本發(fā)明屬于生物發(fā)酵領(lǐng)域，特別涉及一種產(chǎn)纖維素木醋桿菌菌體濃度的在線評價方法。

背景技術(shù)：

細胞纖維素(Bacterial Cellulose，BC)是一類細菌合成的惰性高分子化合物材料。與天然纖維素結(jié)構(gòu)相似，都是由葡萄糖以β-1，4-糖苷鍵連接而成。而細菌纖維素又具有獨特的物理結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，如具有優(yōu)異的生物親和性、生物相容性、生物適應(yīng)性和良好的生物可降解性，是世界是公認的性能優(yōu)異的新型生物學(xué)材料。目前BC已經(jīng)在食品、醫(yī)藥、化工、造紙、美容和濾膜等方面取得成功的應(yīng)用。目前能夠產(chǎn)生BC的細菌主要有Acetobacter、Rhizobium、Agrobacterium和Sarcina等，其中產(chǎn)量最高、應(yīng)用最廣的為木醋桿菌(Acetobacter xylinus)。

在發(fā)酵工業(yè)中，菌體濃度是最重要的工藝參數(shù)，培養(yǎng)基的利用情況、菌體代謝活性、產(chǎn)物利率和培養(yǎng)周期等，均與菌體濃度密切相關(guān)，因此在發(fā)酵過程中對菌體濃度進行監(jiān)控顯得尤為重要。然而，木醋桿菌在培養(yǎng)過程中，會被自身生成的纖維素絲包裹起來，發(fā)酵液中易形成絮狀菌團，所以其菌體濃度的評價一直以來是個難題。

目前常用的菌體濃度評價方法有兩大類：

1)傳統(tǒng)離線檢測方法，如分光光度法和干濕重法，前者的檢測原理是通過測定細菌在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)光的吸光度或發(fā)光強度，對菌體進行定量分析，但由于木醋桿菌培養(yǎng)基有較深的顏色及產(chǎn)生的纖維素絲會干擾光的吸收，造成檢測結(jié)果往往有很大的偏差；后者是對培養(yǎng)液離心收集菌體，而后稱量菌體的濕重或者干重，但由于木醋桿菌培養(yǎng)產(chǎn)生的纖維素絲也會隨著菌體離心下來，且占有比較大的比例，因此檢測結(jié)果也不準確。另一種常用離線檢測方法為平板菌落計數(shù)法，檢測結(jié)果比較準確，但該方法操作費時費力，一般需要3～4天才能得到結(jié)果，有很大的時間滯后性。另外，以上這些方法均需要隔一段時間取一次樣，取樣過程要打開生物反應(yīng)器極易帶進雜菌而造成染菌。

2)在線檢測方法，如在線光學(xué)濁度法，但木醋桿菌的培養(yǎng)基顏色、不溶顆粒和大量氣泡會干擾光的傳播，雖然沒有了取樣的麻煩，檢測結(jié)果也能時時在線更新，但檢測結(jié)果偏差太大，因而無法應(yīng)用于木醋桿菌菌體濃度評價。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種產(chǎn)纖維素木醋桿菌菌體濃度的在線評價方法。該方法建立了菌體濃度與電容率之間的關(guān)系模型，在發(fā)酵液中加入氣體分布器有效減少了發(fā)酵液中的纖維素菌團之間相互纏繞成團，插入兩根工作電極，在兩根工作電極產(chǎn)生的交互電場影響下，溶液中的離子向電極遷移，有完整等離子細胞壁的活細胞被極化，形成很小的電容。細胞濃度越高，等離子細胞壁越多，電容 越大。不同于常規(guī)的光學(xué)儀器，該系統(tǒng)只針對活菌體，對于死菌體或者是培養(yǎng)液中的任何不溶顆粒都不敏感，因此檢測的結(jié)果準確可靠。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：一種產(chǎn)纖維素木醋桿菌菌體濃度的在線評價方法，包括如下步驟：

(1)菌株活化：取凍干保存的木醋桿菌涂布到平板固體培養(yǎng)基上，28-32℃培養(yǎng)4-8天生成單菌落，挑選上述培養(yǎng)好的單菌落，用接種環(huán)均勻涂在斜面固體培養(yǎng)基上，于28-32℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-4天。

(2)搖瓶培養(yǎng)：用無菌小鏟取一小塊上述培養(yǎng)好的斜面薄膜，接入搖瓶液體培養(yǎng)基中，28-32℃培養(yǎng)4-6h。

(3)種子罐培養(yǎng)：將氣體分布器置于種子罐中，并將在線電容檢測裝置的兩根工作電極從種子罐側(cè)向插入，然后裝入液體培養(yǎng)基，經(jīng)高溫蒸汽滅菌后，將步驟(2)培養(yǎng)好的搖瓶種子液全部接入種子罐開始培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28-32℃，培養(yǎng)壓力為20-50Kpa，空氣流量為3-10L/min。

(4)檢測：在步驟(3)種子罐中進行培養(yǎng)的同時，開啟在線電容檢測裝置，并將檢測頻率設(shè)置為300～2000Hz，實時在線監(jiān)測的電容率的變化。

(5)終點：根據(jù)電容率變化與菌體濃度相關(guān)聯(lián)的關(guān)系模型，繪制菌體濃度趨勢圖確定發(fā)酵培養(yǎng)的終點。

一些實施例中，本發(fā)明所述的步驟(1)的固體培養(yǎng)基組成為：葡萄糖2％-3％，多聚蛋白胨0.5％-1％，檸檬酸0.1％-0.2％，七水硫酸鎂0.03％-0.05％，硫酸銨0.5％-1％，磷酸二氫鉀0.3％-0.5％，乙酸鈉0.1％-0.2％，瓊脂粉2％-2.5％。

一些實施例中，本發(fā)明所述步驟(2)和步驟(3)的液體培養(yǎng)基組成為：果糖1％-4％，玉米漿0.5％-2％，檸檬酸0.2％-0.5％，十二水磷酸氫二納0.2％-0.5％，七水硫酸鎂0.03％-0.05％，磷酸氫二銨0.4％-1％。

一些實施例中，本發(fā)明所述步驟(2)和步驟(3)的液體培養(yǎng)基組成為：葡萄糖2％-3％，酵母粉0.5％-1％，檸檬酸0.115％-0.2％，十二水磷酸氫二納0.34％-0.5％，大豆蛋白胨0.5％-1％，磷酸氫二銨0.1％-0.2％。

一些實施例中，本發(fā)明所述步驟(2)和步驟(3)的液體培養(yǎng)基組成為：葡萄糖2-3％，玉米漿干粉0.5％-1.5，檸檬酸0.1％-0.3％，十二水磷酸氫二納0.1％-0.3％，七水硫酸鎂0.02％-0.04％，磷酸氫二銨0.2％-0.6％。

一些實施例中，本發(fā)明所述步驟(3)的氣體分布器，優(yōu)選的為環(huán)管式多孔氣體分布器。氣體分布器的加入有效減少了發(fā)酵液中的纖維素菌團之間相互纏繞成團。

一些實施例中，本發(fā)明步驟(3)所述的種子罐的體積為15L-100L。

一些實施例中，本發(fā)明步驟(3)所述的裝入液體培養(yǎng)基的體積為種子罐體積的60％-70％。

一些實施例中，本發(fā)明步驟(3)和步驟(4)所述的在線電容檢測裝置，包括工作電極、傳感器、轉(zhuǎn)換器、頻率控制元件及顯示器。

一些實施例中，本發(fā)明步驟(3)和步驟(4)所述的在線電容檢測裝置，其中的工作電極，優(yōu)選的為鉑電極探頭。

一些實施例中，本發(fā)明步驟(3)和步驟(4)所述的在線電容檢測裝置，其中的顯示器顯示的參數(shù)是電容率，單位為pF/cm。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點和有益效果：

1)根據(jù)木醋桿菌的菌體特征尋找到一個最佳檢測頻率范圍，建立了菌體濃度與電容率之間的關(guān)系模型，實時顯示菌體濃度及活性狀態(tài)，有利于加深對發(fā)酵培養(yǎng)過程的理解，準確掌控發(fā)酵培養(yǎng)的周期；

2)操作簡便；無需取樣，減少染菌風(fēng)險，且檢測結(jié)果準確、穩(wěn)定、及時；

3)根據(jù)在線菌體濃度數(shù)據(jù)的指導(dǎo)意義，調(diào)整相關(guān)培養(yǎng)工藝，較大幅度提高木醋桿菌菌體濃度，并縮短培養(yǎng)周期；

4)根據(jù)在線的菌體濃度調(diào)整培養(yǎng)工藝實現(xiàn)了細菌纖維素生產(chǎn)的逐級放大，此培養(yǎng)工藝在細菌纖維素生產(chǎn)小試、中試和工業(yè)化生產(chǎn)過程中均得到很好應(yīng)用；

5)通過調(diào)整培養(yǎng)基配方和改善氣體分布器類型，在一定程度上減少了菌體培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的纖維素絲纏繞成團的現(xiàn)象，使得纖維素能夠均勻懸浮分布，這樣大大加強了菌體濃度檢測的準確性。

附圖說明

圖1，實施例1培養(yǎng)過程中平板菌落計數(shù)與電容率的變化趨勢圖；

圖2，實施例1培養(yǎng)過程中平板菌落計數(shù)與電容率的相關(guān)性；

圖3，實施例2培養(yǎng)過程中平板菌落計數(shù)與電容率的變化趨勢圖；

圖4，實施例2培養(yǎng)過程中平板菌落計數(shù)與電容率的相關(guān)性；

圖5，實施例3培養(yǎng)過程中平板菌落計數(shù)與電容率的變化趨勢圖；

圖6，實施例3培養(yǎng)過程中平板菌落計數(shù)與電容率的相關(guān)性。

具體實施方式

下面以具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但本發(fā)明不受下述實施例的限定。

實施例1

(1)菌株活化

固體培養(yǎng)基的配制：葡萄糖2％-3％，多聚蛋白胨0.5％-1％，檸檬酸0.1％-0.2％，七水硫酸鎂0.03％-0.05％，硫酸銨0.5％-1％，磷酸二氫鉀0.3％-0.5％，乙酸鈉0.1％-0.2％，瓊脂粉2％-2.5％。

取凍干保存的木醋桿菌涂布到平板固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)4天生成單菌落。挑選上述培養(yǎng)好的單菌落，用接種環(huán)均勻涂在斜面固體培養(yǎng)基上，于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天。

(2)搖瓶培養(yǎng)

液體培養(yǎng)基的配制：葡萄糖2％-3％，酵母粉0.5％-1％，檸檬酸0.115％-0.2％，十二水磷酸氫二納0.34％-0.5％，大豆蛋白胨0.5％-1％，磷酸氫二銨0.1％-0.2％。

用無菌小鏟取上述培養(yǎng)好的斜面薄膜，接入搖瓶液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)5h。

(3)種子罐培養(yǎng)

液體培養(yǎng)基的配制：葡萄糖2％-3％，酵母粉0.5％-1％，檸檬酸0.115％-0.2％，十二水磷酸氫二納0.34％-0.5％，大豆蛋白胨0.5％-1％，磷酸氫二銨0.1％-0.2％。

將環(huán)管式多孔氣體分布器置于15L種子罐中，并將在線電容檢測裝置的兩根工作電極從種子罐側(cè)向插入，然后裝入10L液體培養(yǎng)基，經(jīng)高溫蒸汽滅菌后，最后將步驟(2)培養(yǎng)好的搖瓶種子液全部接入種子罐開始培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28℃，培養(yǎng)壓力為30Kpa，空氣流量為6L/min；

(4)檢測：在步驟(3)種子罐中進行培養(yǎng)的同時，開啟在線電容檢測裝置，并將檢測頻率設(shè)置為300～1300Hz，實時在線監(jiān)測的電容率的變化，如圖1所示；

(5)終點：培養(yǎng)24h結(jié)束。

(6)結(jié)果分析：

1)由于圖2可以看出在線電容檢測系統(tǒng)的電容率與平板菌落計數(shù)之間有良好的線性相關(guān)性，其中，相關(guān)系數(shù)r＝0.992，表明電容率可間接代表平板菌落計數(shù)，并且二者之間的關(guān)系模型為：平板菌落計數(shù)＝1.567*電容率+0.049。

2)15L規(guī)模培養(yǎng)時，由平板菌落計數(shù)法計數(shù)顯示(每4h取樣)，在20h達到最大菌體濃度1.8±0.2(10⁶個/mL)，而本申請的在線電容檢測系統(tǒng)的電容率結(jié)果顯示在18h時電容率為1.1pF/cm，菌體濃度已經(jīng)達到最大值。表明平板菌落計數(shù)法由于受到取樣頻率的限制，很容易漏掉關(guān)鍵的“拐點”，而在線電容檢測法卻能實時顯示過程變化，可將15L小試的培養(yǎng)周期成功的縮短為18h，節(jié)約了成本。

實施例2

(1)菌株活化

固體培養(yǎng)基的配制：葡萄糖2％-3％，多聚蛋白胨0.5％-1％，檸檬酸0.1％-0.2％，七水硫酸鎂0.03％-0.05％，硫酸銨0.5％-1％，磷酸二氫鉀0.3％-0.5％，乙酸鈉0.1％-0.2％，瓊脂粉2％-2.5％。

取凍干保存的木醋桿菌涂布到平板固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)6天生成單菌落。挑選上述培養(yǎng)好的單菌落，用接種環(huán)均勻涂在斜面固體培養(yǎng)基上，于30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。

(2)搖瓶培養(yǎng)

液體培養(yǎng)基的配制：果糖1％-4％，玉米漿0.5％-2％，檸檬酸0.2％-0.5％，十二水磷酸氫二納0.2％-0.5％，七水硫酸鎂0.03％-0.05％，磷酸氫二銨0.4％-1％。

用無菌小鏟取上述培養(yǎng)好的斜面薄膜，接入搖瓶液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)6h。

(3)種子罐培養(yǎng)

液體培養(yǎng)基的配制：果糖1％-4％，玉米漿0.5％-2％，檸檬酸0.2％-0.5％，十二水磷酸氫二納0.2％-0.5％，七水硫酸鎂0.03％-0.05％，磷酸氫二銨0.4％-1％。

將環(huán)管式多孔氣體分布器置于50L種子罐中，并將在線電容檢測裝置的兩根工作電極從種子罐側(cè)向插入，然后裝入30L液體培養(yǎng)基，經(jīng)高溫蒸汽滅菌后，最后將步驟(2)培養(yǎng)好的搖瓶種子液全部接入種子罐開始培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)壓力為20Kpa，空氣流量為3L/min；

(4)檢測：在步驟(3)種子罐中進行培養(yǎng)的同時，開啟在線電容檢測裝置，并將檢測頻率設(shè)置為500～1500Hz，實時在線監(jiān)測的電容率的變化，如圖3所示；

(5)終點：培養(yǎng)24h結(jié)束。

(6)結(jié)果分析：

1)由于圖4可以看出在線電容檢測系統(tǒng)的電容率與平板菌落計數(shù)之間有良好的線性相關(guān)性，其中，相關(guān)系數(shù)r＝0.999，表明電容率可間接代表平板菌落計數(shù)，并且二者之間的關(guān)系模型為：平板菌落計數(shù)＝1.553*電容率-0.050。

2)50L規(guī)模培養(yǎng)時，由平板菌落計數(shù)法計數(shù)顯示(每4h取樣)，在24h達到最大菌體濃度3.0±0.2(106個/mL)，而本申請的在線電容檢測系統(tǒng)的電容率結(jié)果顯示在20h的電容率為2.0pF/cm，菌體濃度已經(jīng)達到最大值。表明平板菌落計數(shù)法由于受到取樣頻率的限制，很容易漏掉關(guān)鍵的“拐點”，而在線電容法卻能實時顯示過程變化。由此，可將50L中試的培養(yǎng)周期成功的縮短為20h，節(jié)約了成本。

實施例3

(1)菌株活化

固體培養(yǎng)基的配制：葡萄糖2％-3％，多聚蛋白胨0.5％-1％，檸檬酸0.1％-0.2％，七水硫酸鎂0.03％-0.05％，硫酸銨0.5％-1％，磷酸二氫鉀0.3％-0.5％，乙酸鈉0.1％-0.2％，瓊脂粉2％-2.5％。

取凍干保存的木醋桿菌涂布到平板固體培養(yǎng)基上，32℃培養(yǎng)8天生成單菌落。挑選上述培養(yǎng)好的單菌落，用接種環(huán)均勻涂在斜面固體培養(yǎng)基上，于32℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天。

(2)搖瓶培養(yǎng)

液體培養(yǎng)基的配制：葡萄糖2-3％，玉米漿干粉0.5％-1.5，檸檬酸0.1％-0.3％，十二水磷酸氫二納0.1％-0.3％，七水硫酸鎂0.02％-0.04％，磷酸氫二銨0.2％-0.6％。

用無菌小鏟取上述培養(yǎng)好的斜面薄膜，接入搖瓶液體培養(yǎng)基中，32℃培養(yǎng)4h。

(3)種子罐培養(yǎng)

液體培養(yǎng)基的配制：葡萄糖2-3％，玉米漿干粉0.5％-1.5，檸檬酸0.1％-0.3％，十二水磷酸氫二納0.1％-0.3％，七水硫酸鎂0.02％-0.04％，磷酸氫二銨0.2％-0.6％。

將環(huán)管式多孔氣體分布器置于100L種子罐中，并將在線電容檢測裝置的兩根工作電極從種子罐側(cè)向插入，然后裝入60L液體培養(yǎng)基，經(jīng)高溫蒸汽滅菌后，最后將步驟(2)培養(yǎng)好的搖瓶種子液全部接入種 子罐開始培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度32℃，培養(yǎng)壓力為50Kpa，空氣流量為10L/min；

將環(huán)管式多孔氣體分布器置于100L體積種子罐中，并將在線電容檢測系統(tǒng)的鉑電極探頭從種子罐側(cè)向插入。然后裝入60L液體培養(yǎng)基，經(jīng)高溫蒸汽滅菌后，連接好在線活細胞檢測系統(tǒng)并將檢測頻率設(shè)置為1000～2000Hz。最后將步驟(2)培養(yǎng)好的搖瓶種子液全部接入種子罐開始培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度32℃，培養(yǎng)壓力為50Kpa，空氣流量為10L/min，培養(yǎng)至24h后結(jié)束。

(4)檢測：在步驟(3)種子罐中進行培養(yǎng)的同時，開啟在線電容檢測裝置，并將檢測頻率設(shè)置為1000～2000Hz，實時在線監(jiān)測的電容率的變化，如圖5所示；

(5)終點：培養(yǎng)24h結(jié)束。

(6)結(jié)果分析：

1)由于圖6可以看出在線電容檢測系統(tǒng)的電容率與平板菌落計數(shù)之間有良好的線性相關(guān)性，其中，相關(guān)系數(shù)r＝0.996，表明電容率可間接代表平板菌落計數(shù)，并且二者之間的關(guān)系模型為：平板菌落計數(shù)＝1.662*電容率-0.183。

2)100L規(guī)模培養(yǎng)時，由平板菌落計數(shù)法計數(shù)顯示(每4h取樣)，在20h達到最大菌體濃度7.5±0.2(106個/mL)，而本申請的在線電容檢測系統(tǒng)的電容率結(jié)果顯示在17h的電容率為4.3pF/cm，菌體濃度已經(jīng)達到最大值。表明平板菌落計數(shù)法由于受到取樣頻率的限制，很容易漏掉關(guān)鍵的“拐點”，而在線電容法卻能實時顯示過程變化。由此，可將100L工業(yè)生產(chǎn)的培養(yǎng)周期成功的縮短為17h，節(jié)約了成本。