本發(fā)明涉及1-羥基-2-[3-(甲酰-Gly)-4-(氧乙酰-Ala)苯基]-4,4,5,5-四甲基咪唑啉,涉及它的制備方法，涉及它的抗血栓活性，涉及它的溶血栓活性，涉及它治療腦缺血大鼠的作用，因而本發(fā)明涉及它在制備抗血栓藥物,溶血栓藥物和治療缺血性中風(fēng)藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

缺血性中風(fēng)是一類較常見(jiàn)且危害嚴(yán)重的腦血管疾病，特點(diǎn)是發(fā)病率高、病死率高、致殘率高和復(fù)發(fā)率高。目前臨床治療缺血性中風(fēng)面臨沒(méi)有有效藥物的現(xiàn)實(shí)，尤其中風(fēng)面4h以上的患者非死即殘。發(fā)明對(duì)中風(fēng)面4h以上的患者有效的藥物是臨床的重要需求。發(fā)明人曾經(jīng)公開(kāi)式II的咪唑啉化合物在中風(fēng)面24h的大鼠缺血性中風(fēng)模型上，顯示優(yōu)秀療效。即連續(xù)靜脈注射6天式II的咪唑啉化合物，每天1次，首次劑量為5μmol/kg，后5次的劑量為2μmol/kg具有優(yōu)秀療效。式中aa₁和aa₂可為同時(shí)存在,aa₁存在但aa₂不存在,或同時(shí)不存在；當(dāng)aa₁和aa₂同時(shí)存在時(shí),aa₁為R(Arg),且aa₂為G(Gly),A(Ala)或Q(Gln)；當(dāng)aa₁存在但aa₂不存在時(shí),aa₁為R(Arg)；aa₃可為S(Ser),V(Val)或F(Phe)。式II的咪唑啉化合物的2-位是4-氧乙酰-Lys。而該Lys的側(cè)鏈氨基和主鏈羧基分別與RGD抗血栓四肽及ARPAK溶栓肽相連,結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜需要簡(jiǎn)化。此外,1,3-二氧咪唑啉不穩(wěn)定需要穩(wěn)定化。

發(fā)明人經(jīng)過(guò)5年實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)用1-羥基-2-(3-甲?；?4-氧乙?；交?-4,4,5,5-四甲基咪唑啉代替II式的2-(4-氧乙?；交?-1,3-二氧-4,4,5,5-四甲基咪唑啉,用Ala和Gly代替II式的長(zhǎng)肽基可以獲得結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,穩(wěn)定性高和療效好的三重意想不到的技術(shù)效果。按照這個(gè)發(fā)現(xiàn)，發(fā)明人提出了本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

1.本發(fā)明的內(nèi)容之一是提供下式的1-羥基-2-[3-(甲酰-Gly)-4-(氧乙酰-Ala)苯基]-4,4,5,5-四甲基咪唑啉

2.本發(fā)明的內(nèi)容之二是提供1-羥基-2-[3-(甲酰-Gly)-4-(氧乙酰-Ala)苯基]-4,4,5,5-四甲基咪唑啉的制備方法,該方法由以下方法構(gòu)成:

(1)制備2,3-二甲基-2,3-二硝基丁烷；

(2)制備2,3-二甲基-2,3-二羥胺基丁烷；

(3)制備2-(3-羧基-4-羥基苯基)-1,3-二羥基-4,4,5,5-四甲基咪唑；

(4)制備2-(3-羧基-4-羥基苯基)-1,3-二氧-4,4,5,5-四甲基咪唑啉；

(5)制備2-[3-(甲酰-Gly-OtBu)-4-羥基苯基]-1,3-二氧-4,4,5,5-四甲基咪唑啉；

(6)制備2-[3-(甲酰-Gly-OtBu)-4-(乙氧羰基甲氧基)苯基]-1,3-二氧-4,4,5,5-四甲基咪唑啉；

(7)制備2-[3-(甲酰-Gly-OtBu)-4-(羧甲氧基)苯基]-1,3-二氧-4,4,5,5-四甲基咪唑啉；

(8)制備2-[3-(甲酰-Gly-OtBu)-4-(氧乙酰-Ala-OtBu)苯基]-4,4,5,5-四甲基-1,3-二氧咪唑啉；

(9)制備1-羥基-2-[3-(甲酰-Gly)-4-(氧乙酰-Ala)苯基]-4,4,5,5-四甲基咪唑啉。

3.本發(fā)明的內(nèi)容之三是評(píng)價(jià)1-羥基-2-[3-(甲酰-Gly)-4-(氧乙酰-Ala)苯基]-4,4,5,5-四甲基咪唑啉的抗血栓活性。

4.本發(fā)明的內(nèi)容之四是評(píng)價(jià)1-羥基-2-[3-(甲酰-Gly)-4-(氧乙酰-Ala)苯基]-4,4,5,5-四甲基咪唑啉的溶血栓活性。

5.本發(fā)明的內(nèi)容之五是評(píng)價(jià)1-羥基-2-[3-(甲酰-Gly)-4-(氧乙酰-Ala)苯基]-4,4,5,5-四甲基咪唑啉在腦缺血24h后治療腦缺血的活性。

附圖說(shuō)明

圖1 1-羥基-2-[3-(甲酰-Gly)-4-(氧乙酰-Ala)苯基]-4,4,5,5-四甲基咪唑啉的合成路線i)Br₂,6N NaOH；ii)Zn,NH₄Cl,50％乙醇；iii)5-甲酰水楊酸,CH₃OH；iv)PbO₂,CH₃OH；v)DCC/HOBt,HCl·Ala-OtBu；vi)Br₂CO₂C₂H₅,NaH,THF；vii)2N NaOH,CH₃OH；viii)DCC/HOBt,Arg(NO₂)Gly-Asp(OBzl)-AA-OBz；ix)TFA/TFMSA,NaNO₂。

具體實(shí)施方式

為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明，下面給出一系列實(shí)施例。這些實(shí)施例完全是例證性的，它們僅用來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，不應(yīng)當(dāng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1制備2,3-二甲基-2,3-二硝基丁烷

冰浴和攪拌下往69.0g(0.78mol,70mL)2-硝基丙烷中依次加130mL 6N NaOH溶液,20mL(0.38mol,緩慢滴加,1小時(shí)內(nèi)滴加完)Br₂和240mL乙醇。反應(yīng)化合物90℃回流3小時(shí),期間出現(xiàn)片狀沉淀。將反應(yīng)液趁熱倒入800mL冰水中,濾得49.0g(73％)標(biāo)題化合物,為無(wú)色片狀結(jié)晶。ESI-MS(m/e):177[M+H]⁺。

實(shí)施例2制備2,3-二甲基-2,3-二羥胺基丁烷

將7.00g(40mmol)2,3-二甲基-2,3-二硝基丁烷與4.00g NH₄Cl溶解于80mL 50％的乙醇水溶液中，冰浴下攪拌，3小時(shí)之內(nèi)分批加入16.00g鋅粉。鋅粉加完后，反應(yīng)混合物室溫?cái)嚢?h，抽濾，濾餅用50％的乙醇水溶液反復(fù)洗。合并濾液與洗滌液，用濃鹽酸調(diào)pH為2,減壓濃縮得泥漿狀物。將泥漿狀物用少量50％的乙醇水溶液溶解，加適量碳酸鉀，拌勻之后裝入索式提取器，用二氯甲烷作提取劑，60℃提取6h，提取液減壓濃縮，殘留物用石油醚研磨得到2.07g(35％)標(biāo)題化合物，為無(wú)色粉末。ESI-MS(m/e):149[M+H]⁺。

實(shí)施例3制備2-(3-羧基-4-羥基苯基)-1,3-二羥基-4,4,5,5-四甲基咪唑

室溫下將1.48g(10mmol)2,3-二甲基-2,3-二羥胺基丁烷用少量甲醇溶解，加入2.0g(12mmol)3-羧基-4-羥基苯甲醛，反應(yīng)12小時(shí)，過(guò)濾得到2.07g(70％)標(biāo)題化合物，為無(wú)色粉末。ESI-MS(m/e):298[M+H]⁺。

實(shí)施例4制備2-(3-羧基-4-羥基苯基)-1,3-二氧-4,4,5,5-四甲基基咪唑啉

將1.00g(3.38mmol)2-(3-羧基-4-羥基苯基)-1,3-二羥基-4,4,5,5-四甲基咪唑用100mL甲醇溶解之后，用1N NaOH調(diào)節(jié)pH至7，加入6.77g PbO₂。TLC顯示反應(yīng)結(jié)束之后，濾除去PbO₂，濾液用1N HCl調(diào)節(jié)pH至7，減壓濃縮。殘留物用少量丙酮溶解，過(guò)濾除鹽，得到693mg(70％)標(biāo)題化合物，為藍(lán)色粉末。ESI-MS(m/e):292[M-H]^-。

實(shí)施例5制備2-[3-(甲酰-Gly-OtBu)-4-羥基苯基]-1,3-二氧-4,4,5,5-四甲基咪唑啉

將300mg(1mmol)2-(3-羧基-4-羥基苯基)-1,3-二氧-4,4,5,5-四甲基基咪唑啉溶于20mL無(wú)水THF中，冰浴下加入135mg(1mmol)HOBt和268mg(1.2mmol)DCC，活化30min之后加入174mg(1.2mmol)HCl·Gly-OtBu,反應(yīng)液用NMM調(diào)pH至9，室溫?cái)嚢?h。結(jié)束反應(yīng)，濾除DCU，減壓濃縮，殘留物用柱層析(氯仿/甲醇,10/1)純化，得到204mg(68％)標(biāo)題化合物，為藍(lán)色粉末。ESI-MS(m/e):406[M+H]⁺。

實(shí)施例6制備2-[3-(甲酰-Gly-OtBu)-4-(氧乙酸乙酯)苯基]-1,3-二氧-4,4,5,5-四甲基咪唑啉

將406mg(1mmol)2-[3-(甲酰-Gly-OtBu)-4-羥基苯基]-1,3-二氧-4,4,5,5-四甲基咪唑啉溶于20mL無(wú)水THF。往溶液中加72mg(3mmol)NaH和0.5mL(3mmol)BrCH₂CO₂C₂H₅,60℃反應(yīng)5h，TLC檢測(cè)反應(yīng)顯示原料點(diǎn)消失。過(guò)濾，濾液減壓濃縮，殘留物經(jīng)干柱柱層析純化(氯仿/甲醇,10/1),得到410mg(83％)標(biāo)題化合物，為藍(lán)色粉末。ESI-MS(m/e):493[M-H]^-。

實(shí)施例7制備2-[3-(甲酰-Gly-OtBu)-4-(氧乙酸)苯基]-1,3-二氧-4,4,5,5-四甲基咪唑啉

將492mg(1mmol)2-[3-(甲酰-Gly-OtBu)-4-(氧基乙酸乙酯)苯基]-1,3-二氧-4,4,5,5-四甲基咪唑啉溶于30mL甲醇，冰浴下用2N NaOH調(diào)反應(yīng)液pH至12，反應(yīng)2h，TLC(氯仿/甲醇,10/1)顯示原料點(diǎn)消失。反應(yīng)液減濃縮，加入2mL飽和NaCl溶液，用1N鹽酸調(diào)pH至3?；旌先芤河靡宜嵋阴ポ腿?次，合并的乙酸乙酯相用無(wú)水硫酸鈉干燥12h，過(guò)濾，濾液減壓濃縮,得420mg(90％)標(biāo)題化合物，為藍(lán)色粉末。EI-MS(m/z):463[M-H]^-。

實(shí)施例8制備2-[3-(甲酰-Gly-OtBu)-4-(氧乙酰-Ala-OtBu)苯基]-4,4,5,5-四甲基-1,3-二氧咪唑啉

將464mg(1mmol)2-[3-(甲酰-Gly-OtBu)-4-(氧乙酸)苯基]-1,3-二氧-4,4,5,5-四甲基咪唑啉溶于20mL無(wú)水THF中，冰浴下加入135mg(1mmol)HOBt和268mg(1.2mmol)DCC，活化30min之后加入180mg(1.2mmol)HCl·Ala-OtBu,反應(yīng)液用NMM調(diào)pH至9，室溫?cái)嚢?h。結(jié)束反應(yīng)，濾除DCU，減壓濃縮，殘留物用柱層析(石油醚/乙酸乙酯,1/1)純化，得到450mg(76％)標(biāo)題化合物，為藍(lán)色粉末。ESI-MS(m/e):592[M+H]⁺。

實(shí)施例9制備1-羥基-2-[3-(甲酰-Gly)-4-(氧乙酰-Ala)苯基]-4,4,5,5-四甲基咪唑啉(7)

冰浴下將50mg(85μmol)2-[3-(甲酰-Gly-OtBu)-4-(氧乙酰-Ala-OtBu)苯基]-1,3-二氧-4,4,5,5-四甲基咪唑啉與1mL TFA及0.3mL TFMSA混合,攪拌15min，反應(yīng)混合物用無(wú)水乙醚稀釋，靜置，傾倒上清液，殘留物再用無(wú)水乙醚稀釋，將殘留物抽干，用5mL蒸餾水溶解，加入50mg NaNO₂，反應(yīng)液顏色有藍(lán)色逐漸變?yōu)闊o(wú)色(30min)，將溶液的pH調(diào)至7，用Sephadex G10除鹽，凍干，得20mg白色固體粉末.ESI-MS(m/e):465[M+H]⁺；FT-MS:465.19712。

實(shí)驗(yàn)例1評(píng)價(jià)化合物7的抗血栓活性

將雄性SD大鼠(200±20g)，隨機(jī)分組，每組10只，飼養(yǎng)1天，停止喂食過(guò)夜。灌胃給予化合物7的生理鹽水溶液(劑量為100nmol/kg)或阿司匹林的生理鹽水溶液(劑量為167μmol/kg)或生理鹽水(劑量為10mL/kg)30min之后，大鼠用20％烏來(lái)糖的生理鹽水溶液麻醉，之后手術(shù)。分離大鼠的右頸動(dòng)脈和左頸靜脈，將準(zhǔn)確稱重的絲線置于旁路插管， 管的一端插入左靜脈，另一端管插入右側(cè)動(dòng)脈并注射0.2mL肝素鈉抗凝。使得血流從右側(cè)動(dòng)脈流經(jīng)旁路插管進(jìn)入左側(cè)靜脈，15min之后取出附有血栓的絲線稱量，計(jì)算血液循環(huán)前后絲線的重量，得到的血栓重,以均值±SD mg表示并代表抗血栓活性，作t檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)列入表1。結(jié)果表明口服1nmol/kg化合物7能有效地抑制血栓形成。說(shuō)明本發(fā)明獲得了意想不到的技術(shù)效果。

表1 100nmol/kg化合物7的抗血栓活性

n＝10；a)與生理鹽水相比p<0.01。

實(shí)驗(yàn)例2評(píng)價(jià)化合物7的溶血栓活性

SD大鼠(雄性，200±20g)按1200mg/kg的劑量腹腔注射烏拉坦生理鹽水溶液進(jìn)行麻醉。麻醉大鼠后將其仰臥位固定，分離其右頸總動(dòng)脈，近心端處夾住動(dòng)脈夾，將近心端及遠(yuǎn)心端分別穿入手術(shù)線，遠(yuǎn)心端的手術(shù)線結(jié)扎，遠(yuǎn)心端插管，將動(dòng)脈夾松開(kāi)，取出約1mL動(dòng)脈血，置于1mL離心管中。往垂直固定的橡膠管(長(zhǎng)15mm，內(nèi)徑2.5mm，外徑5.0mm，管底用膠塞密封，para膜封緊)內(nèi)注入0.1mL大鼠動(dòng)脈血，隨后在管內(nèi)迅速插入一支不銹鋼材質(zhì)的血栓的固定螺栓(血栓固定螺旋用直徑為0.2mm的不銹鋼絲繞成，螺旋部分長(zhǎng)10mm，內(nèi)含15個(gè)螺圈，螺圈的直徑為1.0mm托柄與螺旋相連，長(zhǎng)約7.0mm，呈問(wèn)號(hào)型)。血液凝固45min后，從玻璃管中小心取出被血栓包裹的血栓固定螺旋，精確稱其重量。

旁路插管由三部分構(gòu)成，中間段為長(zhǎng)60.0mm，內(nèi)徑3.5mm的聚乙烯膠管；兩端均為長(zhǎng)100.0mm，內(nèi)徑1.0mm，外徑2.0mm的相同的聚乙烯管，該管一端拉成尖管，長(zhǎng)約10.0mm(用于插入大鼠頸動(dòng)脈及靜脈)，外徑為1.0mm，其另一端的外部套一段長(zhǎng)為7.0mm，外徑為3.5mm的聚乙烯管(用于插入中段的聚乙烯膠管內(nèi))，3段管的內(nèi)壁均需要硅烷化(1％的硅油乙醚溶液)。將血栓包裹的血栓固定螺旋置于中段聚乙烯膠管內(nèi)，膠管的另外兩端分別與兩根聚乙烯的加粗端相套，保證在循環(huán)的過(guò)程中不會(huì)漏血。用注射器通過(guò)尖管端將管中注滿肝素生理鹽水溶液(50IU/kg)，排除氣泡，備用。

分離大鼠的左頸外靜脈，近心端和遠(yuǎn)心端分別穿入手術(shù)線，結(jié)扎遠(yuǎn)心端的血管，在暴露的左頸外靜脈上剪一小口，將上述制備好的旁路管道尖管由小口插入左頸外靜脈開(kāi)口 處，同時(shí)遠(yuǎn)離旁路管中段(含精確稱量的血栓固定螺旋)內(nèi)血栓固定螺旋。用注射器通過(guò)另一端的尖管注入準(zhǔn)確量的肝素鈉的生理鹽水溶液(50IU/kg)，此時(shí)注射器不要撤離聚乙烯管，用動(dòng)脈夾夾住注射器與聚乙烯管之間的軟管。在右頸總動(dòng)脈的近心端用動(dòng)脈夾止血，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，在離動(dòng)脈夾不遠(yuǎn)處將右頸總動(dòng)脈剪一小口，從聚乙烯管的尖部拔出注射器，將聚乙烯管的尖部插入動(dòng)脈斜口的近心端。旁路管道的兩端均用4號(hào)手術(shù)縫線將動(dòng)靜脈固定。

用頭皮針將生理鹽水(3mL/kg)或尿激酶的生理鹽水溶液(劑量為20000IU/kg)或化合物7的生理鹽水溶液(劑量為100nmol/kg)通過(guò)旁路管的中段(含精確稱量的血栓固定螺旋)，扎入遠(yuǎn)離血栓固定螺旋的近靜脈端，松開(kāi)動(dòng)脈夾，使血流通過(guò)旁路管道從動(dòng)脈流向靜脈。將注射器中的溶液緩慢注入血液，通過(guò)血液循環(huán)，按靜脈-心臟-動(dòng)脈的順序作用于螺旋的血栓上。血液循環(huán)1h之后，從旁路管道中取出固定血栓的螺旋，精確稱量。計(jì)算每只大鼠旁路管道中固定血栓的螺旋血液循環(huán)前后血栓的重量差，以均值±SD mg表示并代表溶血栓活性，作t檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)列入表2。結(jié)果表明100nmol/kg化合物7能有效地溶解形成的血栓。說(shuō)明本發(fā)明獲得了意想不到的技術(shù)效果。

表2 1nmol/kg化合物7的溶血栓活性

n＝10；a)與生理鹽水比p<0.01,與尿激酶相比p>0.05。

實(shí)驗(yàn)例3評(píng)價(jià)化合物7對(duì)缺血性中風(fēng)大鼠的治療作用

在雄性SD大鼠(體重300±20g)的頸部正中部豎直開(kāi)約2cm長(zhǎng)切口,沿胸鎖乳突肌內(nèi)側(cè)緣分離出右頸總動(dòng)脈,頸外動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈。用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾分別夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈開(kāi)口處和頸總動(dòng)脈近心端,結(jié)扎頸外動(dòng)脈的遠(yuǎn)心端,在頸外動(dòng)脈剪1小口,松開(kāi)頸總動(dòng)脈近心端的動(dòng)脈夾,取10μL血,之后再用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉頸總動(dòng)脈的近心端。將取得的10μL血放置在1mL EP管中常溫放置30分鐘使血液凝固,然后轉(zhuǎn)移至-20℃冰箱中放置1小時(shí),使血液凝塊結(jié)實(shí)。大鼠用10％水合氯醛腹腔注射麻醉,劑量為400mg/kg。取出血液凝塊,加入1mL生理鹽水,用鋼鏟把血液凝塊搗成大小均一的細(xì)小血栓塊,制備細(xì)小血栓的懸液并轉(zhuǎn)移至1mL注射器內(nèi)。松開(kāi)頸總動(dòng)脈近心端的動(dòng)脈夾，將1mL血栓混懸液緩慢從大鼠頸外動(dòng)脈向近心端經(jīng)過(guò)頸內(nèi)動(dòng)脈注入大鼠的大腦,然后結(jié)扎頸外動(dòng)脈近心端,打開(kāi)頸內(nèi)動(dòng)脈和頸總 動(dòng)脈處得動(dòng)脈夾,恢復(fù)血流。等待蘇醒。大鼠蘇醒24小時(shí)后按Zealonga方法評(píng)定神經(jīng)功能缺損程度。0分表示無(wú)任何神經(jīng)功能缺失體征,1分表示未損傷側(cè)前肢不能伸展,2分表示向未損傷側(cè)行走,3分表示向未損傷側(cè)轉(zhuǎn)圈成追尾狀行走,4分表示意識(shí)障礙無(wú)自主行走,5分表示死亡。按照得分平均分組。各組大鼠經(jīng)尾靜脈每天注射1次化合物7劑量為100nmol/kg。連續(xù)注射6天，每天評(píng)分。結(jié)果列入表3。表3的數(shù)據(jù)表明,化合物7連續(xù)治療6天可使6只腦缺血24小時(shí)的大鼠神經(jīng)生物學(xué)評(píng)分為0分，可使7只腦缺血24小時(shí)的大鼠神經(jīng)生物學(xué)評(píng)分為神經(jīng)生物學(xué)評(píng)分為1分。因?yàn)椴幌褚呀?jīng)公開(kāi)的化合物首次劑量需要5μmol/kg,后5次維持劑量需要2μmol/kg,化合物7的6次劑量均為100nmol/kg。這樣一來(lái),首次劑量和維持劑量分別降低了50倍和20倍。

表3 化合物7連續(xù)治療6天對(duì)腦缺血24小時(shí)大鼠神經(jīng)生物學(xué)評(píng)分的影響

n＝13,目標(biāo)化合物劑量＝100nmol/kg,鼠尾靜脈注射給藥。