本發(fā)明提供一種富含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的磷脂及其制備方法。
背景技術(shù)：
長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸（PUFAs）指含有兩個(gè)以上雙鍵且碳鏈長(zhǎng)度為18～22個(gè)碳原子的直鏈脂肪酸，如EPA、DHA、DPA和ARA等對(duì)人體具有重要的生理活性，具有其他脂肪酸不可替代的作用。甘三酯和磷脂是PUFAs兩種主要的天然載體，其中，甘三酯型PUFAs主要來(lái)源于深海魚(yú)類(lèi)脂肪和微生物發(fā)酵，磷脂型PUFAs則主要從南極磷蝦以及深海魚(yú)類(lèi)的器官組織中進(jìn)行提取。最近一些研究表明，磷脂型PUFAs比甘三酯型PUFAs具有更好的氧化穩(wěn)定性和生物利用性，磷脂型PUFAs大部分可以不被水解直接被細(xì)胞吸收，具有磷脂和PUFAs的雙重生理活性，因此在維持人體生理功能方面比甘三酯型PUFAs具有明顯優(yōu)勢(shì)，磷脂型PUFAs可廣泛用于食品添加劑、保健品和醫(yī)藥等方面。
然而，受來(lái)源限制，磷脂型PUFAs受到磷蝦捕撈季節(jié)的影響以及可能存在的重金屬污染等威脅，而來(lái)源豐富的大豆磷脂和蛋黃磷脂則其天然脂肪酸組成中不含PUFAs，因此，基于普通磷脂利用酶法合成含有PUFAs結(jié)構(gòu)磷脂的研究正在逐步展開(kāi)。
CN101701229B公開(kāi)了將濃縮磷脂和不飽和油脂混合加入脂肪酶催化磷脂酯交換制備質(zhì)構(gòu)磷脂和卵磷脂的方法。該法以磷脂或濃縮磷脂和不飽和油脂作為原料，用脂肪酶進(jìn)行催化轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，但該方法反應(yīng)效率較低，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)60h左右。
CN102181498A應(yīng)用高純度海豹油游離型Ω-3不飽和脂肪酸和溶血磷脂酰膽堿，在酶非水相催化作用下，得到磷脂酰膽堿型Ω-3不飽和脂肪酸產(chǎn)品。該專(zhuān)利使用溶劑體系，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，同時(shí)在催化反應(yīng)過(guò)程中，水解副反應(yīng)發(fā)生嚴(yán)重，造成產(chǎn)物得率較低。
CN101195637B提供一種在亞臨界R134a體系中制備富含多不飽和脂肪酸磷脂的工藝，但該方法需要高壓密閉反應(yīng)釜及制備亞臨界氣體的相關(guān)裝置，設(shè)備投入大，同時(shí)反應(yīng)介質(zhì)R134a是一種化工原料，不適合用于食品的生產(chǎn)。
CN104531790A公開(kāi)了一種將陰/陽(yáng)離子表面活性劑溶于疏水性的烷類(lèi)溶劑中制備得到微反應(yīng)體系，采用磷脂酶進(jìn)行催化反應(yīng)即得到磷脂DHA的方法。
另外國(guó)內(nèi)其它一些關(guān)于酶法制備磷脂型PUFAs的文獻(xiàn)，也主要集中在在溶劑體系中使用固定化脂肪酶或固定化磷脂酶A1催化磷脂進(jìn)行酸解或酯—酯交換的反應(yīng)來(lái)進(jìn)行，如金華麗等（脂肪酶催化大豆磷脂改性的研究[J]）用novozym435催化大豆磷脂與EPA-DHA酯交換，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)60h，EPA-DHA的插入率為24%左右；孫兆敏（酶法制備n-3多不飽和脂肪酸型磷脂的工藝）在無(wú)溶劑體系中用固定化磷脂酶A1催化大豆磷脂和乙酯型魚(yú)油進(jìn)行酯交換反應(yīng)，EPA和DHA的插入率為25%，但磷脂水解副反應(yīng)發(fā)生非常嚴(yán)重。
US2005282033A提供了一種酶催化制備含PUFAs的改進(jìn)方法，該法在反應(yīng)過(guò)程中添加胺類(lèi)物質(zhì)，提高了反應(yīng)速率，但PUFAs的插入率和磷脂最終得率并未提高。
WO2005038037A2使用磷脂酶A1和A2進(jìn)行酯化和轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)制備結(jié)構(gòu)磷脂，該法反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，插入率不高，水解副反應(yīng)發(fā)生嚴(yán)重。
EP0494881B1使用磷脂酶A2在溶劑體系中催化酯化反應(yīng)，該法除存在以上方法的弊端外，還存在酶的來(lái)源有限而且固定化后活性不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的磷脂的制備方法，包括：
（1）將原料磷脂、油脂和溶劑接觸，加入酶制劑進(jìn)行反應(yīng)；
（2）除去溶劑后，加入固定化酶進(jìn)行反應(yīng)，其特征在于，在步驟（1）之后具有加入碳酰胺的步驟。
根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中，所述原料磷脂不含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸。
根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中，所述原料磷脂是植物來(lái)源的磷脂或動(dòng)物來(lái)源的磷脂。
根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中，所述植物來(lái)源的磷脂選自大豆磷脂、菜籽磷脂、葵花籽磷脂、花生磷脂、芝麻磷脂或玉米磷脂中的至少一種。
根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中，所述動(dòng)物來(lái)源的磷脂是蛋黃磷脂。
根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中，所述油脂含5～60重量％的長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸。
根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中，所述油脂選自深海魚(yú)油和微生物油脂中的至少一種。
根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中，所述油脂選自金槍魚(yú)油、鯡魚(yú)油、三文魚(yú)油、沙丁魚(yú)油、二十二碳六烯酸藻油或花生四烯酸油脂中的至少一種。
根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中，所述溶劑是乙醇溶液。
根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中，所述溶劑是95％乙醇溶液。
根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中，以重量比計(jì)，步驟（1）中所述原料磷脂和所述油脂加入量之比為1：1～1：15。
根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中，以重量比計(jì)，步驟（1）中所述原料磷脂和所述油脂加入量之比為1：2～1：10。
根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中，以重量比計(jì)，步驟（1）中所述原料磷脂和所述油脂加入量之比為1：4～1：8。
根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中，以重量/體積（g/mL）比計(jì)，步驟（1）中所述原料磷脂和所述油脂的加入總量與所述溶劑之比為1：5～1：80。
根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中，以重量/體積（g/mL）比計(jì)，步驟（1）中所述原料磷脂和所述油脂的加入總量與所述溶劑之比為1：8～1：40。
根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中，以重量/體積（g/mL）比計(jì)，步驟（1）中所述原料磷脂和所述油脂的加入總量與所述溶劑之比為1：10～1：30。
根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中，以重量/體積（g/mL）比計(jì)，步驟（1）中所述原料磷脂和所述油脂的加入總量與所述溶劑之比為1：12～1：18。
根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中，步驟（1）中所述的酶制劑為游離酶形式。
根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中，步驟（1）中所述的酶制劑選自磷脂酶A1，磷脂酶A2或脂肪酶中的至少一種。
根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中，步驟（1）中所述的酶制劑來(lái)源于黑曲霉（Aspergillus niger）、南極假絲酵母（Candida antarctic）、皺褶假絲酵母（Candida rugosa）、柱狀假絲酵母（Candida cylindracea）、嗜熱真菌（Thermomyces lanuginosus）、米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）、米黑毛霉（Mucor miehei）、德氏根霉（Rhizopus delemar）、米根霉菌（Rhizopus oryzae）、 假單胞細(xì)菌屬（Pseudononas sp. ）中的至少一種。
根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中，以重量/體積（g/mL）比計(jì)，步驟（1）中所述原料磷脂和所述油脂的加入總量與所述酶制劑之比為10：1～200：1。
根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中，以重量/體積（g/mL）比計(jì)，步驟（1）中所述原料磷脂和所述油脂的加入總量與所述酶制劑之比為20：1～100：1。
根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中，以重量/體積（g/mL）比計(jì)，步驟（1）中所述原料磷脂和所述油脂的加入總量與所述酶制劑之比為40：1～80：1。
根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中，以重量/體積（g/mL）比計(jì)，步驟（1）中所述原料磷脂和所述油脂的加入總量與所述酶制劑之比為50：1～60：1。
根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中，相對(duì)于所述原料磷脂和所述油脂的加入總量100重量份，以重量比計(jì)，所述碳酰胺的加入量為100重量份～800重量份。
根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中，相對(duì)于所述原料磷脂和所述油脂的加入總量100重量份，以重量比計(jì)，所述碳酰胺的加入量為200重量份～600重量份。
根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中，相對(duì)于所述原料磷脂和所述油脂的加入總量100重量份，以重量比計(jì)，所述碳酰胺的加入量為250重量份～350重量份。
根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中，所述步驟（2）在溫度為60～80℃下進(jìn)行。
根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中，所述步驟（2）的固定化酶為固定于大孔吸附樹(shù)脂或堿性離子交換樹(shù)脂載體的脂肪酶或磷脂酶的至少一種。
根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中，以重量比計(jì)，所述原料磷脂和所述油脂的加入總量與所述固定化酶的重量比為10：1～200：1。
根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中，以重量比計(jì)，所述原料磷脂和所述油脂的加入總量與所述固定化酶的重量比為20：1～150：1。
根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中，所述步驟（2）在抽真空或保護(hù)氣體氣氛下進(jìn)行反應(yīng)。
根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中，所述步驟（2）的保護(hù)氣體氣氛是惰性氣體氣氛。
根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中，所述步驟（2）中加入吸水劑。
根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中，所述吸水劑選自分子篩或高分子吸水樹(shù)脂中的至少一種。
根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中，所述高分子吸水樹(shù)脂選自丙烯酰胺-丙烯酸鹽共聚交聯(lián)物和淀粉接枝丙烯酸鹽共聚交聯(lián)物中的至少一種。
根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中，所述原料磷脂的磷脂酰膽堿含量為15～60重量％。
根據(jù)本發(fā)明的制備方法，所述長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸是含有兩個(gè)以上雙鍵且碳原子數(shù)為18～22的直鏈脂肪酸。
根據(jù)本發(fā)明的制備方法，所述長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸是選自二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸和花生四烯酸中的至少一種。
根據(jù)本發(fā)明的制備方法，所述的含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的磷脂的磷脂酰膽堿含量為70～85重量％。
根據(jù)本發(fā)明的制備方法，所述的含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的磷脂的脂肪酸組成中，多不飽和脂肪酸含量為15～60重量%。
根據(jù)本發(fā)明的制備方法，所述的含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的磷脂的脂肪酸組成中，多不飽和脂肪酸含量為25～52重量%。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的磷脂，其是通過(guò)權(quán)利要求100～135中任意一項(xiàng)所述的制備方法制備的。
根據(jù)本發(fā)明的含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的磷脂，其磷脂酰膽堿含量為70～85重量％。
根據(jù)本發(fā)明的含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的磷脂，其脂肪酸組成中，多不飽和脂肪酸含量為15～60重量％。
根據(jù)本發(fā)明的含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的磷脂，其脂肪酸組成中，多不飽和脂肪酸含量為25～52重量%。
根據(jù)本發(fā)明的含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的磷脂，所述長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸是含有兩個(gè)以上雙鍵且碳原子數(shù)為18～22的直鏈脂肪酸。
根據(jù)本發(fā)明的含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的磷脂，所述長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸是選自二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸和花生四烯酸中的至少一種。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的磷脂酰膽堿，其脂肪酸組成中，多不飽和脂肪酸含量為20～80重量％。
根據(jù)本發(fā)明的含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的磷脂酰膽堿，其脂肪酸組成中，多不飽和脂肪酸含量為30～60重量%。
根據(jù)本發(fā)明的含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的磷脂酰膽堿，所述長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸是含有兩個(gè)以上雙鍵且碳原子數(shù)為18～22的直鏈脂肪酸。
根據(jù)本發(fā)明的含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的磷脂酰膽堿，所述長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸是選自二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸和花生四烯酸中的至少一種。
發(fā)明效果
本發(fā)明主要有以下優(yōu)點(diǎn)：(1) 無(wú)需高純度長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸?；w和高純度的磷脂酰膽堿（或溶血磷脂酰膽堿）作反應(yīng)原料，大大減少了價(jià)格成本。(2) 反應(yīng)產(chǎn)物中長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸和磷脂酰膽堿含量顯著提高，實(shí)現(xiàn)了磷脂中長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的接入和磷脂酰膽堿提純的目的，顯著提升產(chǎn)品附加值。
本方法無(wú)需采用高純度磷脂酰膽堿（PC）和高純度的長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸原料，工藝簡(jiǎn)單，反應(yīng)產(chǎn)物中長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸插入率高且磷脂酰膽堿含量提高到70%以上，大大提升了產(chǎn)品的附加值。
具體實(shí)施方式
多不飽和脂肪酸（PUFA）按照從甲基端開(kāi)始第1個(gè)雙鍵的位置不同，可分為ω-3和ω-6多不飽和脂肪酸。ω-3不飽和脂肪酸中對(duì)人體最重要的兩種不飽和脂肪酸是DHA和EPA。EPA是二十碳五烯酸的英文縮寫(xiě)，具有清理血管中的垃圾（膽固醇和甘油三酯）的功能，俗稱(chēng)"血管清道夫"。DHA是二十二碳六烯酸的英文縮寫(xiě)，具有軟化血管、健腦益智、改善視力的功效，俗稱(chēng)"腦黃金"。
含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的磷脂的制備方法
本發(fā)明的含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的磷脂的制備方法，包括：
（1）將原料磷脂、油脂和溶劑接觸，加入酶制劑進(jìn)行反應(yīng)；
（2）除去溶劑后，加入固定化酶進(jìn)行反應(yīng)，其特征在于，在步驟（1）之后具有加入碳酰胺的步驟。
本發(fā)明中，所述長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸是指含有兩個(gè)以上雙鍵且碳原子數(shù)為18～22的直鏈脂肪酸，如二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）、二十二碳五烯酸（DPA）和花生四烯酸（ARA）等。
在本發(fā)明中，所述原料磷脂是植物來(lái)源的磷脂或動(dòng)物來(lái)源的磷脂。所述植物來(lái)源的磷脂選自大豆磷脂、菜籽磷脂、葵花籽磷脂、花生磷脂、芝麻磷脂或玉米磷脂中的至少一種。所述動(dòng)物來(lái)源的磷脂是蛋黃磷脂。本發(fā)明中的原料磷脂不含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸。
本發(fā)明中“不含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸”是指通過(guò)本發(fā)明的中所述的測(cè)定方法未檢測(cè)出長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸。本發(fā)明的“原料磷脂”是指反應(yīng)中作為原料使用的磷脂。本發(fā)明的“含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的磷脂”是指通過(guò)上述含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的磷脂的制備方法制備獲得的磷脂。在本發(fā)明中，所述油脂含5～60重量％、優(yōu)選10～55重量％、更優(yōu)選20～45重量％的長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，所述油脂含16.2重量％、22.7重量％、27重量％、28.6重量％、40重量％或50重量％的長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸。
所述油脂選自深海魚(yú)油和微生物油脂中的至少一種。所述油脂選自金槍魚(yú)油、鯡魚(yú)油、三文魚(yú)油、沙丁魚(yú)油、二十二碳六烯酸藻油或花生四烯酸油脂中的至少一種。
在本發(fā)明中，所述溶劑是乙醇溶液，優(yōu)選是95％乙醇溶液。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，以重量比計(jì)，步驟（1）中所述原料磷脂和所述油脂加入量之比為1：1～1：20，優(yōu)選為1：1～1：15，更優(yōu)選為1：2～1：10，進(jìn)一步優(yōu)選為1：4～1：8。
在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，以重量比計(jì)，步驟（1）中所述原料磷脂和所述油脂加入量之比為1：1、1：2、1：4、1：5、1：8、1：10、1：15。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，以重量/體積（g/mL）比計(jì)，步驟（1）中所述原料磷脂和所述油脂的加入總量與所述溶劑之比為1：2～1：100，優(yōu)選為1：5～1：80，更優(yōu)選為1：8～1：40，進(jìn)一步優(yōu)選為1：10～1：30，特別優(yōu)選為1：12～1：20，最優(yōu)選為1：12～1：18。
在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，以重量/體積（g/mL）比計(jì)，步驟（1）中所述原料磷脂和所述油脂的加入總量與所述溶劑之比為1：5、1：8、1：10、1：12、1：18、1：20、1：30、1：40。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，步驟（1）中所述的酶制劑為游離酶形式。步驟（1）中所述的酶制劑選自磷脂酶A1，磷脂酶A2或脂肪酶中的至少一種。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，步驟（1）中所述的酶制劑來(lái)源于黑曲霉（Aspergillus niger）、南極假絲酵母（Candida antarctic）、皺褶假絲酵母（Candida rugosa）、柱狀假絲酵母（Candida cylindracea）、嗜熱真菌（Thermomyces lanuginosus）、米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）、米黑毛霉（Mucor miehei）、德氏根霉（Rhizopus delemar）、米根霉菌（Rhizopus oryzae）、 假單胞細(xì)菌屬（Pseudononas sp. ）中的至少一種。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，以重量/體積（g/mL）比計(jì)，步驟（1）中所述原料磷脂和所述油脂的加入總量與所述酶制劑之比為10：1～200：1，優(yōu)選為20：1～100：1，更優(yōu)選為40：1～80：1，進(jìn)一步為50：1～60：1。
在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，以重量/體積（g/mL）比計(jì)，步驟（1）中所述原料磷脂和所述油脂的加入總量與所述酶制劑之比為20：1、30：1、45：1、55：1、60：1、80：1、100：1。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，相對(duì)于所述原料磷脂和所述油脂的加入總量100重量份，以重量比計(jì)，所述碳酰胺的加入量為100重量份～800重量份，優(yōu)選為200重量份～600重量份，更優(yōu)選為250重量份～350重量份。
在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，相對(duì)于所述原料磷脂和所述油脂的加入總量100重量份，以重量比計(jì)，所述碳酰胺的加入量為100重量份、200重量份、267重量份、300重量份、350重量份、400重量份、600重量份。
本發(fā)明中，所述步驟（1）的反應(yīng)條件沒(méi)有特別限定，只要能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明的目的即可。例如可以在30～40℃、例如35℃下進(jìn)行。反應(yīng)時(shí)間例如為1～10小時(shí)，優(yōu)選為2～6小時(shí)。
在加入碳酰胺進(jìn)行反應(yīng)之后，可以在0～4℃下進(jìn)行結(jié)晶處理，分理出過(guò)濾液。結(jié)晶處理的時(shí)間例如是1～6小時(shí)，優(yōu)選2～4小時(shí)。隨后將過(guò)濾液通過(guò)蒸餾（例如旋蒸）除去溶劑。
本發(fā)明中，所述步驟（2）在溫度為60～80℃下進(jìn)行。反應(yīng)時(shí)間例如為2～10小時(shí)，優(yōu)選為4～8小時(shí)。所述步驟（2）在抽真空或保護(hù)氣體氣氛下進(jìn)行反應(yīng)。抽真空例如為0.1～5KPa。所述步驟（2）的保護(hù)氣體氣氛是惰性氣體氣氛，例如是氮?dú)鈿夥铡?/p>
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述步驟（2）的固定化酶為固定于大孔吸附樹(shù)脂或堿性離子交換樹(shù)脂載體的脂肪酶或磷脂酶的至少一種。所述脂肪酶或磷脂酶是毛霉屬、青霉屬、曲霉屬、根霉屬、嗜熱真菌屬、假單胞細(xì)菌屬以及假絲酵母來(lái)源的微生物生產(chǎn)的脂肪酶或磷脂酶。所述固定化酶可以通過(guò)商購(gòu)獲得，例如，novozyme 435、Lipozyme RM IM，或者通過(guò)CN201310307403.6以及文獻(xiàn)Vikbjerg， Huiling Mu， Xuebing Xu，Synthesis of structured phospholipids by immobilized phospholipase A2 catalyzed acidolysis，Journal of Biotechnology， 2007，128：545～554等中記載的方法獲得，例如固定化磷脂酶A1、固定化磷脂酶A2等。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，以重量比計(jì)，所述原料磷脂和所述油脂的加入總量與所述固定化酶的重量比為10：1～200：1，優(yōu)選為20：1～150：1，更優(yōu)選為40：1～100：1，進(jìn)一步為50：1～60：1。
在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，以重量比計(jì)，所述原料磷脂和所述油脂的加入總量與所述固定化酶的重量比為25：1、29：1、30：1、50：1、55：1、60：1、67：1、100：1。
在本發(fā)明中，所述步驟（2）中加入吸水劑。所述吸水劑的加入量可以適當(dāng)確定，以重量比計(jì)，所述原料磷脂和所述油脂的加入總量與所述吸水劑的重量比為10：1～50：1，優(yōu)選為15：1～40：1。例如以重量比計(jì)，所述原料磷脂和所述油脂的加入總量與所述吸水劑的重量比為16：1、17：1、22：1、30：1。
所述吸水劑選自分子篩或高分子吸水樹(shù)脂中的至少一種。所述分子篩例如為3A分子篩。所述高分子吸水樹(shù)脂選自丙烯酰胺-丙烯酸鹽共聚交聯(lián)物和淀粉接枝丙烯酸鹽共聚交聯(lián)物中的至少一種。
在本發(fā)明中，所述原料磷脂的磷脂酰膽堿含量為15～60重量％，例如為16重量％、18重量％、22重量％、60重量％。
反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)常規(guī)方法過(guò)濾除去固定化酶，加入溶劑（例如丙酮等）進(jìn)行洗滌，然后通過(guò)離心處理（例如在8000～10000r/min下）。
通過(guò)上述本發(fā)明的含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的磷脂的制備方法制備，可以制備含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的磷脂。
通過(guò)上述本發(fā)明的含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的磷脂的制備方法制備的含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的磷脂，其磷脂酰膽堿含量為70～85重量％，例如為70重量％、72重量％、73重量％、74重量％、78重量％、81重量％、82重量％、85重量％。
通過(guò)上述本發(fā)明的含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的磷脂的制備方法制備的含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的磷脂，其脂肪酸組成中，多不飽和脂肪酸含量為20～80重量％，優(yōu)選為30～60重量%，例如為24.7重量％、30重量％、38重量％、41.5重量％、44.7重量％、45.9重量％、63.3重量％、76.3重量％。由于本發(fā)明中的原料磷脂不含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸，因此本發(fā)明的含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的磷脂的多不飽和脂肪酸含量也可以看作是多不飽和脂肪酸含量提高率。
本發(fā)明通過(guò)上述本發(fā)明的含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的磷脂的制備方法制備的含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的磷脂，其脂肪酸組成中，DPA為12.9重量％、DHA為38.7重量％；EPA為5.5重量％、DHA為21.6重量％；EPA為3.8重量％、DHA為27.3重量％；ARA為40.2重量％；EPA為28.6重量％、DHA為32.4重量％；DPA為8.9重量％、DHA為20.7重量％；EPA為8.6重量％、DHA為30.2重量％；EPA為2.7重量％、DHA為25.2重量％；或EPA為7.6重量％、DHA為12.4重量％。
含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的磷脂
本發(fā)明的含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的磷脂，其磷脂酰膽堿含量為70～85重量％，例如為70重量％、72重量％、73重量％、74重量％、78重量％、81重量％、82重量％、85重量％。
本發(fā)明的含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的磷脂，其脂肪酸組成中，多不飽和脂肪酸含量為15～60重量％，優(yōu)選為25～52重量%，例如為20重量％、27.1重量％、27.9重量％、29.6重量％、31.1重量％、38.8重量％、40.2重量％、51.6重量％、61重量％。由于本發(fā)明中的原料磷脂不含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸，因此本發(fā)明的含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的磷脂的多不飽和脂肪酸含量也可以看作是相對(duì)于原料磷脂，產(chǎn)物磷脂的多不飽和脂肪酸含量提高率。本發(fā)明中，所述長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸是指含有兩個(gè)以上雙鍵且碳原子數(shù)為18～22的直鏈脂肪酸，如二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）、二十二碳五烯酸（DPA）和花生四烯酸（ARA）等。
本發(fā)明的含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的磷脂，其脂肪酸組成中，DPA為12.9重量％、DHA為38.7重量％；EPA為5.5重量％、DHA為21.6重量％；EPA為3.8重量％、DHA為27.3重量％；ARA為40.2重量％；EPA為28.6重量％、DHA為32.4重量％；DPA為8.9重量％、DHA為20.7重量％；EPA為8.6重量％、DHA為30.2重量％；EPA為2.7重量％、DHA為25.2重量％；或EPA為7.6重量％、DHA為12.4重量％。
含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的磷脂酰膽堿
從本發(fā)明的含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的磷脂將磷脂酰膽堿進(jìn)行分離（分離方法參照文獻(xiàn)Reddy, J. R. C., Vijeeta, T., Karuna, M. S. L., Rao, B. V. S., & Prasad, R. B. N. (2005)，Lipase-Catalyzed Preparation of Palmitic and Stearic Acid-rich Phosphatidylcholine，Journal of the American Oil Chemists’ Society, 82(10), 727–730），分離得到磷脂酰膽堿（有時(shí)也稱(chēng)為本發(fā)明的磷脂酰膽堿或本發(fā)明的含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的磷脂酰膽堿），然后將分離得到的磷脂酰膽堿進(jìn)行預(yù)處理和脂肪酸測(cè)定，方法分別參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 17376-2008和GB/T 24894-2008。
在上述的磷脂酰膽堿的脂肪酸組成中，多不飽和脂肪酸含量為20～80重量％，優(yōu)選為30～60重量%，例如為24.7重量％、30重量％、38重量％、41.5重量％、44.7重量％、45.9重量％、63.3重量％、76.3重量％。由于本發(fā)明中的原料磷脂不含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸，因此本發(fā)明的磷脂酰膽堿的多不飽和脂肪酸含量也可以看作是相對(duì)于原料磷脂，分離得到的磷脂酰膽堿的多不飽和脂肪酸含量提高率。
本發(fā)明的含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的磷脂酰膽堿，其脂肪酸組成中，DPA為18.1重量％、DHA為45.2重量％；EPA為7.4重量％、DHA為30.6重量％；EPA為9.1重量％、DHA為35.6重量％；ARA為57.1重量％；EPA為36.2重量％、DHA為40.1重量％；DPA為12.8重量％、DHA為28.7重量％；EPA為10.3重量％、DHA為35.6重量％；EPA為3.2重量％、DHA為26.8重量％；或EPA為8.9重量％、DHA為15.8重量％。
本發(fā)明提到的上述特征，或?qū)嵤├岬降奶卣骺梢匀我饨M合。本案說(shuō)明書(shū)所揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說(shuō)明書(shū)中所揭示的各個(gè)特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說(shuō)明，所揭示的特征僅為均等或相似特征的一般性例子。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則所有的百分?jǐn)?shù)、比率、比例、或份數(shù)按重量計(jì)。
本發(fā)明中的重量體積百分比中的單位是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶質(zhì)的重量。
除非另行定義，文中所使用的所有專(zhuān)業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。
實(shí)施例
下述實(shí)施例中使用的磷脂酶A1、磷脂酶A2、脂肪酶TLL、脂肪酶Candida cylindracea、脂肪酶pseudononas sp.、脂肪酶Rhizopus oryzae分別為商品化的Lecitase? Ultra，Lecitase 10L、Lipozyme? TL 100L、 Lipase AY“Amano” 30、Lipase from Pseudononas sp.、Lipase F-AP 15。
下述實(shí)施例中使用的固定化脂肪酶Novozyme 435購(gòu)自Novozymes公司，固定化磷脂酶A1和固定化磷脂酶A2是以現(xiàn)有公開(kāi)專(zhuān)利方法得到，如CN201310307403.6以及文獻(xiàn)Vikbjerg，Huiling Mu，Xuebing Xu，Synthesis of structured phospholipids by immobilized phospholipase A2 catalyzed acidolysis，Journal of Biotechnology， 2007，128：545～554等。
下述實(shí)施例中，使用的原料來(lái)源如下：大豆粉末磷脂和蛋黃磷脂購(gòu)自北京美亞斯磷脂技術(shù)有限公司；DHA藻油和ARA油脂購(gòu)自廈門(mén)匯盛生物有限公司；金槍魚(yú)油、鯡魚(yú)油和沙丁魚(yú)油購(gòu)自Norsk Hydro A/S。
磷脂酰膽堿（PC）含量的測(cè)定方法是按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 21493-2008中的方法測(cè)定的；磷脂脂肪酸組成的測(cè)定方法是按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 24894-2008中的方法測(cè)定的，其中預(yù)處理方法是按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 17376-2008的方法進(jìn)行的；PC脂肪酸組成測(cè)定首先將PC從產(chǎn)物中分離出來(lái)，分離方法參照文獻(xiàn)Reddy, J. R. C., Vijeeta, T., Karuna, M. S. L., Rao, B. V. S., & Prasad, R. B. N. (2005)，Lipase-Catalyzed Preparation of Palmitic and Stearic Acid-rich Phosphatidylcholine，Journal of the American Oil Chemists’ Society, 82(10), 727–730，然后進(jìn)行預(yù)處理和脂肪酸測(cè)定，方法分別參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 17376-2008和GB/T 24894-2008。
實(shí)施例1
稱(chēng)取15g大豆粉末磷脂（PC含量為18%）、30g DHA藻油（DHA 35%，DPA 15%）和450mL 95%乙醇于反應(yīng)瓶中，在35℃條件下攪拌均勻后，加入0.5mL磷脂酶A1和1mL脂肪酶TL L，反應(yīng)4h后，加入90g碳酰胺，待完全溶解后，將反應(yīng)瓶置于0℃環(huán)境中結(jié)晶2h，過(guò)濾分離出濾液，70℃旋蒸除去乙醇后，加入1.5g novozyme 435，抽取真空至5KPa~0.1KPa，70℃條件下反應(yīng)6h。待反應(yīng)完成后，過(guò)濾除去Novozyme 435（可回收重復(fù)利用），加入30mL丙酮洗滌3次，10000r/min離心得到丙酮不溶物。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。
表1
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比較實(shí)施例1
（1）稱(chēng)取15g大豆粉末磷脂（PC含量為18%）和150mL 95%乙醇于反應(yīng)瓶中，在35℃條件下攪拌均勻后，加入0.5mL磷脂酶A1，反應(yīng)4h后， 70℃旋蒸除去乙醇；（2）稱(chēng)取30g DHA藻油（DHA 35%，DPA 15%）和300mL 95%乙醇于反應(yīng)瓶中，加入1mL脂肪酶TL L，反應(yīng)4h后，加入90g碳酰胺，待完全溶解后，將反應(yīng)瓶置于0℃環(huán)境中結(jié)晶2h，過(guò)濾分離出濾液，70℃旋蒸除去乙醇；（3）將步驟（1）和步驟（2）所得產(chǎn)物混合后，加入1.5g novozyme 435，70℃條件下抽取真空5KPa~0.1KPa，反應(yīng)6h。待反應(yīng)完成后，過(guò)濾除去novozyme 435（可回收重復(fù)利用），加入30mL丙酮洗滌3次，10000r/min離心得到丙酮不溶物，檢測(cè)結(jié)果如下表2所示。
表2
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比較實(shí)施例2
稱(chēng)取15g大豆粉末磷脂（PC含量為18%）、30g DHA藻油（DHA 35%，DPA 15%）和450mL 95%乙醇于反應(yīng)瓶中，在35℃條件下攪拌均勻后，加入0.5mL磷脂酶A1和1mL脂肪酶TL L，反應(yīng)4h后， 70℃旋蒸除去乙醇；加入1.5g novozyme 435，抽取真空至5KPa~0.1KPa，70℃條件下反應(yīng)6h。待反應(yīng)完成后，過(guò)濾除去novozyme 435（可回收重復(fù)利用），加入30mL丙酮洗滌3次，10000r/min離心得到丙酮不溶物。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。
表3
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比較實(shí)施例3
稱(chēng)取5g大豆卵磷脂（PC含量為60%）和15g DHA濃縮液（DPA和DHA總含量為97.2%），加入2g novozyme 435，抽取真空至5KPa~0.1KPa，70℃條件下反應(yīng)6h。待反應(yīng)完成后，過(guò)濾除去novozyme 435（可回收重復(fù)利用），加入30mL丙酮洗滌3次，10000r/min離心得到丙酮不溶物。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。
表4
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實(shí)施例2
稱(chēng)取10g蛋黃磷脂（PC含量為60%）、100g金槍魚(yú)油（DHA 18.2%，EPA 4.5%）和2.2L 95%乙醇于反應(yīng)瓶中，在35℃條件下攪拌均勻后，加入1mL磷脂酶A1和1mL脂肪酶Candida cylindracea，反應(yīng)2h后，加入440g碳酰胺，待完全溶解后，將反應(yīng)瓶置于4℃環(huán)境中結(jié)晶4h，過(guò)濾分離出濾液，旋蒸除去乙醇后，加入2g的固定化磷脂酶A1和5g 3A分子篩，充氮條件下60℃反應(yīng)8h。待反應(yīng)完成后，過(guò)濾除去固定化磷脂酶A1（可回收重復(fù)利用），加入20mL丙酮洗滌3次，8000r/min離心得到丙酮不溶物。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表5。
表5
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實(shí)施例3
稱(chēng)取10g大豆粉末磷脂（PC含量為18%）、80g鯡魚(yú)油（DHA 20.1%，EPA 8.5%）和720mL 95%乙醇于反應(yīng)瓶中，在35℃條件下攪拌均勻后，加入0.8mL磷脂酶A2和1.2mL脂肪酶Pseudononas sp.，反應(yīng)4h后，加入270g碳酰胺，待完全溶解后，將反應(yīng)瓶置于0℃環(huán)境中結(jié)晶4h，過(guò)濾分離出濾液，旋蒸除去乙醇后，加入1.8g固定化磷脂酶A2和3g 高分子吸水樹(shù)脂（丙烯酰胺-丙烯酸鹽共聚交聯(lián)物），充氮條件下70℃反應(yīng)8h。待反應(yīng)完成后，過(guò)濾除去固定化磷脂酶A2（可回收重復(fù)利用），加入30mL丙酮洗滌3次，8000r/min離心得到丙酮不溶物。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表6。
表6
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實(shí)施例4
稱(chēng)取20g大豆粉末磷脂（PC含量為16%）、100g ARA油脂（ARA 40%）和2.16L 95%乙醇于反應(yīng)瓶中，在35℃條件下攪拌均勻后，加入0.5mL磷脂酶A1和1mL脂肪酶Rhizopus oryzae，反應(yīng)3h后，加入240g碳酰胺，待完全溶解后，將反應(yīng)瓶置于2℃環(huán)境中結(jié)晶3h，過(guò)濾分離出濾液，旋蒸除去乙醇后，加入2g Novozyme 435，抽取真空至5KPa~0.1KPa，80℃反應(yīng)4h。待反應(yīng)完成后，過(guò)濾除去novozyme 435（可回收重復(fù)利用），加入40mL丙酮洗滌3次，10000r/min離心得到丙酮不溶物。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表7。
表7
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實(shí)施例5
稱(chēng)取20g大豆粉末磷脂（PC含量為22%）、160g 沙丁魚(yú)油（DHA 16.8%，EPA 10.2%）和900mL 95%乙醇于反應(yīng)瓶中，在35℃條件下攪拌均勻后，加入1mL磷脂酶A1和2mL脂肪酶TL L，反應(yīng)4h后，加入480g碳酰胺，待完全溶解后，將反應(yīng)瓶置于0℃環(huán)境中結(jié)晶4h，過(guò)濾分離出濾液，旋蒸除去乙醇后，加入1.8g Novozyme 435，抽取真空至5KPa~0.1KPa ，75℃反應(yīng)4h。待反應(yīng)完成后，過(guò)濾除去novozyme 435（可回收重復(fù)利用），加入35mL丙酮洗滌3次，8000r/min離心得到丙酮不溶物。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表8。
表8
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實(shí)施例6
稱(chēng)取15g大豆粉末磷脂（PC含量為18%）、15g DHA藻油（DHA 35%，DPA 15%）和360mL 95%乙醇于反應(yīng)瓶中，在35℃條件下攪拌均勻后，加入0.1mL磷脂酶A1和0.2mL脂肪酶TL L，反應(yīng)6h后，加入30g碳酰胺，待完全溶解后，將反應(yīng)瓶置于0℃環(huán)境中結(jié)晶5h，過(guò)濾分離出濾液，70℃旋蒸除去乙醇后，加入0.45g novozyme 435，抽取真空至5KPa~0.1KPa，70℃條件下反應(yīng)8h。待反應(yīng)完成后，過(guò)濾除去novozyme 435（可回收重復(fù)利用），加入15mL丙酮洗滌3次，10000r/min離心得到丙酮不溶物。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表9。
表9
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實(shí)施例7
稱(chēng)取10g蛋黃磷脂（PC含量為60%）、150g金槍魚(yú)油（DHA 18.2%，EPA 4.5%）和4.8L 95%乙醇于反應(yīng)瓶中，在35℃條件下攪拌均勻后，加入1mL磷脂酶A1和7mL脂肪酶TLL，反應(yīng)2h后，加入960g碳酰胺，待完全溶解后，將反應(yīng)瓶置于2℃環(huán)境中結(jié)晶4h，過(guò)濾分離出濾液，旋蒸除去乙醇后，加入5.6g的固定化磷脂酶A1和10g 3A分子篩，充氮條件下60℃反應(yīng)8h。待反應(yīng)完成后，過(guò)濾除去固定化磷脂酶A1（可回收重復(fù)利用），加入30mL丙酮洗滌3次，8000r/min離心得到丙酮不溶物。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表10。
表10
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實(shí)施例8
稱(chēng)取10g大豆粉末磷脂（PC含量為18%）、40g鯡魚(yú)油（DHA 20.1%，EPA 8.5%）和2L 95%乙醇于反應(yīng)瓶中，在35℃條件下攪拌均勻后，加入0.5mL磷脂酶A2和0.75mL脂肪酶Pseudononas sp.，反應(yīng)5h后，加入175g碳酰胺，待完全溶解后，將反應(yīng)瓶置于0℃環(huán)境中結(jié)晶4h，過(guò)濾分離出濾液，旋蒸除去乙醇后，加入2g固定化磷脂酶A2和3g 高分子吸水樹(shù)脂（淀粉接枝丙烯酸鹽共聚交聯(lián)物），充氮條件下65℃反應(yīng)8h。待反應(yīng)完成后，過(guò)濾除去固定化磷脂酶A2（可回收重復(fù)利用），加入30mL丙酮洗滌3次，8000r/min離心得到丙酮不溶物。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表11。
表11
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實(shí)施例9
稱(chēng)取10g蛋黃磷脂（PC含量為60%）、40g三文魚(yú)油（DHA9.5%，EPA6.7%）和2L 95%乙醇于反應(yīng)瓶中，在35℃條件下攪拌均勻后，加入0.5mL磷脂酶A2和0.75mL脂肪酶Rhizopus oryzae，反應(yīng)3h后，加入175g碳酰胺，待完全溶解后，將反應(yīng)瓶置于0℃環(huán)境中結(jié)晶4h，過(guò)濾分離出濾液，旋蒸除去乙醇后，加入2g固定化磷脂酶A2，抽取真空至5KPa~0.1KPa，70℃條件下反應(yīng)6h。待反應(yīng)完成后，過(guò)濾除去固定化磷脂酶A2（可回收重復(fù)利用），加入30mL丙酮洗滌3次，8000r/min離心得到丙酮不溶物。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表11。
表12
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以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非用以限定本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)內(nèi)容范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)內(nèi)容是廣義地定義于申請(qǐng)的權(quán)利要求范圍中，任何他人完成的技術(shù)實(shí)體或方法，若是與申請(qǐng)的權(quán)利要求范圍所定義的完全相同，也或是一種等效的變更，均將被視為涵蓋于該權(quán)利要求范圍之中。