧代-2-氯-1,3,2-二氧磷雜環(huán)己烷(dmocp)(3當(dāng)量)。將所產(chǎn)生的混合物在25℃攪拌3小時(shí)至18小時(shí)。

對(duì)于磷酸二酯鍵：

添加碘(1.3當(dāng)量)和水(30當(dāng)量)至混合物。在10分鐘后，直接添加nahso3(0.15％)水溶液直至觀察到完全褪色，并且隨后添加nahco3水溶液。將水層用etoac/et2o的1:1(v/v)混合物提取3次。將有機(jī)層匯集，在mgso4上干燥，過(guò)濾并且隨后在真空下濃縮。

對(duì)于硫代磷酸酯三酯鍵：

添加元素硫(5當(dāng)量)。將混合物在室溫?cái)嚢?5分鐘。隨后將混合物在真空下濃縮并且隨甲苯一起共蒸發(fā)3次，在acn中沉淀以移除過(guò)量硫并濃縮至干燥。

殘留物在不作任何進(jìn)一步純化的情況下用于下一個(gè)步驟中。通過(guò)lc-es/ms分析以[m-h]^-和/或[m+h]⁺時(shí)的離子證實(shí)化合物的結(jié)構(gòu)。

實(shí)施例1.j：環(huán)狀二核苷酸去保護(hù)和純化的方案：

將實(shí)施例1.g、1.h或1.i的受保護(hù)環(huán)狀二核苷酸用etoh中的甲胺溶液(33％)處理，并且將所產(chǎn)生的混合物在50℃攪拌4小時(shí)。將反應(yīng)混合物濃縮，并且將所產(chǎn)生的殘留物真空干燥。將干燥的材料與et3n·3hf(25當(dāng)量)混合并且在25℃攪拌6小時(shí)。向這種混合物添加1m甲酸銨緩沖溶液，并且將混合物在30℃至40℃劇烈攪拌10分鐘。將所得到的沉淀物過(guò)濾，并且使用c18sunfire柱(19x150mm，5μm)和甲酸銨/acn作為洗脫液，對(duì)濾液進(jìn)行制備性hplc。將含有所需化合物的級(jí)分匯總并凍干。通過(guò)lc-es/ms分析以[m-h]^-和/或[m+h]⁺時(shí)的離子證實(shí)化合物的結(jié)構(gòu)。

實(shí)施例1.k：環(huán)狀二核苷酸去保護(hù)和純化的方案：

將實(shí)施例1.g、1.h或1.i的受保護(hù)環(huán)狀二核苷酸用etoh中的甲胺溶液(33％)處理，并且將所產(chǎn)生的混合物在50℃攪拌4小時(shí)。將反應(yīng)混合物濃縮，并且使用c18sunfire柱(19x150mm，5μm)和甲酸銨/acn作為洗脫液，對(duì)所產(chǎn)生的殘留物進(jìn)行制備性hplc。將含有所需化合物的級(jí)分匯總并凍干。通過(guò)lc-es/ms分析以[m-h]^-和/或[m+h]⁺時(shí)的離子證實(shí)化合物的結(jié)構(gòu)。

使用與實(shí)施例1.b中所述相似的程序，從市售的腺苷磷酰亞胺制備中間體1，以提供6.20g(93％產(chǎn)率)中間體1。lc-ms：rt＝4.41分鐘，m/z＝550[m+h]⁺，m/z＝548[m-h]^-。

使用與實(shí)施例1.d中所述相似的程序，從中間體1和市售的肌苷磷酰亞胺制備中間體2，以提供8.04g(68％產(chǎn)率)中間體2。lc-ms：rt＝5.22分鐘，m/z＝1048[m+h]⁺，m/z＝1046[m-h]^-。

使用與實(shí)施例1.i中所述相似的程序，從中間體2制備中間體3，以提供8.04g(68％產(chǎn)率)中間體3。lc-ms：rt＝5.41分鐘，m/z＝1046[m+h]⁺，m/z＝1044[m-h]^-。

向在無(wú)水吡啶(200ml)中的肌苷(10.0g，37.2mmol)溶液添加tipscl2(14.1g，44.7mmol)。將溶液在室溫?cái)嚢?8小時(shí)。隨后，通過(guò)添加meoh(50ml)猝滅反應(yīng)并且在真空下移除溶劑。將殘余物溶解于etoac中并且用飽和nahco3水溶液、水和鹽水洗滌。將有機(jī)層在mgso4上干燥，過(guò)濾并且隨后在真空下濃縮。使用dcm/meoh作為洗脫液，通過(guò)硅膠柱色譜純化粗制化合物，以產(chǎn)生13.5g(70％產(chǎn)率)中間體4。lc-ms：rt＝5.32分鐘，m/z＝511[m+h]⁺，m/z＝509[m-h]^-。¹hnmr(cdcl3-d1,300mhz)δ(ppm)13.04(s,1h),8.10(s,1h),8.03(s,1h),5.99(s,1h),4.93(t,1h),4.50(d,1h),4.11(m,3h),1.83(m,4h),1.09(m,32h)。

向中間體4(5g，9.79mmol)在無(wú)水dcm(75ml)中的溶液添加3,4-二氫-2h-吡喃(24.7g，293.7mmol)和ppts(7.38g，29.37mmol)。將溶液在室溫?cái)嚢?8小時(shí)。隨后，通過(guò)飽和nahco3溶液猝滅反應(yīng)。分離不同的層，并且將有機(jī)層用水和鹽水洗滌，在mgso4上干燥，過(guò)濾并且隨后在真空下濃縮。使用dcm/meoh作為洗脫液，通過(guò)硅膠柱色譜純化粗制化合物，以產(chǎn)生4.71g(80％產(chǎn)率)中間體5。lc-ms：rt＝6.72分鐘，m/z＝595[m+h]⁺，m/z＝593[m-h]^-。¹hnmr(cdcl3-d1,300mhz)δ(ppm)12.89(d,1h),8.12(s,1h),8.09(s,1h),8.04(d,1h),6.05(d,1h),5.07(t,1h),4.76(m,1h),4.53(m,2h),4.40-4.05(m,5h),1.85-1.55(m,10h),1.04(m,32h)。

向中間體5(4.71g，7.92mmol)在thf(100ml)中的溶液添加硅膠上的tbaf(10.56g，15.84mmol)。將溶液在室溫?cái)嚢?小時(shí)。隨后，過(guò)濾反應(yīng)，用thf洗滌硅膠，并且在真空下濃縮濾液。使用dcm/meoh作為洗脫液，通過(guò)硅膠柱色譜純化粗制化合物，以產(chǎn)生2.7g(96％產(chǎn)率)中間體6。lc-ms：rt＝4.32分鐘，m/z＝353[m+h]⁺，m/z＝351[m-h]^-。

向中間體6(2.70g，7.66mmol)在無(wú)水吡啶(40ml)中的溶液逐滴添加dmtrcl(2.17g，6.42mmol)在dcm(5ml)中的溶液。將溶液置于室溫2小時(shí)。隨后，通過(guò)添加5％nahco3水溶液(110ml)猝滅反應(yīng)，將水層用dcm提取3次。將有機(jī)層匯集并在mgso4上干燥，過(guò)濾并且隨后在真空下濃縮。使用dcm/meoh中的1％吡啶作為洗脫液，通過(guò)硅膠柱色譜純化殘余物，以產(chǎn)生4.78g(95％產(chǎn)率)中間體7。lc-ms：rt＝6.80分鐘，m/z＝655[m+h]⁺，m/z＝653[m-h]^-。¹hnmr(cdcl3-d1,300mhz)δ(ppm)12.80(s,1h),8.02(s,1h),8.00(s,1h),7.71(m,2h),7.73(m,2h),7.24(m,9h),6.20(d,1h),5.07(t,1h),4.83(m,1h),4.35(m,2h),3.78(s,6h),3.45-3.30(m,4h),1.77-1.56(m,6h)。

向中間體7(4.78g，7.30mmol)在無(wú)水吡啶(40ml)中的溶液添加咪唑(1.29g，18.98mmol)和tbdmscl(1.43g，9.49mmol)，將反應(yīng)在室溫?cái)嚢?8小時(shí)。隨后，用dcm(100ml)稀釋反應(yīng)，用飽和nahco3水溶液、水和鹽水洗滌溶液。將有機(jī)層在mgso4上干燥，過(guò)濾并且隨后在真空下濃縮。使用dcm/meoh中的1％吡啶作為洗脫液，通過(guò)硅膠柱色譜純化殘余物，以產(chǎn)生5.12g(91％產(chǎn)率)中間體8。lc-ms：rt＝8.15分鐘，m/z＝769[m+h]⁺，m/z＝767[m-h]^-。1hnmr(cdcl3-d1,300mhz)δ(ppm)12.70(s,1h),8.02(s,1h),7.97(s,1h),7.40(m,2h),7.26(m,11h),6.09(d,1h),4.80(m,1h),4.36(m,1h),4.16(m,2h),3.72(s,6h),3.45-3.26(m,4h),1.61-1.37(m,8h),0.81(s,9h),0.09(dd,6h)。

將中間體8(4.93g，6.41mmol)溶解于znbr2(0.5m)在dcm/iproh(1/1)(40ml，19.3mmol)中的溶液中。將溶液在室溫?cái)嚢?0分鐘。用1nnahco3溶液中和反應(yīng)。分離不同的層，并且將有機(jī)層用水和鹽水洗滌，在mgso4上干燥，過(guò)濾并且隨后在真空下濃縮。使用dcm/meoh作為洗脫液，通過(guò)硅膠柱色譜純化殘留物，以產(chǎn)生2.68g(90％產(chǎn)率)中間體9。lc-ms：rt＝6.22分鐘，m/z＝467[m+h]⁺，m/z＝465[m-h]^-。

使用與實(shí)施例1.c中所述相似的程序，從中間體9和市售的腺苷磷酰亞胺制備中間體10，以產(chǎn)生1.9g(64％產(chǎn)率)中間體10。rt＝6.99分鐘，m/z＝1068[m+h]⁺，m/z＝1066[m-h]^-。

向中間體10(1.9g，1.78mmol)在無(wú)水吡啶(20ml)中的溶液添加二苯基亞磷酸酯(1.25g，5.34mmol)。將反應(yīng)在室溫?cái)嚢?小時(shí)。向反應(yīng)添加0.1mteaa溶液(53ml，5.34mmol)。將反應(yīng)在室溫?cái)嚢?5分鐘。隨后，在真空下移除溶劑并將殘留物溶解于dcm(100ml)中。將有機(jī)層用nahco3(5％)水溶液，水和鹽水洗滌，在mgso4上干燥，過(guò)濾并且隨后在真空下濃縮，以產(chǎn)生2.0g(99％產(chǎn)率)粗制中間體11。這種中間體在不作任何進(jìn)一步純化的情況下用于下一個(gè)步驟中。lc-ms：rt＝6.06分鐘，m/z＝1132[m+h]⁺，m/z＝1130[m-h]^-。

將中間體11(2.0g，2.12mmol)用dca10％在dcm(50ml)中的溶液處理。將反應(yīng)在室溫?cái)嚢?小時(shí)。隨后，通過(guò)添加吡啶(17ml)中和反應(yīng)。在真空下移除溶劑以產(chǎn)生2.2g(100％產(chǎn)率)粗制中間體12。這種中間體在不作任何進(jìn)一步純化的情況下用于下一個(gè)步驟中。lc-ms：rt＝7.38分鐘，m/z＝1048[m+h]⁺，m/z＝1046[m-h]^-。

使用與實(shí)施例1.i中所述相似的程序，從中間體12制備中間體13，以提供1.73g(83％產(chǎn)率)中間體13。lc-ms：rt＝7.20分鐘，m/z＝1046[m+h]⁺，m/z＝1044[m-h]^-。

使用與實(shí)施例1.c中所述相似的程序，從中間體9和市售的腺苷磷酰亞胺制備中間體14，以提供1.9g(60％產(chǎn)率)中間體14。rt＝7.08分鐘，m/z＝1068[m+h]⁺，m/z＝1066[m-h]^-。

向中間體14(1.9g，1.78mmol)在無(wú)水吡啶(20ml)中的溶液添加二苯基亞磷酸酯(1.25g，5.34mmol)。將反應(yīng)在室溫?cái)嚢?小時(shí)。向反應(yīng)添加0.1mteaa溶液(53ml，5.34mmol)。將反應(yīng)在室溫?cái)嚢?5分鐘。隨后，在真空下移除溶劑并將殘留物溶解于dcm(100ml)中。將有機(jī)層用nahco3(5％)水溶液，水和鹽水洗滌，在mgso4上干燥，過(guò)濾并且隨后在真空下濃縮，以產(chǎn)生2.0g(99％產(chǎn)率)粗制中間體15。這種中間體在不作任何進(jìn)一步純化的情況下用于下一個(gè)步驟中。lc-ms：rt＝6.11分鐘，m/z＝1132[m+h]⁺，m/z＝1130[m-h]^-。

將中間體15(2.0g，1.76mmol)用dca10％在dcm(50ml，85.0mmol)中的溶液處理。將反應(yīng)在室溫?cái)嚢?小時(shí)。隨后，通過(guò)添加吡啶(17ml，177.0mmol)中和反應(yīng)。在真空下移除溶劑以產(chǎn)生1.8g(100％產(chǎn)率)粗制中間體16。這種中間體在不作任何進(jìn)一步純化的情況下用于下一個(gè)步驟中。lc-ms：rt＝5.39分鐘，m/z＝1048[m+h]⁺，m/z＝1046[m-h]^-。

使用與實(shí)施例1.i中所述相似的程序，從中間體16制備中間體17，以提供1.5g(75％產(chǎn)率)中間體17。lc-ms：rt＝5.41分鐘，m/z＝1046[m+h]⁺，m/z＝1044[m-h]^-。

使用與實(shí)施例1.b中所述相似的程序，從市售的腺苷磷酰亞胺制備中間體18，以提供1.1g(94％產(chǎn)率)中間體18。lc-ms：rt＝4.47分鐘，m/z＝550[m+h]⁺，m/z＝548[m-h]^-。

使用與實(shí)施例1.d中所述相似的程序，從中間體18和市售的肌苷磷酰亞胺制備中間體19，以提供410mg(44％產(chǎn)率)中間體19。rt＝4.70分鐘，m/z＝1048[m+h]⁺，m/z＝1046[m-h]^-。

使用與實(shí)施例1.i中所述相似的程序，從中間體19制備中間體20，以提供364mg(89％產(chǎn)率)中間體20。lc-ms：rt＝5.66分鐘，m/z＝1046[m+h]⁺，m/z＝1044[m-h]^-。

使用與實(shí)施例1.d中所述相似的程序，從中間體1和市售的肌苷磷酰亞胺制備中間體21，以提供1.05g(65％產(chǎn)率)中間體21。lc-ms：rt＝5.42和5.52分鐘，m/z＝1064[m+h]⁺，m/z＝1062[m-h]^-。

使用與實(shí)施例1.i中所述相似的程序，從中間體21制備中間體22，以提供579mg(55％產(chǎn)率)中間體22。lc-ms：rt＝5.61和5.71分鐘，m/z＝1078[m+h]⁺，m/z＝1076[m-h]^-。

使用與實(shí)施例1.a中所述相似的程序，從市售的2’-脫氧腺苷磷酰亞胺制備中間體23，以提供1.84g(95％產(chǎn)率)中間體23。lc-ms：rt＝4.31分鐘，m/z＝529[m+h]⁺，m/z＝527[m-h]^-。

使用與實(shí)施例1.c中所述相似的程序，從中間體23和市售的2'-脫氧肌苷磷酰亞胺制備中間體24，以提供500mg(32％產(chǎn)率)中間體24。rt＝5.28分鐘，m/z＝896[m+h]+，m/z＝894[m-h]-。

使用與實(shí)施例1.e中所述相似的程序，從中間體24制備中間體25，以提供390mg(83％產(chǎn)率)中間體25。lc-ms：rt＝3.35分鐘，m/z＝856[m+h]⁺，m/z＝854[m-h]^-。

使用與實(shí)施例1.g中所述相似的程序，從中間體25制備中間體26，以提供0.38g(99％產(chǎn)率)中間體26。lc-ms：rt＝3.91分鐘，m/z＝838[m+h]⁺，m/z＝836[m-h]^-。

使用與實(shí)施例1.c中所述相似的程序，從中間體23和市售的2’-脫氧-2’-氟肌苷磷酰亞胺制備中間體27，以提供3.16g(62％產(chǎn)率)中間體27。rt＝4.27分鐘，m/z＝914[m+h]⁺，m/z＝912[m-h]^-。

使用與實(shí)施例1.e中所述相似的程序，從中間體27制備中間體28，以提供1.10g(69％產(chǎn)率)中間體28。lc-ms：rt＝3.52分鐘，m/z＝874[m+h]⁺，m/z＝872[m-h]^-。

使用與實(shí)施例1.h中所述相似的程序，從中間體28制備中間體29，以提供1.01g(99％產(chǎn)率)中間體29。lc-ms：rt＝4.23和4.07分鐘，m/z＝856[m+h]⁺，m/z＝854[m-h]^-。

使用與實(shí)施例1.a中所述相似的程序，從市售的2'-脫氧-2'-氟腺苷磷酰亞胺制備中間體30，以提供2.68g(85％產(chǎn)率)中間體30。lc-ms：rt＝4.50分鐘，m/z＝547[m+h]⁺，m/z＝545[m-h]^-。

使用與實(shí)施例1.c中所述相似的程序，從中間體30和商業(yè)的2’-脫氧-2’-氟肌苷磷酰亞胺制備中間體31，以提供2.53g(55％產(chǎn)率)中間體31。rt＝4.39分鐘，m/z＝932[m+h]⁺，m/z＝930[m-h]^-。

使用與實(shí)施例1.e中所述相似的程序，從中間體31制備中間體32，以提供4.4g(92％產(chǎn)率)中間體32。lc-ms：rt＝3.58和3.59分鐘，m/z＝892[m+h]⁺，m/z＝891[m-h]^-。

使用與實(shí)施例1.g中所述相似的程序，從中間體32制備中間體33，以提供1.40g(99％產(chǎn)率)中間體33。lc-ms：rt＝4.21和4.42分鐘，m/z＝874[m+h]⁺，m/z＝872[m-h]^-。

使用與實(shí)施例1.a中所述相似的程序，從市售的2'-脫氧-2'-氟腺苷磷酰亞胺制備中間體34，以提供647mg(55％產(chǎn)率)中間體34。lc-ms：rt＝5.06分鐘，m/z＝563[m+h]⁺，m/z＝561[m-h]^-。

使用與實(shí)施例1.c中所述相似的程序，從中間體34和市售的2’-脫氧-2’-氟肌苷磷酰亞胺制備中間體35，以提供447mg(35％產(chǎn)率)中間體35。rt＝6.20分鐘，m/z＝964[m+h]⁺，m/z＝962[m-h]^-。

使用與實(shí)施例1.e中所述相似的程序，從中間體35制備中間體36，以提供232mg(43％產(chǎn)率)中間體36。lc-ms：rt＝4.25和4.55分鐘，m/z＝924[m+h]⁺，m/z＝922[m-h]^-。

使用與實(shí)施例1.g中所述相似的程序，從中間體36制備中間體37，以提供35mg(36％產(chǎn)率)中間體37。lc-ms：rt＝5.00和5.32分鐘，m/z＝906[m+h]⁺，m/z＝904[m-h]^-。

使用與實(shí)施例1.b中所述相似的程序，從市售的腺苷2’-磷酰亞胺制備中間體38，以提供1.81g(95％產(chǎn)率)中間體38。lc-ms：rt＝4.53分鐘，m/z＝550[m+h]⁺，m/z＝548[m-h]^-。

使用與實(shí)施例1.d中所述相似的程序，從中間體38和市售的2’-脫氧-2’-氟肌苷磷酰亞胺制備中間體39，以提供340mg(55％產(chǎn)率)中間體39。rt＝4.28分鐘，m/z＝935[m+h]⁺，m/z＝933[m-h]^-。

使用與實(shí)施例1.i中所述相似的程序，從中間體39制備中間體40，以提供340mg(95％產(chǎn)率)中間體40。lc-ms：rt＝4.44分鐘，m/z＝933[m+h]⁺，m/z＝931[m-h]^-。

使用與實(shí)施例1.a中所述相似的程序，從市售的2’-脫氧-2’-氟肌苷磷酰亞胺制備中間體41，以提供600mg(98％產(chǎn)率)中間體41。lc-ms：rt＝3.78分鐘，m/z＝444[m+h]⁺，m/z＝442[m-h]^-。

使用與實(shí)施例1.c中所述相似的程序，從中間體41和市售的2’-脫氧-2’-氟肌苷磷酰亞胺制備中間體42，以提供610mg(55％產(chǎn)率)中間體42。rt＝5.50分鐘，m/z＝829[m+h]⁺，m/z＝827[m-h]^-。

使用與實(shí)施例1.f中所述相似的程序，從中間體42制備中間體43，以提供580mg(90％產(chǎn)率)中間體43。lc-ms：rt＝3.40分鐘，m/z＝789[m+h]⁺，m/z＝787[m-h]^-。

使用與實(shí)施例1.h中所述相似的程序，從中間體43制備中間體44，以提供500mg(99％產(chǎn)率)中間體44。lc-ms：rt＝3.86分鐘，m/z＝771[m+h]⁺，m/z＝769[m-h]^-。

使用與實(shí)施例1.a中所述相似的程序，從市售的2’-脫氧-2’-氟鳥苷磷酰亞胺制備中間體45，以提供3.75g(60％產(chǎn)率)中間體45。lc-ms：rt＝4.25分鐘，m/z＝529[m+h]⁺，m/z＝527[m-h]^-。

使用與實(shí)施例1.c中所述相似的程序，從中間體45和市售的2’-脫氧-2’-氟鳥苷磷酰亞胺制備中間體46，以提供1.07g(67％產(chǎn)率)中間體46。rt＝4.80分鐘，m/z＝999[m+h]⁺，m/z＝997[m-h]^-。

使用與實(shí)施例1.f中所述相似的程序，從中間體46制備中間體47，以提供610mg(99％產(chǎn)率)中間體47。lc-ms：rt＝4.05分鐘，m/z＝959[m+h]⁺，m/z＝957[m-h]^-。

使用與實(shí)施例1.h中所述相似的程序，從中間體47制備中間體48，以提供580mg(96％產(chǎn)率)中間體48。lc-ms：rt＝4.77分鐘，m/z＝941[m+h]⁺，m/z＝939[m-h]^-。

使用與實(shí)施例1.c中所述相似的程序，從中間體45和市售的2'-脫氧-2'-氟腺苷磷酰亞胺制備中間體49，以提供4.96g(68％產(chǎn)率)中間體49。rt＝4.98分鐘，m/z＝1017[m+h]⁺，m/z＝1015[m-h]^-。

使用與實(shí)施例1.e中所述相似的程序，從中間體47制備中間體50，以提供4.4g(92％產(chǎn)率)中間體50。lc-ms：rt＝4.36分鐘，m/z＝977[m+h]⁺，m/z＝975[m-h]^-。

使用與實(shí)施例1.g中所述相似的程序，從中間體50制備中間體51，以提供4.30g(99％產(chǎn)率)中間體51。lc-ms：rt＝5.72分鐘，m/z＝838[m+h]⁺，m/z＝836[m-h]^-。

使用與實(shí)施例1.a中所述相似的程序，從市售的2’-脫氧-2’-氟鳥苷磷酰亞胺制備中間體52，以提供632mg(50％產(chǎn)率)中間體52。lc-ms：rt＝5.86分鐘，m/z＝545[m+h]⁺，m/z＝543[m-h]^-。

使用與實(shí)施例1.c中所述相似的程序，從中間體52和市售的2'-脫氧-2'-氟腺苷磷酰亞胺制備中間體53，以提供310mg(25％產(chǎn)率)中間體53。rt＝6.60分鐘，m/z＝1049[m+h]⁺，m/z＝1047[m-h]^-。

使用與實(shí)施例1.e中所述相似的程序，從中間體53制備中間體54，以提供100mg(33％產(chǎn)率)中間體54。lc-ms：rt＝4.58和4.70分鐘，m/z＝1009[m+h]⁺，m/z＝1007[m-h]^-。

使用與實(shí)施例1.g中所述相似的程序，從中間體54制備中間體55，以提供75mg(76％產(chǎn)率)中間體55。lc-ms：rt＝5.32和5.54分鐘，m/z＝991[m+h]⁺，m/z＝989[m-h]^-。

中間體56：特戊酸碘甲酯

將特戊酸氯甲酯(1.0g，6.64mmol)在無(wú)水a(chǎn)cn(15ml)中的溶液用碘化鈉(1.9g，13.28mmol)處理。將混合物在室溫在黑暗下攪拌過(guò)夜。隨后在真空下移除溶劑并將殘留物溶解于dcm中。將溶液用水、5％nahso3溶液和鹽水洗滌。將有機(jī)層在mgso4上干燥，過(guò)濾并且在真空下濃縮以提供1.22g粗制中間體53，所述中間體在不作任何進(jìn)一步純化的情況下用于下一個(gè)步驟中。¹hnmr(cdcl3-d1,300mhz)δ(ppm)5.86(s,2h),1.12(s,9h)。

使用與實(shí)施例1.j中所述相似的程序，從中間體3制備實(shí)施例1.1，以提供2.4g(60％產(chǎn)率)實(shí)施例1.1。lc-ms：rt＝2.72分鐘，m/z＝660[m+h]⁺，m/z＝658[m-h]^-。¹hnmr(d2o,300mhz)δ(ppm)8.34(s,1h),8.27(s,1h),8.10(s,1h),7.86(s,1h),5.94(s,2h),5.06-4.80(m,4h),4.42(m,4h),4.03(m,2h)。

使用與實(shí)施例1.j中所述相似的程序，從中間體13制備實(shí)施例1.2，以提供22.5mg(21％產(chǎn)率)實(shí)施例1.2。lc-ms：rt＝2.46分鐘，m/z＝660[m+h]⁺，m/z＝658[m-h]^-。¹hnmr(d2o,300mhz)δ(ppm)8.27(s,1h),8.15(s,1h),8.04(s,1h),7.88(s,1h),5.99(s,2h),4.95(m,2h),4.86(m,1h),4.42(m,4h),4.05(m,2h)。

使用與實(shí)施例1.j中所述相似的程序，從中間體17制備實(shí)施例1.3，以提供17.5mg(22％產(chǎn)率)實(shí)施例1.3。lc-ms：rt＝1.35分鐘，m/z＝660[m+h]⁺，m/z＝658[m-h]^-。¹hnmr(d2o,300mhz)δ(ppm)8.44(s,1h),8.13(s,1h),8.08(s,1h),8.07(s,1h),6.20(d,1h),6.07(d,1h),5.22(m,1h),4.91(m,1h),4.79(m,2h),4.63(m,1h),4.56(m,1h),4.22(m,2h),4.07(m,2h)。

使用與實(shí)施例1.j中所述相似的程序，從中間體20制備實(shí)施例1.4，以提供50mg(19％產(chǎn)率)實(shí)施例1.4。lc-ms：rt＝1.53分鐘，m/z＝660[m+h]⁺，m/z＝658[m-h]^-。¹hnmr(d2o,300mhz)δ(ppm)8.50(s,1h),8.14(s,1h),8.13(s,1h),8.09(s,1h),6.24(d,1h),6.08(s,1h),5.20(m,1h),4.83-4.73(m,2h),4.58(d,1h),4.40(m,2h),4.26(m,2h),4.04(m,2h)。

使用與實(shí)施例1.j中所述相似的程序，從中間體22制備實(shí)施例1.5，以提供7mg(20％產(chǎn)率)實(shí)施例1.5。lc-ms：rt＝3.45分鐘，m/z＝692[m+h]⁺，m/z＝690[m-h]^-。¹hnmr(d2o,300mhz)δ(ppm)8.54(s,1h),8.37(s,1h),8.22(s,1h),7.97(s,1h),6.65(dd,1h),6.15(dd,1h),4.60-4.50(m,4h),4.45(m,4h),4.05(m,2h)。

使用與實(shí)施例1.k中所述相似的程序，從中間體26制備實(shí)施例1.6，以提供90mg(31％產(chǎn)率)實(shí)施例1.6。lc-ms：rt＝2.47分鐘，m/z＝628[m+h]⁺，m/z＝626[m-h]^-。¹hnmr(dmso-d6,300mhz)δ(ppm)8.37(s,1h),8.32(s,1h),8.13(s,1h),8.05(s,1h),7.26(sl,2h),6.28(m,2h),4.68(m,2h),4.08(m,2h),3.85(m,2h),2.83(m,2h)。

使用與實(shí)施例1.k中所述相似的程序，從中間體29制備實(shí)施例1.7，以提供40mg(21％產(chǎn)率)實(shí)施例1.7。lc-ms：rt＝1.97分鐘，m/z＝646[m+h]⁺，m/z＝644[m-h]^-。¹hnmr(d2o,300mhz)δ(ppm)8.29(s,1h),8.12(s,1h),7.98(s,1h),7.88(s,1h),6.25(m,2h),5.54(m,1h),5.07(m,2h),4.37(m,4h),4.06(m,2h)。

使用與實(shí)施例1.k中所述相似的程序，從中間體33制備實(shí)施例1.8，以提供104mg(10％產(chǎn)率)實(shí)施例1.8。lc-ms：rt＝2.78分鐘，m/z＝664[m+h]⁺，m/z＝662[m-h]^-。¹hnmr(d2o,300mhz)δ(ppm)8.37(s,1h),8.35(s,1h),8.14(s,1h),7.95(s,1h),6.23(m,2h),5.45(m,2h),5.39(m,1h),4.95(m,2h),4.50(m,2h),4.06(m,2h)。

使用與實(shí)施例1.k中所述相似的程序，從中間體37制備實(shí)施例1.9，以提供10mg(18％產(chǎn)率)實(shí)施例1.9。lc-ms：rt＝3.41分鐘，m/z＝696[m+h]⁺，m/z＝694[m-h]^-。¹hnmr(d2o,300mhz)δ(ppm)8.55(s,1h),8.38(s,1h),8.20(s,1h),7.99(s,1h),6.63(dd,1h),6.15(dd,1h),5.16-4.95(m,4h),4.52(m,4h),4.07(m,2h)。

使用與實(shí)施例1.j中所述相似的程序，從中間體40制備實(shí)施例1.10，以提供50mg(19％產(chǎn)率)實(shí)施例1.10。lc-ms：rt＝2.25分鐘，m/z＝662[m+h]⁺，m/z＝660[m-h]^-。¹hnmr(d2o,300mhz)δ(ppm)8.58(s,1h),8.35(s,1h),8.12(s,1h),7.97(s,1h),6.65(d,1h),6.16(d,1h),4.50(m,2h),5.15(m,2h),4.41(m,4h),4.02(m,1h),3.73(m,1h)。

使用與實(shí)施例1.k中所述相似的程序，從中間體44制備實(shí)施例1.11，以提供157mg(35％產(chǎn)率)實(shí)施例1.11。lc-ms：rt＝1.48分鐘，m/z＝665[m+h]⁺，m/z＝663[m-h]^-。¹hnmr(d2o,300mhz)δ(ppm)8.34(s,2h),8.08(s,2h),7.85(s,2h),6.21(m,2h),5.66(m,1h),5.49(m,1h),5.20(m,2h),4.97(m,4h),4.06(m,2h)。

使用與實(shí)施例1.k中所述相似的程序，從中間體48制備實(shí)施例1.12，以提供15mg(5％產(chǎn)率)實(shí)施例1.12。lc-ms：rt＝1.58分鐘，m/z＝695[m+h]⁺，m/z＝693[m-h]^-.1hnmr(d2o,300mhz)δ(ppm)8.70(s,2h),6.05(d,2h),5.06-4.05(m,8h),4.08(m,2h)。

使用與實(shí)施例1.k中所述相似的程序，從中間體51制備實(shí)施例1.13，以提供320mg(31％產(chǎn)率)實(shí)施例1.13。lc-ms：rt＝2.48分鐘，m/z＝679[m+h]⁺，m/z＝677[m-h]^-。¹hnmr(d2o,300mhz)δ(ppm)8.17(s,1h),7.83(s,1h),7.63(s,1h),6.09(d,1h),5.94(d,1h),5.62(m,1h),5.50(m,1h),5.15(m,2h),4.42(m,4h),4.03(m,2h)。

使用與實(shí)施例1.k中所述相似的程序，從中間體55制備實(shí)施例1.14，以提供15mg(28％產(chǎn)率)實(shí)施例1.14。lc-ms：rt＝2.66分鐘，m/z＝711[m+h]⁺，m/z＝709[m-h]^-。¹hnmr(d2o,300mhz)δ(ppm)8.58(s,1h),8.35(s,1h),7.97(s,1h),6.65(d,1h),6.19(d,1h),4.94(d,1h),4.62-4.50(m,4h),4.42(m,4h),4.03(m,2h)。

向?qū)嵤├?.14(7mg，9.85μmol)在水(200μl)中的溶液逐滴添加中間體56(19mg，79.0μmol)在丙酮(500μl)中的溶液。將混合物在黑暗下攪拌過(guò)夜。隨后，將混合物用na2s2o3飽和溶液(15μl)中和并隨后用水(10ml)稀釋。水層用etoac(3x10ml)提取3次。將有機(jī)層匯集，在mgso4上干燥，過(guò)濾并且在真空下濃縮以提供4mg(45％產(chǎn)率)實(shí)施例1.15。lc-ms：rt＝4.11分鐘，m/z＝907[m+h]⁺，m/z＝905[m-h]^-。¹hnmr(dmso-d6,300mhz)δ(ppm)8.61(s,1h),8.37(s,1h),8.00(s,1h),6.70(d,1h),6.22(d,1h),4.70-4.50(m,4h),4.42(m,4h),4.03(m,2h),3.77(s,4h),1.20(s,18h)。

向?qū)嵤├?.9(5mg，7.19μmol)在水(200μl)中的溶液逐滴添加中間體56(17mg，70μmol)在丙酮(500μl)中的溶液。將混合物在黑暗下攪拌過(guò)夜。隨后，將混合物用na2s2o3飽和溶液(15μl)中和并隨后用水(10ml)稀釋。水層用etoac(3x10ml)提取3次。將有機(jī)層匯集，在mgso4上干燥，過(guò)濾并且在真空下濃縮以提供5mg(78％產(chǎn)率)實(shí)施例1.16。lc-ms：rt＝4.55分鐘，m/z＝892[m+h]⁺，m/z＝890[m-h]^-。¹hnmr(dmso-d6,300mhz)δ(ppm)8.61(s,1h),8.37(s,1h),8.00(s,1h),6.70(d,1h),6.22(d,1h),4.70-4.50(m,4h),4.42(m,4h),4.03(m,2h),3.77(s,4h),1.20(s,18h)。

實(shí)施例2：生物學(xué)測(cè)定法

我們已經(jīng)確定本發(fā)明的幾種環(huán)狀二核苷酸在人類或動(dòng)物細(xì)胞中誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生。具體而言，這些環(huán)狀二核苷酸誘導(dǎo)i型干擾素和/或促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。本文報(bào)告一組代表性的這些環(huán)狀二核苷酸的體外細(xì)胞因子誘導(dǎo)活性需要真核細(xì)胞受體干擾素基因刺激物(sting)的存在。

體外細(xì)胞因子誘導(dǎo)作用

已經(jīng)通過(guò)使用不同報(bào)告細(xì)胞系展示了本發(fā)明中公開的非氟化環(huán)狀二核苷酸對(duì)氟化環(huán)狀二核苷酸的細(xì)胞因子誘導(dǎo)活性。下文解釋細(xì)胞系和實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞系

全部細(xì)胞系均從invivogen獲得。本文描述它們并提供其相應(yīng)的invivogen目錄代碼。

thp1-dual^tm(invivogen目錄代碼：thpd-nfis)：通過(guò)穩(wěn)定整合兩個(gè)誘導(dǎo)型報(bào)道構(gòu)建體，從人單核細(xì)胞系thp-1衍生這些細(xì)胞。它們使得同時(shí)研究sting的兩個(gè)主要信號(hào)傳導(dǎo)途徑成為可能：通過(guò)監(jiān)測(cè)分泌型胚堿性磷酸酶(seap)活性研究nf-κb途徑；和通過(guò)評(píng)估分泌性螢光素酶(lucia)的活性研究irf途徑。

當(dāng)使用quanti-blue^tm(invivogen目錄代碼：rep-qb1)(在seap存在下變成紫/藍(lán)色的seap檢測(cè)試劑(通過(guò)測(cè)量620nm至655nm的光密度定量))和quanti-luc^tm(invivogen；目錄代碼：rep-qlc1)(測(cè)量螢光素酶表達(dá)以報(bào)告isg54表達(dá)(作為ifn-α/β產(chǎn)生的指示物)的發(fā)光酶測(cè)定法)時(shí)，在細(xì)胞培養(yǎng)上清液中可容易地測(cè)量?jī)煞N報(bào)道蛋白。

luciaisg細(xì)胞系：以下兩個(gè)細(xì)胞系各自在irf誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下表達(dá)分泌型螢光素酶(lucia)報(bào)道基因。這種復(fù)合啟動(dòng)子包含與人isg54基因的最小啟動(dòng)子融合的五個(gè)ifn-刺激反應(yīng)元件(isre)，所述最小啟動(dòng)子不響應(yīng)于nf-κb途徑或ap-1途徑的激活物。因此，這些細(xì)胞使得基于螢光素酶(lucia)活性監(jiān)測(cè)irf途徑成為可能。在本發(fā)明中，對(duì)irf途徑的監(jiān)測(cè)用來(lái)測(cè)量主題環(huán)狀二核苷酸的sting激動(dòng)劑活性。

1.raw-lucia^tmisg(invivogen目錄代碼：rawl-isg)：這些細(xì)胞從鼠raw264.7巨噬細(xì)胞細(xì)胞系產(chǎn)生。

2.raw-lucia^tmisg-ko-sting(invivogen目錄代碼：rawl-kostg)：通過(guò)sting基因的穩(wěn)定純合敲除，從raw-lucia^tmisg54細(xì)胞系(見上文)產(chǎn)生這些細(xì)胞。

b16blue^tmisg54細(xì)胞系：以下兩個(gè)細(xì)胞系各自在啟動(dòng)子下表達(dá)seap報(bào)道基因：i-isg54報(bào)道分子，其包含由多聚體isre增強(qiáng)的ifn誘導(dǎo)型isg54啟動(dòng)子。用干擾素或i型干擾素的或nf-κb途徑的誘導(dǎo)物刺激這些細(xì)胞，觸發(fā)i-isg54啟動(dòng)子的激活(和因此產(chǎn)生seap)或ifn-β最小啟動(dòng)子的激活(和因此產(chǎn)生tnf-α)?？梢允褂胵uanti-blue^tm(invivogen目錄代碼：rep-qb1)(在seap存在下變成紫/藍(lán)色的試劑)，通過(guò)測(cè)量620nm至655nm的光密度，輕易測(cè)定上清液中seap的水平。

1.b16-blue^tmisg(invivogen目錄代碼：bb-ifnabg)：這些細(xì)胞從鼠b16f1黑色素瘤細(xì)胞株系衍生。使用quanti-blue^tm測(cè)量這些細(xì)胞中i型干擾素的產(chǎn)生。

2.b16-blue^tmisg-ko-sting(invivogen目錄代碼：bb-kostg)：這些細(xì)胞通過(guò)sting基因的穩(wěn)定純合敲除，從b16-blue^tmisg細(xì)胞系(見上文)產(chǎn)生這些細(xì)胞。使用quanti-blue^tm測(cè)量這些細(xì)胞中i型干擾素的產(chǎn)生。

hek-blue^tm細(xì)胞系：以下三個(gè)細(xì)胞系也用于cdn的生物學(xué)評(píng)價(jià)。

1.hek-blue^tmifn-α/β-ko-sting：這些細(xì)胞從其中sting基因已經(jīng)失活的hek-blue^tmifn-α/β細(xì)胞(invivogen目錄代碼：hkb-ifnab)衍生。hek-blue^tmifn-α/β細(xì)胞能夠?qū)崿F(xiàn)通過(guò)監(jiān)測(cè)isgf3途徑活化檢測(cè)生物活性的人i型ifn。通過(guò)用人stat2基因和irf9基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞以獲得有完整活性的i型ifn信號(hào)傳導(dǎo)途徑，產(chǎn)生這些細(xì)胞。該途徑的其他基因(ifnar1、ifnar2、jak1、tyk2和stat1)天然地以足夠量表達(dá)。細(xì)胞進(jìn)一步用ifn-α/β誘導(dǎo)型isg54啟動(dòng)子控制下的seap報(bào)道基因轉(zhuǎn)染。用人ifn-α或ifn-β刺激hek-blue^tmifn-α/β細(xì)胞激活了jak/stat/isgf3途徑并隨后誘導(dǎo)seap的產(chǎn)生。使用quanti-blue^tm測(cè)量這些細(xì)胞中i型干擾素的產(chǎn)生。

2.hek-blue^tmil-1r(invivogen目錄代碼：hkb-il1r)：hek-blue^tmil-1r細(xì)胞設(shè)計(jì)成通過(guò)監(jiān)測(cè)nf-κb途徑和ap-1途徑活化檢測(cè)生物活性的人和鼠il-1β。另外，這些細(xì)胞檢測(cè)來(lái)自食蟹猴、犬和大鼠的生物活性il-1β。實(shí)際上，hek-blue^tmil-1r細(xì)胞可以檢測(cè)il-1α和il-1β，因?yàn)檫@些細(xì)胞因子與相同受體il-1r結(jié)合。這些細(xì)胞從其中阻斷tnf-α反應(yīng)的hek-blue^tmil-1β細(xì)胞衍生(invivogen目錄代碼：hkb-il1b)。因此，hek-blue^tmil-1r細(xì)胞特異性反應(yīng)于il-1。這些細(xì)胞內(nèi)源地表達(dá)人il-1受體并且用鼠il-1受體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，令其對(duì)人il-1β和鼠il-1β非常敏感。hek-blue^tmil-1r細(xì)胞表達(dá)在融合于5個(gè)nf-κb結(jié)合位點(diǎn)和5個(gè)ap-1結(jié)合位點(diǎn)的ifn-β最小啟動(dòng)子控制下的seap報(bào)道基因。il-1β與hek-blue^tmil-1r細(xì)胞表面上il-1r的結(jié)合觸發(fā)了導(dǎo)致nf-κb激活和seap后續(xù)產(chǎn)生的信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)。使用quanti-blue^tm測(cè)量這些細(xì)胞中il-1β的產(chǎn)生。

3.hek-blue^tmtnf-α(invivogen目錄代碼：hkb-tnfdmyd)：hek-blue^tmtnf-α細(xì)胞能夠?qū)崿F(xiàn)通過(guò)監(jiān)測(cè)nf-κb途徑活化而檢測(cè)生物活性的人和鼠tnf-α。通過(guò)用融合于5個(gè)nf-κb結(jié)合位點(diǎn)和5個(gè)ap-1結(jié)合位點(diǎn)的ifn-β最小啟動(dòng)子控制下的seap報(bào)道基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞，產(chǎn)生這些細(xì)胞。通過(guò)敲除myd88基因，進(jìn)一步使其不響應(yīng)于il-1β。用tnf-α刺激hek-blue^tmtnf-α細(xì)胞觸發(fā)了nf-κb誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的激活和seap的產(chǎn)生。使用quanti-blue^tm測(cè)量這些細(xì)胞中tnf-α的產(chǎn)生。

實(shí)驗(yàn)中il-6的定量

根據(jù)制造商的說(shuō)明(r&dsystems)使用酶聯(lián)免疫測(cè)定法(elisa)，定量白介素-6。

在細(xì)胞培養(yǎng)物中

在將不同細(xì)胞培養(yǎng)物分別與環(huán)狀二核苷酸孵育的多個(gè)實(shí)驗(yàn)，環(huán)狀二核苷酸誘導(dǎo)這些細(xì)胞中i型干擾素和/或促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，如通過(guò)isg54(干擾素刺激基因)報(bào)道分子測(cè)定法間接地測(cè)定(fensterl,white,yamashita和sen,2008)。這些實(shí)驗(yàn)如下文描述那樣進(jìn)行。

實(shí)施例2.1：測(cè)量處理的細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞因子誘導(dǎo)

·所用的細(xì)胞因子報(bào)告細(xì)胞系：thp1-dual^tm

·受檢的環(huán)狀二核苷酸：cl609、cl614、cl656、cl647、cl629、cl626、cl603、cl632和cl633

·參考化合物：c-aimp(invivogen制造)、c-digmp(invivogen目錄代碼：tlrl-cdg)、c-diimp(invivogen目錄代碼：tlrl-cdi)和c-gamp(invivogen目錄代碼：tlrl-cga)

·評(píng)價(jià)的活性：i型ifn誘導(dǎo)作用和nf-κb途徑誘導(dǎo)作用。

向平底96孔板的每個(gè)孔添加20μl環(huán)狀二核苷酸溶液(無(wú)菌水中100μg/ml)，隨后添加180μl單細(xì)胞株系懸液(thp1-dual^tm：大約100,000個(gè)細(xì)胞/孔)。將平板在37℃在5％co2下孵育18小時(shí)至24小時(shí)。使用根據(jù)制造商的說(shuō)明制備及使用的quanti-luc^tm間接定量ifn-α/β的水平。使用根據(jù)制造商的說(shuō)明制備及使用的quanti-blue^tm間接定量nf-κb活性。

圖2和圖3中顯示來(lái)自這個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，所述結(jié)果揭示三個(gè)重要發(fā)現(xiàn)：首先，全部受檢的環(huán)狀二核苷酸均在thp1-dual^tm細(xì)胞中誘導(dǎo)i型干擾素(圖2)；其次，它們?nèi)吭谶@些細(xì)胞中誘導(dǎo)nf-κb途徑(圖3)；并且最后，對(duì)于這兩種活性，大部分的氟化環(huán)狀二核苷酸比相應(yīng)的參考化合物(c-aimp、c-digmp、c-diimp和c-gamp)更有活性。

細(xì)胞因子誘導(dǎo)活性呈sting依賴性

本發(fā)明中公開的環(huán)狀二核苷酸在體外未在缺少受體sting的細(xì)胞上清液中誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生。

在野生型(wt)報(bào)告細(xì)胞和純合sting敲除(stingko)報(bào)告細(xì)胞各自與環(huán)狀二核苷酸獨(dú)立孵育18小時(shí)至24小時(shí)的實(shí)驗(yàn)中，環(huán)狀二核苷酸在wt細(xì)胞中誘導(dǎo)i型干擾素產(chǎn)生，但在stingko細(xì)胞中未誘導(dǎo)。這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)顯示，環(huán)狀二核苷酸在體外在細(xì)胞中的細(xì)胞因子誘導(dǎo)活性需要sting。這些實(shí)驗(yàn)如下文描述那樣進(jìn)行。

實(shí)施例2.2：在cdn處理的野生型細(xì)胞或sting敲除細(xì)胞中測(cè)量細(xì)胞因子誘導(dǎo)作用

·所用的細(xì)胞因子報(bào)告細(xì)胞系：b16-blue^tmisg和raw-lucia^tmisg

·受檢的環(huán)狀二核苷酸：cl609、cl614、cl656、cl647、cl629、cl626、cl603、cl632和cl633

·參考化合物：c-aimp(invivogen制造)、c-digmp(invivogen目錄代碼：tlrl-cdg)、c-diimp(invivogen目錄代碼：tlrl-cdi)和c-gamp(invivogen目錄代碼：tlrl-cga)

·所用的細(xì)胞系：raw-lucia^tmisg、raw-lucia^tmisg-ko-sting、b16-blue^tmisg和b16-blue^tmisg-ko-sting(取決于實(shí)驗(yàn))。

這些實(shí)驗(yàn)如實(shí)施例2.1中所述那樣進(jìn)行。

圖4和圖5中顯示來(lái)自這個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，所述結(jié)果揭示了三個(gè)重要發(fā)現(xiàn)。首先，每種受檢的環(huán)狀二核苷酸均在wtb16細(xì)胞(圖4)和wtraw細(xì)胞(圖5)中誘導(dǎo)i型干擾素產(chǎn)生。其次，這些化合物無(wú)一在sting敲除的b16細(xì)胞(圖4)或sting敲除的raw細(xì)胞(圖5)中顯示出這種活性，因而這表明，這種活性需要sting的存在。最后，大部分的氟化環(huán)狀二核苷酸比相應(yīng)的參考化合物(c-aimp、c-digmp、c-diimp和c-gamp)更有活性。

體內(nèi)細(xì)胞因子誘導(dǎo)作用

本發(fā)明中公開的環(huán)狀二核苷酸在體內(nèi)在小鼠中誘導(dǎo)細(xì)胞因子。

實(shí)施例2.3：在cdn處理的小鼠中測(cè)量細(xì)胞因子誘導(dǎo)作用

·評(píng)價(jià)的物種：小鼠

·受檢的環(huán)狀二核苷酸：cl604、cl606、cl609、cl611和cl614

·參考化合物：c-aimp和鹽水。

·評(píng)價(jià)的細(xì)胞因子：ifn-α/β(使用rawisg54報(bào)告細(xì)胞)和il-6(依據(jù)elisa)。

將21只小鼠(swiss；雌性；平均年齡：8周)分成7個(gè)組，每組三只：一個(gè)組充當(dāng)對(duì)照(鹽水)并且其他六個(gè)組各自用環(huán)狀二核苷酸(或者c-aimp、cl604、cl606、cl609、cl611或cl614)處理。在第7天，從全部小鼠采集基礎(chǔ)細(xì)胞因子水平的血液樣品并且貯存在-20℃直至分析。在第1天，通過(guò)靜脈內(nèi)(i.v.)注射，用200μl生理血清(含有0.9％nacl)或200μl環(huán)狀二核苷酸(劑量：10mg/kg)在生理血清(含有0.9％nacl)中的溶液處理小鼠。在注射后4小時(shí)從小鼠采集血液樣品并且隨后貯存在-20℃直至分析。在來(lái)自血液樣品的血清中測(cè)量細(xì)胞因子誘導(dǎo)作用。

圖6和圖7中顯示來(lái)自這個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，所述結(jié)果揭示了兩個(gè)重要發(fā)現(xiàn)：首先，在所示的劑量，在處理后4小時(shí)范圍內(nèi)，全部受檢的環(huán)狀二核苷酸(cl611例外)均在小鼠中強(qiáng)烈地誘導(dǎo)i型干擾素(圖6)；并且其次，全部環(huán)狀二核苷酸(cl611例外)均誘導(dǎo)il-6(圖7)。

實(shí)施例2.4：測(cè)量cdn在小鼠中的體內(nèi)消除

我們已經(jīng)測(cè)量了本發(fā)明的代表性環(huán)狀二核苷酸在小鼠中的體內(nèi)消除。

·受檢的環(huán)狀二核苷酸：cl603、cl609、cl614、cl626和cl656

·參考化合物：c-aimp(invivogen制造)。

將30只小鼠(c57bl/6)分成六個(gè)組，每組5只。在每個(gè)組內(nèi)部，用不同的環(huán)狀二核苷酸(50mg/kg；靜脈內(nèi)推注)處理每只小鼠。每個(gè)組的小鼠在處理后的不同時(shí)間點(diǎn)處死：2分鐘、5分鐘、15分鐘、30分鐘或1小時(shí)。緊鄰處死前，采集血液樣品(500μl)。將血液樣品采集于肝素管中，并且隨后離心。將上清液(血漿)貯存在–20℃直至分析。在通過(guò)高效液相色譜法-質(zhì)譜法(hlpc/ms)分析之前，血漿樣品如下加工：

血漿：將每種樣品用甲醇按比率1:4處理、振搖和過(guò)濾(0.22μm)。將1μl處理的樣品上樣到hplc/ms柱上。

使用以下hplc梯度(a：10mm甲酸銨；b：乙腈；總時(shí)間：6分鐘)：100％a1分鐘；隨后4分鐘內(nèi)100％a至100％b；隨后100％b1分鐘。在不同的時(shí)間洗脫每種環(huán)狀二核苷酸并且通過(guò)測(cè)量254nm處的吸光度進(jìn)行檢測(cè)。

圖8中顯示這個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，所述結(jié)果揭示，氟化環(huán)狀二核苷酸在小鼠血液中比非氟化環(huán)狀二核苷酸更長(zhǎng)地保留。

實(shí)施例2.5：比較氟化cdn和非氟化cdn在體外在來(lái)自健康人供體的全血中誘導(dǎo)細(xì)胞因子的能力

·所用的報(bào)告細(xì)胞系：hek-blue^tmifn-α/β-ko-sting、hek-blue^tmil-1r和hek-blue^tmtnf-α

·受檢的主題cdn：cl603、cl632、cl614和cl656

·受檢的參比(非氟化)cdn：c-gamp、2’,3’-c-gamp、c-aimp和c-aimp(s)

·評(píng)價(jià)的活性：i型ifn誘導(dǎo)作用(hek-blue^tmifn-α/β-ko-sting)、il-1誘導(dǎo)作用(hek-blueil-1r)和tnf-α誘導(dǎo)作用(hek-bluetnf-α)。

人血樣品的獲得和處置

在圣迭戈血庫(kù)(3636gatewaycenterave,suite100；sandiego,ca92102；美國(guó)；www.sandiegobloodbank.org)從健康供體獲得20份人血樣品。簡(jiǎn)而言之，在捐贈(zèng)時(shí)通過(guò)靜脈穿刺，將樣品采集入肝素鈉(綠蓋)管，并且隨后貯存在4℃直至取件。將管在采集日取件，轉(zhuǎn)運(yùn)期間在冰上貯存，并且隨后在同一日與cdn一起檢驗(yàn)。

人血樣品的處理和檢驗(yàn)

每份血液樣品在rpmi培養(yǎng)基中稀釋(1:1)并等分入按六個(gè)不同濃度(30μg/ml、10μg/ml、3μg/ml、1μg/ml、0.3μg/ml和0.1μg/ml)含有每種cdn的96孔板(180μl孔)。將平板在37℃在co2培養(yǎng)箱中孵育18至20小時(shí)。次日，將上清液收集，轉(zhuǎn)移入圓底96孔板的相應(yīng)孔，并貯存在-80℃。在后續(xù)日，為三個(gè)受檢的報(bào)告細(xì)胞系的每一個(gè)如下制備新的96孔板：添加來(lái)自先前平板(含有孵育的cdn和血漿)的10μl上清液至新報(bào)告細(xì)胞平板中的相應(yīng)孔。隨后，將含有熱滅活血清的培養(yǎng)基中事先收獲并計(jì)數(shù)的所需報(bào)告細(xì)胞系的180μl等分細(xì)胞添加至每個(gè)孔(大約50,000個(gè)細(xì)胞/孔)，并將平板孵育大約20小時(shí)。如先前所描述那樣，使用quanti-blue^tm測(cè)定法測(cè)定所需的細(xì)胞因子誘導(dǎo)活性。簡(jiǎn)而言之，轉(zhuǎn)移來(lái)自先前孵育的平板中的20μl上清液至新96孔板的相應(yīng)孔，所述孔中事先已經(jīng)添加180μlquanti-blue^tm試劑。

圖9中總結(jié)了來(lái)自這個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，所述結(jié)果顯示本發(fā)明的代表性氟化cdn和相關(guān)的參考cdn的三種細(xì)胞因子誘導(dǎo)活性(i型ifn、il-1和tnf-α)。所示值是受檢的整個(gè)濃度范圍(30μg/ml、10μg/ml、3μg/ml、1μg/ml、0.3μg/ml、0.1μg/ml和0.03μg/ml)內(nèi)全部20名供體的總平均數(shù)。cdn的活性依據(jù)術(shù)語(yǔ)“有效濃度”(本文限定為在所示濃度產(chǎn)生至少0.5的seap強(qiáng)度值的cdn)從7個(gè)受檢濃度的最低者(0.03μg/ml)至受檢濃度的最高者(30μg/ml)表述。該圖揭示了兩個(gè)主要發(fā)現(xiàn)：首先，在受檢濃度范圍內(nèi)，每一個(gè)受檢cdn均誘導(dǎo)每種所評(píng)估的細(xì)胞因子；并且其次，對(duì)于每種細(xì)胞因子誘導(dǎo)活性，每種氟化cdn比其相應(yīng)的非氟化類似物更有活性(cl603與c-gamp；cl614與c-aimp；以及cl656與c-aimp[s]比較)。

實(shí)施例2.6：比較氟化脫氧核糖-cdn和非氟化核糖-cdn的抗svpd或np1酶切割性，如通過(guò)uhplc-ms監(jiān)測(cè)

·所用的酶：蛇毒磷酸二酯酶(svpd)和核酸酶p1(np1)

·受檢的主題cdn：cl603、cl632、cl614和cl656

·受檢的參比(非氟化)cdn：c-gamp和c-aimp

·性能評(píng)價(jià)：抗酶切割性

我們將每種cdn與已知切割核酸和cdn的兩種酶中任一者孵育，并且隨后通過(guò)測(cè)量與cdn相對(duì)應(yīng)的峰的面積降幅，觀察隨時(shí)間推移受uhplc降解的跡象(根據(jù)ms鑒定)。具體而言，我們?cè)u(píng)估了cdn對(duì)蛇毒磷酸二酯酶(svpd)和核酸酶p1(np1)的抗性，所述兩種酶均可以通過(guò)切割磷酸二酯核苷酸鍵降解cdn。實(shí)驗(yàn)如下進(jìn)行：

每種cdn(7μg)分別在37℃的水浴中與(21μl)任一種酶(含有0.6mmmgcl2的pbs緩沖液中的160μgsvpd；或含有2mmzncl2的30mm乙酸鹽緩沖液[ph5.3]中的2.5munp1)的溶液或與水(作為對(duì)照)孵育。在0小時(shí)至120小時(shí)的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集等分量的反應(yīng)混合物，在100℃加熱2分鐘，并且隨后在0℃冷凍。最后，將10μl每種等分試樣直接上樣至hplc(配備uv-檢測(cè)器的agilent1290infinityuhplc；柱：watersacquityuplccshc181.7μm[2.1mmx50mm；流量：0.3ml/分鐘]；在254nm檢測(cè)；自動(dòng)進(jìn)樣器溫度：25℃)供分析。使用以下梯度：100％a(10mm甲酸銨水溶液)1分鐘；隨后經(jīng)5分鐘100％a至100％b(乙腈)。

通過(guò)以下方式計(jì)算在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)cdn的吸光度百分?jǐn)?shù)：母cdn相對(duì)應(yīng)的峰面積除以色譜圖中全部峰面積總和，并且隨后乘以100。

圖10a-d中顯示來(lái)自這個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，所述結(jié)果揭示了兩個(gè)重要發(fā)現(xiàn)：首先，本發(fā)明的氟化脫氧核糖-cdn比其相應(yīng)的非氟化核糖-cdn類似物更抵抗任一種酶的酶降解作用(在圖10a和圖10b中將cl656或cl614與c-aimp比較，并且在圖10c和圖10d中將cl603或cl632與c-gamp比較)；其次；在本發(fā)明的氟化脫氧核糖-cdn當(dāng)中，含有兩個(gè)硫代磷酸酯二酯鍵(cl656和cl632)的那些比其含有兩個(gè)磷酸二酯鍵的相應(yīng)類似物(分別是cl614和cl603)具有更多svpd抗性。

實(shí)施例2.7：在氟化脫氧核糖-cdn和非氟化核糖-cdn暴露于svpd或np1之前和之后，比較這些cdn的體外活性

·所用的報(bào)告細(xì)胞系：thp1-dual^tm

·受檢的主題cdn：cl603、cl632、cl614和cl656

·受檢的參比(非氟化)cdn：c-gamp和c-aimp

·評(píng)價(jià)的活性：i型ifn誘導(dǎo)作用

在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明的四種代表性氟化脫氧核糖-cdn(cl603、cl632、cl614和cl656)及其相應(yīng)的非氟化核糖-cdn類似物(分別是c-gamp和c-aimp)就其抵抗兩種已知的cdn切割酶：蛇毒磷酸二酯酶(svpd)和核酸酶p1(np1)的切割作用的相對(duì)穩(wěn)定性進(jìn)行比較。它如下文描述那樣進(jìn)行。

如實(shí)施例2.6中所述那樣，將每種cdn(7μg)與svpd、np1或水(作為對(duì)照)在水浴中在37℃孵育2小時(shí)，并且隨后在100℃孵育10分鐘。將所得的溶液冷卻至室溫。隨后如實(shí)施例2.1中所述，將等分量(20μl)的每種溶液分別與thp1-dual^tm細(xì)胞(180μl；濃度：100,000個(gè)細(xì)胞/孔)孵育。如上文解釋，用quanti-luc^tm定量isg54表達(dá)(作為ifn-α/β產(chǎn)生的指示物)。

圖11中顯示來(lái)自這個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，所述結(jié)果揭示了兩個(gè)重要發(fā)現(xiàn)：首先，與任一種酶孵育之前或與單一的水(對(duì)照)孵育后，全部cdn均在細(xì)胞中誘導(dǎo)isg54表達(dá)；并且其次，與任一種酶孵育后，與非氟化核糖-cdn相對(duì)應(yīng)的溶液完全喪失這種活性，而與氟化脫氧核糖-cdn相對(duì)應(yīng)的那些溶液極大保留這種活性。這些結(jié)果顯示，氟化脫氧核糖-cdn比其相應(yīng)的非氟化核糖-類似物更抵抗svpd或np1的酶促切割。

氟化脫氧-環(huán)狀二核苷酸的類別效應(yīng)

我們確定，與其相應(yīng)非氟化核糖-cdn相比，本發(fā)明的氟化脫氧核糖-cdn令人驚訝地顯示出獨(dú)特、非顯而易見和先前未報(bào)道的類別效應(yīng)，所述類別效應(yīng)可以用于涉及操作sting活性的治療應(yīng)用、診斷應(yīng)用和研究應(yīng)用。例如，氟化cdn更有活性，如我們已經(jīng)在體外通過(guò)在不同細(xì)胞系中和在全血中測(cè)量細(xì)胞因子誘導(dǎo)作用而確定。另外，它們?cè)隗w內(nèi)消除得更緩慢，如我們已經(jīng)在小鼠中測(cè)定。最后，它們顯示出優(yōu)越的抗酶切割性。

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